Директива Комиссии 2006/63/EC от 14 июля 2006 г., вносящая поправки в Приложения II–VII Директивы Совета 98/57/EC о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Язык	Название
en	Commission Directive 2006/63/CE of 14 July 2006 amending Annexes II to VII to Council Directive 98/57/EC on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
ru	Директива Комиссии 2006/63/EC от 14 июля 2006 г., вносящая поправки в Приложения II–VII Директивы Совета 98/57/EC о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

27 июля 2006 г.

Официальный журнал Европейского Союза

Л 206/36

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 2006/63/CE

от 14 июля 2006 г.

внесение поправок в Приложения II–VII Директивы Совета 98/57/EC о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 98/57/EC от 20 июля 1998 г. (1) о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., и в частности ее статью 11,

Тогда как:

(1)

Одним из важных организмов, вредных для картофеля и томатов, является Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., возбудитель болезни бурой гнили картофеля и бактериального увядания картофеля и томатов (далее - организм);

(2)

Этот организм все еще встречается в некоторых частях Сообщества;

(3)

Директива 98/57/EC установила подробные меры, которые необходимо принять в государствах-членах против этого организма с целью его обнаружения и определения его распространения; предотвратить его возникновение и распространение; и, в случае обнаружения, предотвратить его распространение и контролировать его с целью искоренения;

(4)

С тех пор произошли значительные изменения в понимании биологии, процедурах обнаружения и идентификации организма; более того, практический опыт, полученный при контроле над организмом, требует пересмотра ряда технических положений, касающихся мер контроля;

(5)

В результате таких событий представляется необходимым пересмотреть и обновить меры, включенные в некоторые Приложения к Директиве 98/57/EC;

(6)

Что касается процедур обнаружения и идентификации, используется флуоресцентная гибридизация in-situ (FISH), современный метод обнаружения. Усовершенствования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также усовершенствования различных технических элементов существующей процедуры обнаружения и идентификации, а также методов обнаружения и идентификации организма в других растениях-хозяевах, кроме картофеля, а также в воде и почве, также были включены;

(7)

Что касается технических элементов мер контроля, улучшены положения по: способу сохранения протестированных образцов для обеспечения отслеживания организма, элементам, необходимым для определения степени вероятного загрязнения, деталям уведомления. о любом подтвержденном присутствии организма и соответствующей загрязненной зоны, меры, которые следует принять на производственных объектах, обозначенных как загрязненные, и в пределах демаркированных зон. Кроме того, были включены некоторые положения, касающиеся томата, чтобы в большей степени учитывать значимость этого растения как хозяина для организма;

(8)

Меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по здоровью растений.

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Приложения II–VII к Директиве 98/57/EC настоящим заменяются соответствующими текстами в Приложении к настоящей Директиве.

Статья 2

1. Государства-члены должны принять и опубликовать не позднее 31 марта 2007 года законы, постановления и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно передать Комиссии текст этих положений и таблицу корреляции между этими положениями и Директивой.

Они начнут применять эти положения с 1 апреля 2007 года.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в случае их официальной публикации. Государства-члены ЕС должны определить, как следует делать такую ссылку.

2. Государства-члены должны немедленно сообщить Комиссии текст основных положений национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на третий день после ее публикации в Официальном журнале Европейского Союза.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 14 июля 2006 г.

Для Комиссии

Маркос Киприану

Член Комиссии

(1) OJ L 235, 21 августа 1998 г., с. 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ

' ПРИЛОЖЕНИЕ II

СХЕМА ИСПЫТАНИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ОБЪЕМ СХЕМЫ ИСПЫТАНИЙ

Представленная схема описывает различные процедуры, связанные с:

(я)

Диагностика бурой гнили клубней картофеля и бактериального увядания картофеля, томата и некоторых других растений-хозяев;

(ii)

Обнаружение Ralstonia solanacearum в пробах клубней картофеля, картофеля, томатов и других растений-хозяев, воды и почвы;

(iii)

Идентификация Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

СОДЕРЖАНИЕ

Страница

Общие принципы

РАЗДЕЛ I:

Применение схемы испытаний

Схема обнаружения для диагностики бурой гнили и бактериального увядания (R. solanacearum) клубней картофеля и картофеля, томата или других растений-хозяев с симптомами бурой гнили или бактериального увядания

Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в образцах бессимптомных клубней картофеля

Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в образцах бессимптомных растений картофеля, томатов или других растений-хозяев

РАЗДЕЛ II:

Подробные методы обнаружения R. solanacearum в клубнях картофеля и картофеле, томатах или других растениях-хозяевах с симптомами бурой гнили или бактериального увядания.

