Четвертая Директива Комиссии 73/46/EEC от 5 декабря 1972 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

ЧЕТВЕРТАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ от 5 декабря 1972 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов (73/46/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества;

Принимая во внимание Директиву Совета от 20 июля 1970 г. (1) о введении методов Сообщества по отбору проб и анализу для официального контроля кормов, с поправками, внесенными Директивой № 72/275/EEC от 20 июля 1972 г. (2 ), и в частности его статью 2;

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с положениями, установленными законом, Регламентом или административными действиями, касающимися качества и состава кормов. ;

Принимая во внимание, что Директивы № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г. (3), № 71/393/EEC от 18 ноября 1971 г. (4) и № 72/199/EEC от 27 апреля 1972 г. (5) уже установили количество методов анализа Сообщества; тогда как ход работы с тех пор делает целесообразным принять четвертый набор методов;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют заключению Комитета по управлению кормами;

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания влаги в животных и растительных жирах и маслах, а также содержания магния и сырой клетчатки в кормах проводились в соответствии с методами, описанными в Приложении I к настоящей Директиве.

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., должны применяться к методам, описанным в Приложении I к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов на содержание в них ретинола (витамина А), тиамина (анейрина, витамина В1), аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот (витамина С) проводились в соответствии с методами, описанными в Приложение II к настоящей Директиве.

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., за исключением части, касающейся подготовки пробы для анализа, должны быть соблюдены. применимо к методам, описанным в Приложении II к настоящей Директиве.

Статья 3

Государства-члены должны не позднее 1 января 1974 г. ввести в действие законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно уведомить об этом Комиссию.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 5 декабря 1972 г.

Для Комиссии

Президент

С.Л. МЭНСХОЛТ (1) OJ № L 170, 3 августа 1970 г., стр. 1970. 2. (2) ОЖ № L 171, 29 июля 1972 г., с. 39. (3) ОЖ № L 155, 12 июля 1971 г., с. 13. (4) ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7. (5) ОЖ № L 123, 29 мая 1972 г., с. 6.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАГИ В ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЖИРАХ И МАСЛАХ

1. Цель и сфера применения

Данный метод позволяет определять содержание воды и летучих веществ в животных и растительных жирах и маслах.

2. Принцип

Образец высушивают до постоянного веса при температуре 103 ºC. Потеря массы определяется взвешиванием.

3. Аппаратура 3.1. Посуда с плоским дном из коррозионностойкого материала диаметром 8–9 см и высотой примерно 3 см.

4. Процедура

Отвешивают с точностью до мг примерно 20 г гомогенизированной пробы в сухую взвешенную чашку (3.1), содержащую термометр (3.2). Нагрейте на песочной бане или электроплитке (3.3), постоянно помешивая термометром, так, чтобы температура достигла 90 ºC примерно за 7 минут.

Уменьшите огонь, наблюдая за частотой подъема пузырьков со дна посуды. Температура не должна превышать 105 ºC. Продолжайте помешивать, соскребая дно посуды, пока пузырьки не перестанут образовываться.

Чтобы обеспечить полное удаление влаги, несколько раз повторно нагрейте до 103 ºC ± 2 ºC, охлаждая до 93 ºC между последовательными нагреваниями. Затем оставляют остывать до комнатной температуры в эксикаторе (3.4) и взвешивают. Эту операцию повторяют до тех пор, пока потеря массы между двумя последовательными взвешиваниями не превысит 2 мг.

Увеличение массы пробы после повторного нагревания свидетельствует об окислении жира, в этом случае результат рассчитывают по взвешиванию, проведенному непосредственно перед тем, как масса начала увеличиваться.

5. Подсчет результатов

Содержание влаги в процентах от образца определяется по следующей формуле: >PIC FILE="T0006028">

где:

M0 = масса испытуемого образца в граммах;

M1 = масса, в граммах, посуды с ее содержимым до нагревания;

M2 = масса блюда с его содержимым после нагревания в граммах.

Результаты ниже 0,05 % должны быть записаны как «ниже 0,705 %».

Повторяемость

Разница во влажности между результатами двух параллельных определений, проведенных на одном и том же образце, не должна превышать 0,705 % по абсолютной величине.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАГНИЯ - методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии -

1. Цель и сфера применения

Данный метод позволяет определить количество магния в кормах. Это особенно подходит для определения содержания магния ниже 5%.