Симптомы

Экспресс-скрининговые тесты

Процедура изоляции

Идентификационные тесты на R. solanacearum

РАЗДЕЛ III:

Подробные методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в образцах бессимптомных клубней картофеля

1.1.

Базовые приготовления

1.2.

Тестирование

Подробные методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в образцах бессимптомного картофеля, томата или других растений

2.1.

Базовые приготовления

2.2.

Тестирование

РАЗДЕЛ IV:

Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в воде

Методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в воде

2.1.

Базовые приготовления

2.2.

Тестирование

РАЗДЕЛ V:

Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в почве

Методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в почве

2.1.

Подготовка образцов

2.2.

Тестирование

РАЗДЕЛ VI:

Оптимизированные протоколы обнаружения и идентификации R. solanacearum

Диагностические и обнаруживающие тесты

Стриминговый тест

Обнаружение гранул поли-ß-гидроксибутирата

Серологические реакции агглютинации

Селективная изоляция

4.1.

Селективное покрытие

4.2.

Процедура обогащения

Иммунофлуоресцентный тест (IF-тест)

Тест полимеразной цепной реакции (ПЦР-тест)

6.1.

Методы очистки ДНК

(а)

Метод по Пастрику (2000).

(б)

Другие методы

6.2.

ПЦР

6.3.

Анализ продукта ПЦР

Флуоресцентный тест гибридизации in-situ (тест FISH)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

(а)

Непрямой ИФА

(б)

DASI (непрямой сэндвич с двойными антителами) ИФА

Биоанализ тест

Идентификационные тесты

Пищевые и ферментативные идентификационные тесты

ЕСЛИ тест

ИФА-тест

ПЦР-тест

РЫБНЫЙ тест

Профилирование жирных кислот (FAP)

Методы характеристики деформации

7.1.

Определение Биовара

7.2.

Геномная дактилоскопия

7.3.

ПЦР-методы

Подтверждающий тест

Приложение 1

Лаборатории, занимающиеся оптимизацией и проверкой протоколов

Приложение 2

Среды для выделения и культивирования R. solanacearum

Приложение 3

(А)

Коммерчески доступный стандартизированный контрольный материал.

(Б)

Подготовка элементов управления

Приложение 4

Буферы для тестовых процедур

Приложение 5

Определение уровня загрязнения в тестах IF и FISH

Приложение 6

Валидированные протоколы ПЦР и реагенты

Приложение 7

Валидированные реагенты для теста FISH

Приложение 8

Условия выращивания томатов и баклажанов

Рекомендации

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

OptimiseОптимизированные протоколы для различных методов, проверенные реагенты и подробные сведения о подготовке тестовых и контрольных материалов представлены в Приложениях. Список лабораторий, участвовавших в оптимизации и валидации протоколов, представлен в Приложении 1.

Поскольку протоколы предусматривают обнаружение карантинного организма и будут включать использование жизнеспособных культур R. solanacearum в качестве контрольных материалов, процедуры необходимо будет выполнять в подходящих карантинных условиях с соответствующими средствами утилизации отходов и при наличии соответствующих лицензий, как это предусмотрено в протоколах. выданные официальными органами по карантину растений.

Параметры тестирования должны обеспечивать последовательное и воспроизводимое обнаружение уровней R. solanacearum при установленных пороговых значениях выбранных методов.

Точная подготовка положительных контролей является обязательным условием.

Тестирование в соответствии с требуемыми пороговыми значениями также подразумевает правильные настройки, техническое обслуживание и калибровку оборудования, бережное обращение и сохранение реагентов, а также все меры по предотвращению загрязнения между образцами, например: отделение положительного контроля от тестируемых образцов. Необходимо применять стандарты контроля качества, чтобы избежать административных и других ошибок, особенно в отношении маркировки и документации.

Предполагаемое событие, как указано в статье 4(2) Директивы 98/57/EC, подразумевает положительный результат диагностических или скрининговых тестов, проведенных на образце, как указано в блок-схемах ниже. Положительный результат первого скринингового теста (IF-тест, ПЦР/FISH, селективное выделение) должен быть подтвержден вторым скрининговым тестом, основанным на другом биологическом принципе.

Если первый скрининговый тест положительный, то подозревается заражение R. solanacearum и необходимо провести второй скрининговый тест. Если второй скрининговый тест положительный, то подозрение подтверждается (подозрение на возникновение) и тестирование по схеме необходимо продолжить. Если второй скрининговый тест отрицательный, то образец считается незараженным R. solanacearum.

Подтвержденное присутствие, как указано в статье 5(1) Директивы 98/57/EC, подразумевает выделение и идентификацию чистой культуры R. solanacearum с подтверждением патогенности.

РАЗДЕЛ I

ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ИСПЫТАНИЙ

1. Схема обнаружения для диагностики бурой гнили и бактериального увядания (Ralstonia solanacearum) клубней картофеля и картофеля, томата или других растений-хозяев с симптомами бурой гнили или бактериального увядания.

Процедура испытания предназначена для клубней и растений картофеля с симптомами, типичными или подозрительными на бурую гниль или сосудистое увядание. Он включает экспресс-тест, выделение возбудителя из инфицированной сосудистой ткани на (селективной) среде и в случае положительного результата идентификацию культуры как Ralstonia solanacearum.

2. Схема обнаружения и идентификации Ralstonia solanacearum в образцах бессимптомных клубней картофеля.

Принцип:

Процедура тестирования предназначена для выявления скрытых инфекций в клубнях картофеля. Положительный результат как минимум двух скрининговых тестов(3), основанных на разных биологических принципах, должен быть дополнен выделением возбудителя; с последующим, в случае выделения типичных колоний, подтверждением чистой культуры как R. solanacearum. Положительного результата только одного из скрининговых тестов недостаточно, чтобы считать образец подозрительным.

Скрининговые тесты и изолирующие тесты должны позволять обнаруживать от 103 до 104 клеток/мл ресуспендированного осадка, включенного в качестве положительного контроля в каждую серию тестов.

3. Схема обнаружения и идентификации Ralstonia solanacearum в образцах бессимптомного картофеля, томата или других растений-хозяев.

РАЗДЕЛ II

ДЕТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ RALSTONIA SOLANACEARUM В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ И КАРТОФЕЛЕ, ТОМАТЕ ИЛИ ДРУГИХ РАСТЕНИЯХ-ХОЗЯИНАХ С СИМПТОМАМИ БОРОЙ ГНИЛИ ИЛИ БАКТЕРИАЛЬНОГО УВЯДАНИЯ

1. Симптомы (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Симптомы на картофеле

Картофельный завод. Раннюю стадию заражения в полевых условиях можно определить по увяданию листьев к верхушке растения при высоких температурах в течение дня с восстановлением ночью. На ранних стадиях увядания листья остаются зелеными, но позже развивается пожелтение и бурый некроз. Встречается также эпинастия. Увядание одного побега или целого растения становится быстро необратимым и приводит к гибели и гибели растения. Сосудистая ткань поперечно разрезанных стеблей увядших растений обычно выглядит коричневой, а с поверхности среза выделяется молочный бактериальный ил или может появиться при сдавливании. Если положить срезанный стебель вертикально в воду, из сосудистых пучков потекут нити слизи.

Клубень картофеля. Клубни картофеля необходимо разрезать поперечно вблизи пятки (конец столона) или продольно над концом столона. Раннюю стадию инфекции можно определить по изменению цвета сосудистого кольца от стекловидного до светло-желтого или светло-коричневого, из которого через несколько минут спонтанно появляется бледно-кремовая бактериальная слизь. Позже изменение цвета сосудов становится более отчетливым и коричневым, и некроз может распространяться на паренхиматозную ткань. На поздних стадиях инфекция распространяется наружу от пятки и глаз, из которых может сочиться бактериальная слизь, вызывая прилипание частиц почвы. На коже могут появиться красновато-коричневые слегка впавшие очаги из-за внутреннего коллапса сосудистых тканей. Вторичное развитие грибковых и бактериальных мягких гнилей часто встречается на поздних стадиях заболевания.

1.2. Симптомы на томате

Томатный завод. Первым видимым симптомом является вялый вид самых молодых листьев. При благоприятных для возбудителя условиях внешней среды (температура почвы около 25 °С; насыщенная влажность) в течение нескольких дней наступает эпинастия и увядание одной стороны или всего растения, приводящее к полному гибели растения. В менее благоприятных условиях (температура почвы ниже 21°С) происходит меньшее увядание, но на стебле может развиться большое количество придаточных корней. У основания стебля можно наблюдать мокнущие полосы, свидетельствующие о некрозе сосудистой системы. При поперечном разрезе стебля из обесцвеченных коричневых сосудистых тканей выделяется белая или желтоватая бактериальная слизь.

1.3. Симптомы на других хостах

Растения Solanum dulcamara и S. nigrum. В естественных условиях симптомы увядания у этих сорняков-хозяев наблюдаются редко, за исключением случаев, когда температура почвы превышает 25 °C или уровень инокулята чрезвычайно высок (например, как у S. nigrum, растущего рядом с больными растениями картофеля или томата). Если увядание действительно происходит, симптомы аналогичны описанным для томатов. Неувядающие растения S. dulcamara, растущие со стеблями и корнями в воде, могут иметь внутреннее светло-коричневое изменение цвета сосудистых тканей на поперечном срезе основания стебля или подводных частях стебля. Бактерии могут просачиваться из срезанных сосудистых тканей или образовывать нити слизи, если срезанный стебель поместить вертикально в воду, даже при отсутствии симптомов увядания.