2. Принцип

Пробу озоливают и растворяют в разбавленной соляной кислоте. Если он не содержит органических веществ, его растворяют непосредственно в разбавленной соляной кислоте. Раствор разбавляют и определяют содержание магния атомно-абсорбционной спектрофотометрией при 285-72 нм по сравнению со стандартными растворами.

3. Реагенты 3.1. Соляная кислота а.п. д : 1 716.

4. Аппаратура 4.1. Платиновые, кварцевые или фарфоровые тигли для озоления.

5. Процедура 5.1. Приготовление раствора пробы 5.1.1. Корма, состоящие исключительно из минеральных веществ

Отвесьте с точностью до мг 5 г образца в градуированную колбу емкостью 500 мл с 250–300 мл воды. Добавляют 40 мл соляной кислоты (3.1), доводят до кипения и держат жидкость при слабом кипении 30 мин. Дать остыть, довести объем водой, перемешать и профильтровать в сухой стакан через сухой складчатый фильтр. Отбросьте первые 30 мл фильтрата. При наличии кремнезема 5 г образца обрабатывают достаточным количеством (15-30 мл) соляной кислоты (3.2), выпаривают досуха на водяной бане и переносят в печь при температуре 105 °С на один час. Исходите из третьего предложения 5.1.2.

Отвешивают с точностью до мг 5 г образца в тигель и озоливают при 550 °С в муфельной печи до получения золы, свободной от углеродистых частиц, и оставляют охлаждаться. Для удаления кремнезема к золе добавляют достаточное количество (15-30 мл) соляной кислоты (3.2), выпаривают досуха на водяной бане и переносят в духовку при температуре 105 °С на один час. Остаток обрабатывают 10 мл соляной кислоты (3.1) и переносят в градуированную колбу вместимостью 500 мл с теплой водой. Дать остыть и довести объем водой. Перемешать и профильтровать в сухой стакан через сухой складчатый фильтр. Отбросьте первые 30 мл фильтрата.

Отвешивают с точностью до мг 5 г образца в тигель и озоливают при 550 °С в муфельной печи до получения золы, свободной от углеродистых частиц. Золу обрабатывают 5 мл соляной кислоты (3.2), выпаривают досуха на водяной бане и затем сушат в течение часа в печи при температуре 105°С, чтобы сделать кремнезем нерастворимым. Золу обрабатывают 5 мл соляной кислоты (3.1), переносят в градуированную колбу вместимостью 250 мл с теплой водой, доводят до кипения, дают остыть и доводят объем водой. Перемешать и профильтровать в сухой стакан через сухой складчатый фильтр. Отбросьте первые 30 мл фильтрата.

Разбавляя стандартный раствор (3.5) водой, готовят не менее 5 эталонных растворов возрастающей концентрации, соответствующих оптимальному диапазону измерения спектрофотометра. К каждому раствору добавляют по 10 мл раствора соли стронция (3.4) и доводят объем водой до 100 мл. Разбавляют водой одну аликвотную часть фильтрата, полученного по 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3, так, чтобы получить концентрацию магния, находящуюся в пределах концентрации растворов сравнения. Концентрация соляной кислоты в этом растворе не должна превышать 0,74 н. Добавляют 10 мл раствора соли стронция (3.4) и доводят объем до 100 мл водой. Измерьте поглощение определяемого раствора и растворов сравнения при длине волны 285,2 нм.

6. Подсчет результатов

Рассчитайте количество магния в образце по отношению к эталонным растворам. Выразите результат в процентах от образца.

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 5 % в относительной величине.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЫРОЙ КОЛОНКИ

1. Цель и сфера применения

Этот метод позволяет определять в кормах количество обезжиренных органических веществ, нерастворимых в кислых и щелочных средах и условно называемых сырой клетчаткой.

2. Принцип

Образец, при необходимости обезжиренный, последовательно обрабатывают кипящими растворами серной кислоты и гидроксида калия заданных концентраций. Остаток отделяют фильтрованием в присутствии асбеста, промывают, сушат, взвешивают и озоливают при 900°С. Потеря веса в результате озоления соответствует содержанию сырой клетчатки в испытуемом образце.

3. Реагенты 3.1. Серная кислота 0,26 Н.

4. Аппаратура 4.1. Мензурки вместимостью не менее 600 мл с мерной отметкой на уровне 200 мл.

Фильтруют под вакуумом через фильтровальную пластину, покрытую проволочной сеткой (4.4) и помещенную в воронку вакуумной колбы (4.3). Соберите фильтрат и еще раз профильтруйте через тот же фильтр. Выбросьте фильтрат.

5. Процедура

Отвешивают с точностью до мг 3 г пробы и 2 г обработанного асбеста (3.2) в химический стакан (4.1), добавляют 200 мл серной кислоты (3.1) и несколько капель пеногасящей эмульсии (3.3). Быстро доведите до кипения и оставьте вариться ровно на 30 минут. Чтобы поддерживать постоянный объем, накройте стакан охлаждающим устройством, например круглодонной колбой емкостью 500 мл, в которой циркулирует холодная вода. Прекратите кипение, добавив примерно 50 мл холодной воды, и немедленно профильтруйте под вакуумом через заранее подготовленный асбестовый фильтр, как показано в 4.8.

Промойте остаток 5 порциями примерно по 100 мл очень горячей воды до получения конечного объема фильтрата 800 мл. Количественно переносят остаток в химический стакан (4.1), который предварительно снабжают фарфоровым диском (4.2) для регулирования кипения. Добавьте 200 мл раствора гидроксида калия (3.4). Быстро доведите до кипения и оставьте вариться ровно на 30 минут. Добавьте примерно 50 мл холодной воды и немедленно профильтруйте под вакуумом через свежий асбестовый фильтр, предварительно приготовленный, как показано в 4.8. Остаток промывают очень горячей водой до нейтральной реакции промывной воды (проба на лакмусовой бумаге), затем 3 раза ацетоном (3,6) (всего около 100 мл ацетона).

Остаток количественно переносят в тигель для озоления (4.5), при необходимости измельчают и сушат до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 130 °С.

Оставьте охлаждаться в эксикаторе (4.7) и быстро взвесьте.

Поместите тигель в муфельную печь (4.6) и оставьте золиться на 30 минут при температуре 900 ºC. Оставьте остывать в эксикаторе (4.7) и быстро взвесьте,

Проведите холостое испытание, применяя ту же процедуру к обработанному асбесту (3.2), но без образца. Потеря веса в результате озоления 6 г асбеста не должна превышать 10 мг.

6. Подсчет результатов

Содержание сырой клетчатки в процентах от образца определяется соотношением: >PIC FILE="T0006029">

где:

a = потеря массы после озоления в ходе определения;

b = потеря веса после озоления во время холостого испытания.

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

0,73, по абсолютной величине, для содержания сырой клетчатки менее 10 %;

3 % по относительной величине для содержания сырой клетчатки, равного или превышающего 10 %.

7. Наблюдения 7.1. Корма, содержащие более 10 % масел и жиров, перед анализом диэтиловым эфиром (3.7) должны быть обезжирены. Для этого помещают испытуемый образец (весом 3 г с точностью до мг) на асбестовый фильтр (4.8). Трижды накрывают примерно по 50 мл диэтилового эфира (3.7) и каждый раз тщательно фильтруют под вакуумом. Перенесите обезжиренный испытуемый образец и асбест количественно в химический стакан (4.1) и продолжите анализ, как показано в 5.

Для этого эту атаку отмывают от остатка 3 раза ацетоном (3.6) (всего по 100 мл), затем 3 раза по 50 мл диэтиловым эфиром (3.7). Затем остаток количественно переносят в стакан (4.1) и продолжают анализ, как указано во втором пункте пункта 5 (обработка раствором гидроксида калия).

ПРИЛОЖЕНИЕ II

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕТИНОЛА (ВИТАМИНА А)

1. 1. Цель и сфера применения

Данный метод позволяет определять количество ретинола (витамина А) в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 10 000 МЕ/кг для высокопигментированных кормов и 4 000 МЕ/кг для остальных (1). Продукты делятся на две группы в зависимости от предполагаемого содержания ретинола:

Группа А: содержание менее 200 000 МЕ/кг;

Группа B: содержание равно или превышает 200 000 МЕ/кг.

2. Принцип

Образец гидролизуют при нагревании раствором гидроксида калия в среде этанола и в присутствии антиоксиданта или в атмосфере азота. Смесь экстрагируют 1,2-дихлорэтаном. Экстракт упаривают досуха и обрабатывают петролейным эфиром. Раствор хроматографируют на колонке с оксидом алюминия (для (1)1 МЕ = 0,3 мкг ретинола.

Для продуктов группы В хроматография требуется только в определенных случаях). Для продуктов группы А ретинол определяют спектрофотометрически при 610 нм после образования окрашенного комплекса по реакции Карра-Прайса; для продуктов группы В методом спектрофотометрии в УФ при 325 нм.

3. Реагенты (а), используемые для анализа продуктов групп А и Б 3.1. 96% (по объему) этанола.

(b) используется исключительно для анализа продуктов группы А 3.14. Кристаллизующийся бензол а.п.

(c) используется исключительно для анализа продуктов группы B 3.18. Изопропанол для хроматографии.

4. Аппаратура 4.1. Водяная баня.

5. Процедура

Все операции необходимо проводить вдали от прямого света, при необходимости в оборудовании из коричневого стекла. 5.1. Тестовый образец

Из мелко измельченного образца возьмите тестовый образец, пропорциональный предполагаемому содержанию ретинола, таким образом:

0,71-1,70 г для концентратов (содержание более 20 000 МЕ/г);

3 70-5 70 г для премиксов (содержание от 400 до 20 000 МЕ/г);

10-20 г для минеральных смесей;

30 г для продуктов группы А.

Немедленно поместите испытуемый образец в колбу емкостью 500 мл с притертой пробкой.

К испытуемому образцу добавляют последовательно 40 мл этанола (3.1), 2 мл раствора аскорбата натрия (3.2) (2), 10 мл раствора гидроксида калия (3.4) и 2 мл раствора сульфида натрия (3.13).

Нагревайте в течение 30 минут при температуре 70–80 ºC под обратным холодильником, а затем дайте остыть под струей воды. Добавляют 50 мл этанола (3.1) и 100 мл 1,2-дихлорэтана (3.7) (отбирают пипеткой). Энергично встряхните, а затем слейте надосадочную жидкость в емкость для декантации. Добавьте в емкость 150 мл раствора гидроксида калия (3,5), встряхивайте 30 секунд и оставьте до разделения слоев. Собирают слой дихлорэтана (нижний слой) в декантатор, добавляют 40 мл раствора гидроксида калия (3.6), встряхивают 10 с и оставляют стоять до разделения слоев. Собрать слой дихлорэтана в декантатор и промыть 6-8 раз большим количеством воды по 40 мл до полного удаления щелочи (фенолфталеиновая проба). Соберите слой дихлорэтана и удалите последние следы воды полосками фильтровальной бумаги.

Аликвотную часть раствора выпаривают досуха под вакуумом и на водяной бане при температуре 40 ºC. Остаток быстро обработать 5 мл петролейного эфира (3.8).

Для продуктов группы А хроматографируйте, как показано в 5.3.1.

Для продуктов группы В раствор переносят в градуированную колбу вместимостью 50 мл, доводят до объема петролейным эфиром (3.8), перемешивают и измеряют оптическую плотность, как показано в 5.4.2.

Наполняют хроматографическую пробирку (4.3) до высоты 200 мм 10 г оксида алюминия (3.9), предварительно суспендированного петролейным эфиром (3.8). Поместите в пробирку раствор, полученный в 5.2, и сразу же добавьте 20 мл петролейного эфира (3.8). Элюируют последовательно порциями по 10 мл легких петролейных растворов с содержанием 4, 8, 12, 16 и 20 % диэтилового эфира (3.12) под давлением или в частичном вакууме, скорость потока составляет 2–3 капли в секунду. (1) Для молочных кормов и продуктов, склонных к агломерации или набуханию, удвойте количество реагентов, указанное в первом и втором параграфах 5.2. (2) Аскорбат натрия не требуется добавлять, если гидролиз проводится в атмосфере азота.

Первым элюируется каротин (1). Ретинол обычно элюируют легким петролейным раствором в 20% диэтиловом эфире (3.12). Элюирование проводят в УФ-свете (краткое облучение колонки ртутной лампой). Зона флуоресценции ретинола четко отделена от следующих за ней желтых зон ксантофилла. Соберите фракцию элюата, содержащую ретинол, в колбу Эрленмейера.

Хроматографию следует проводить только в том случае, если измерения оптической плотности, полученные в 5.4.2, не соответствуют требованиям, приведенным в 5.4.2.

Если окажется необходимым провести хроматографию, помещают в хроматографическую колонку аликвотную часть раствора в легком петролейном растворе, полученном в 5.2, содержащем примерно 500 МЕ ретинола, и хроматографируют, как показано в 5.3.1.

Выпаривают досуха в вакууме элюат, содержащий ретинол, полученный в 5.3.1. Остаток обрабатывают 2 мл бензола (3.14). Берут 0,3 мл этого раствора и добавляют 3 мл реактива Карра-Прайса (3.16). Развивается синяя окраска. Измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 610 нм ровно через 30 секунд после начала реакции. Определите содержание ретинола по стандартной кривой, полученной для бензольных растворов возрастающих концентраций стандарта ретинола, обработанных реагентом Карра-Прайса (от 2 до 16 МЕ стандарта ретинола (3,17) на 0,73 мл бензола (3,14) +3 мл Карра- Цена реагента (3.16)). Стандартную кривую необходимо регулярно и часто проверять с использованием стандарта и свежеприготовленного раствора реагента Карра-Прайса.

Отбирают аликвоту раствора в петролейном эфире, полученного в пункте 5.2, содержащего примерно 200 МЕ ретинола. Выпаривают досуха в вакууме и обрабатывают остаток 25 мл изопропанола (3.18). Измерьте оптическую плотность в спектрофотометре при 325, 310 и 334 нм. Максимум поглощения расположен при 325 нм. Содержание ретинола в растворе рассчитывают следующим образом:

E325 7 18 730 = МЕ ретинола/мл

Однако соотношение оптических плотностей

E310: E325 и E334: E325

должно быть 6 : 7 = 0 7857.

6. Подсчет результатов

Рассчитывают содержание ретинола в образце, учитывая массу исследуемого образца и проведенные в ходе анализа разведения. Результаты выражайте в МЕ ретинола на кг корма или на кг концентрата или премикса. (1) >PIC ФАЙЛ="T0006030">

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать: - 20 % в относительной величине при содержании ретинола менее 75 000 МЕ/кг;

- 15 000 МЕ для содержания от 75 000 до 150 000 МЕ/кг;

- 10 %, в относительном значении, для содержания от 150 000 до 250 000 МЕ/кг;

- 25 000 МЕ для содержания от 25 000 до 500 000 МЕ/кг;

- 5 %, в относительном значении, для содержания более 500 000 МЕ/кг.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИАМИНА (ВИТАМИНА В1, АНЕВРИНА)

1. Цель и сфера применения

Данный метод позволяет определять количество тиамина (аневрина, витамина В1) в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 5 ppm.

2. Принцип

Раствор обрабатывают в горячем виде разбавленной серной кислотой, а затем ферментативно гидролизуют. Полученный раствор подвергают щелочному окислению. Образовавшийся тиохром экстрагируют изобутанолом и определяют флуориметрически.

3. Реагенты 3.1. 100 мкг/мл стандартного раствора тиамина: растворите 112 73 мг гидрохлорида тиамина, предварительно высушенного под вакуумом до постоянной массы, в 1000 мл серной кислоты 0,72 Н (3.2). При хранении в темном прохладном месте раствор хранится в течение одного месяца.

4. Аппаратура 4.1. Водяная баня.

5. Процедура 5.1. Ферментативный гидролиз

Поместите в каждую из двух градуированных колб емкостью 250 мл, А и В, одинаковое количество мелкодисперсной пробы, содержащей примерно 100 мкг тиамина и 125 мл серной кислоты (3.2). Также добавьте только в колбу А 1 70 мл стандартного раствора (3.1) (внутренний стандарт).

Энергично встряхните колбы, поставьте на кипящую водяную баню и выдержите там 15 мин, периодически встряхивая. Дать остыть примерно до 45 ºC. В каждую колбу добавляют по 20 мл раствора ацетата натрия (3.8) и 0,75 г мультиферментного препарата (3.9), затем оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мл раствора ацетата натрия (3.8), доводят до объема водой, гомогенизируют и фильтруют. Соберите фильтраты A и B, отбросив первые 15 мл. Подготовьте следующие растворы: 5.1.1. Эталонный раствор Т

Поместите в центрифужную пробирку (4.2) 5 мл фильтрата А и примерно 10 мг бисульфита натрия (3.3). Погрузите пробирку в кипящую водяную баню на 15 минут, а затем дайте остыть до комнатной температуры.

Поместите 5 мл фильтрата A в центрифужную пробирку (4.2) и 5 ​​мл фильтрата B в другую центрифужную пробирку (4.2).

К растворам Т, А и Б добавляют 5 мл окислительной смеси (3.6) и через одну минуту 10 мл изобутанола (3.7). Закройте пробирки и энергично встряхивайте в течение 5 секунд. Оставьте на одну минуту и ​​центрифугируйте, чтобы разделить слои. Из каждой пробирки перенесите по 5 мл надосадочного слоя изобутанола в каждую градуированную колбу емкостью 25 мл, доведите объем этанолом (3.10) и гомогенизируйте (= экстракты Т, А и В).

Измерения проводят при длине волны, при которой флуориметр дает оптимальный отклик на флуоресценцию тиохрома. Облучайте при длине волны примерно 365 нм.

Настройте прибор на ноль, используя экстракт T. Измерьте интенсивность флуоресценции экстрактов A и B.

6. Подсчет результатов

Содержание тиамина в мг/кг образца определяется соотношением: >PIC FILE="T0006031">

где:

a = интенсивность флуоресценции экстракта А (внутренний стандарт);

b = интенсивность флуоресценции экстракта Б (образец);

c = масса испытуемого образца в г;

d = количество тиамина в мкг, добавленного к тестируемому образцу (внутренний стандарт).

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 % относительного значения для содержания менее 500 мг/кг и

5 % по относительной величине для содержания, равного или превышающего 500 мг/кг.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АСОРБИНОВОЙ И ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ВИТАМИНА С)

1. Цель и сфера применения

Данный метод позволяет определять общее количество аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот (витамина С) в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 5 ppm. Продукты делятся на две группы в зависимости от предполагаемого содержания витамина С:

Группа А: содержание менее 10 г/кг;

Группа B: содержание равно или превышает 10 г/кг.

2. Принцип

Образец суспендируют в разбавленном растворе метафосфорной кислоты и экстрагируют хлороформом. Водную фазу обрабатывают раствором 2,6-дихлорфенол-индофенола для перевода аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту, а затем раствором 2,4-динитрофенилгидразина. Образовавшийся гидразон экстрагируют смесью этилацетата, ледяной уксусной кислоты и ацетона. Раствор хроматографируют на колонке с силикагелем, элюат упаривают досуха и остаток растворяют в разбавленной серной кислоте. Оптическую плотность раствора измеряют спектрофотометром при длине волны 509 нм.

Для продуктов группы А элюат, полученный в результате хроматографии на колонке, дополнительно подвергается тонкослойной хроматографии для выделения гидразона.

3. Реагенты 3.1. Стандартный раствор 0,705% L-аскорбиновой кислоты: растворить 50 мг L-аскорбиновой кислоты а.п. примерно в 20 мл раствора метафосфорной кислоты (3.2) и доводят до 100 мл водой. Готовьте непосредственно перед использованием.

4. Аппаратура 4.1. Водяная баня оснащена термостатом, настроенным на 20 ºC.

5. Процедура 5.1. Извлечение

Поместите в каждую из двух градуированных колб емкостью 250 мл (с притертыми пробками) А и В одинаковые количества мелкодисперсной пробы, содержащей около 200 мкг витамина С. Добавьте в колбу А только 0,74 мл стандартного раствора ( 3.1) и перемешайте, осторожно встряхивая (внутренний стандарт).

Добавьте в каждую колбу по 30 мл хлороформа (3.3) и 25 мл раствора метафосфорной кислоты (3.2) при температуре 4 ºC. Кратковременно встряхните, а затем оставьте на 10–15 минут. Добавьте 25 мл воды, закройте колбы пробками, энергично встряхивайте в течение 10 с и оставьте на 10–15 мин на водяной бане (4.1). Центрифугируйте для отделения водной фазы от фазы хлороформа. Проведите операции одновременно, как описано ниже, с водными экстрактами А (внутренний стандарт) и Б.

Пипеткой переносят 40 мл надосадочного водного раствора (слегка мутного), полученного в 5.1, в реакционную пробирку, снабженную притертой пробкой, добавляют 0,75 к 1 мл раствора 2,6-дихлорфенол-индофенола (3.4 ) и перемешать. Появляется красная окраска, которая должна сохраняться не менее 15 минут. Затем добавьте примерно 300 мг фильтрующего средства (3.5), встряхните и профильтруйте через сухой складчатый фильтр. Фильтрат не обязательно должен быть прозрачным.

Пипеткой перенесите 10 мл фильтрата, полученного в 5.2, в центрифужную пробирку (4.2), добавьте 2 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина (3.6) и перемешайте. Быстро пропускают поток азота (3.7) или углекислого газа (3.8) в пробирку, закрывают пробирку пробкой и погружают ее примерно на 15 часов (на ночь) в водяную баню (4.1).

Затем добавьте 3 мл воды, 20 мл смеси этилацетат/ледяная уксусная кислота/ацетон (3.9) и примерно 800 мг средства для фильтрации (3.5). Закройте пробирку пробкой, энергично встряхивайте в течение 30 секунд и центрифугируйте. Помещают 15 мл надосадочной фазы в испарительную колбу и выпаривают при пониженном давлении в роторном испарителе (4.3) до получения маслянистого остатка. Остаток растворяют в 2 мл смеси этилацетат/ледяная уксусная кислота/ацетон (3.9) повторным нагреванием при 50°С, дают остыть, добавляют 10 мл смеси дихлорметан/ледяная уксусная кислота (3.10) и перемешивают.

Заполняют хроматографическую пробирку (4.4) до уровня 30 мм смесью дихлорметана и ледяной уксусной кислоты (3.10). Суспендируют (энергично встряхивая) 5 г силикагеля (3.11) в 30 мл смеси дихлорметана и ледяной уксусной кислоты (3.10); вылейте суспензию в пробирку. Оставьте стоять и затем спрессуйте в атмосфере азота (3.7) при низком давлении. Декантируют в пробирку раствор, полученный в 5.3, ополаскивают колбу небольшим количеством смеси дихлорметана с ледяной уксусной кислотой (3.10) и декантируют в пробирку, затем наполняют ее смесью (3.10) и приступают к промывке колонки. той же смесью (3-4 порции примерно по 5 мл) до получения бесцветного элюата. Отбросьте часть элюата, окрашенную в желтый цвет.

Элюируйте красноватую зону в верхней части колонки смесью этилацетат/ледяная уксусная кислота/ацетон (3.9), собирайте элюат и выпаривайте досуха. 5.4.1. Для продуктов группы А (содержание витамина С менее 10 г/кг) остаток растворяют в 2,0 мл смеси этилацетат/ледяная уксусная кислота/ацетон (3.9) и немедленно хроматографируют на тонком слое, как показано в 5.5.

Выполните в двух экземплярах описанные ниже операции. Наносят тонкой линией на чашку (4.6) 0 75 мл раствора, полученного в 5.4.1. Используя элюирующий растворитель (3.14), выдерживают не менее 20 мин в резервуаре, насыщенном парами растворителя, до тех пор, пока не станет четко отделяться розовая зона гидразона. Оставить сушиться на открытом воздухе. Отмечают границу розовой зоны, соскребают ее шпателем и количественно переносят порошок в хроматографическую пробирку (4.4).

Элюируйте последовательно один раз 2 мл и дважды 175 мл смеси этилацетат/ледяная уксусная кислота/ацетон (3.9). Соберите элюат в небольшую колбу (последняя часть должна быть бесцветной). Выпаривают досуха, обрабатывают маслянистый остаток 4 70 мл разбавленной серной кислоты (3.13), энергично встряхивают до полного растворения остатка и измеряют оптическую плотность.

Измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 509 нм через 20–30 минут после растворения остатка в серной кислоте. Измерения проводят сравнением с разбавленной серной кислотой (3.13).

Проведите холостой тест, используя ту же процедуру, но без образца.

6. Подсчет результатов

Содержание витамина С в образце в г на кг определяется соотношением: >PIC FILE="T0006032">

где:

a = оптическая плотность заготовки;

b = оптическая плотность раствора внутреннего стандарта;

c = оптическая плотность раствора образца;

d = вес испытуемого образца в граммах.

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 % по относительной величине для содержания витамина С менее 10 г/кг и

5 % по относительной величине для содержания, равного или превышающего 10 г/кг.