2. Быстрые скрининговые тесты

Экспресс-скрининговые тесты могут облегчить постановку предварительного диагноза, но не являются обязательными. Используйте один или несколько из следующих проверенных тестов:

2.1. Стриминговый тест

(См. Раздел VI.A.1.)

2.2. Обнаружение гранул поли-β-гидроксибутирата (ПГБ)

Характерные гранулы ПОБ в клетках R. solanacearum визуализируются путем окрашивания термофиксированных мазков бактериального ила из инфицированной ткани на предметном стекле микроскопа нильским синим А или суданом черным (см. раздел VI.A.2.).

2.3. Серологические реакции агглютинации

(См. Раздел VI.A.3.)

2.4. Другие тесты

Дополнительные подходящие быстрые скрининговые тесты включают тест IF (см. Раздел VI.A.5.), тест FISH (см. Раздел VI.A.7.), тесты ELISA (см. Раздел VI.A.8.) и ПЦР-тесты (см. Раздел VI.A.8.). Раздел VI.A.6).

3. Процедура изоляции

(а)

Удалите слизь или участки обесцвеченной ткани из сосудистого кольца клубня картофеля или из сосудистых нитей стеблей картофеля, томата или других увядающих растений-хозяев. Растворите в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды или 50 мМ фосфатного буфера (Приложение 4) и оставьте на 5–10 минут.

(б)

Приготовьте серию десятичных разведений суспензии.

(с)

Перенесите 50–100 мкл суспензии и разведений в обычную питательную среду (NA, YPGA или SPA; см. Приложение 2) и/или в тетразолиевую среду Кельмана (Приложение 2) и/или валидированную селективную среду (например, SMSA; см. Приложение). 2). Распределите или нанесите штрихи с помощью соответствующей техники нанесения разбавления. Если это необходимо, приготовьте отдельные чашки с разбавленной клеточной суспензией биовара 2 R. solanacearum в качестве положительного контроля.

(г)

Инкубируйте чашки в течение двух-шести дней при температуре 28°C.

—

На обычных питательных средах вирулентные изоляты R. solanacearum образуют жемчужно-кремово-белые, плоские, неравномерные и текучие колонии, часто с характерными мутовками в центре. Авирулентные формы R. solanacearum образуют небольшие круглые нежидкие маслянистые колонии полностью кремово-белого цвета.

—

На средах из тетразолия Кельмана и SMSA мутовки имеют кроваво-красный цвет. Авирулентные формы Ralstonia solanacearum образуют небольшие круглые нежидкие маслянистые колонии полностью темно-красного цвета.

4. Идентификационные тесты на R. solanacearum.

Тесты для подтверждения идентичности предполагаемых изолятов R. solanacearum показаны в Разделе VI.B.

РАЗДЕЛ III

1. Детальные методы выявления и идентификации Ralstonia solanacearum в образцах бессимптомных клубней картофеля.

1.1. Базовые приготовления

Примечание:

—

Стандартный размер выборки – 200 клубней на испытание. Более интенсивная выборка требует большего количества тестов на выборках такого размера. Большее количество клубней в образце приведет к ингибированию или затруднению интерпретации результатов. Однако эту процедуру можно удобно применять для образцов с количеством клубней менее 200, где доступно меньше клубней.

—

Валидация всех описанных ниже методов обнаружения основана на тестировании образцов из 200 клубней.

—

Описанный ниже экстракт картофеля также можно использовать для обнаружения бактерии кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. сепедоник.

Дополнительная предварительная обработка перед пробоподготовкой:

(а)

Инкубация образцов при температуре от 25 до 30 °C в течение двух недель перед тестированием для стимулирования размножения любых популяций R. solanacearum.

(б)

Промойте клубни. Используйте соответствующие дезинфицирующие средства (соединения хлора, если используется ПЦР-тест для удаления ДНК патогена) и моющие средства между каждым образцом. Высушите клубни на воздухе. Эта процедура промывки особенно полезна (но не обязательна) для образцов с избытком загрязнений, а также если необходимо провести ПЦР-тест или процедуру прямого выделения.

1.1.1. Чистым и продезинфицированным скальпелем или овощным ножом снимите кожицу на пяточном (столонном) конце каждого клубня так, чтобы стали видны сосудистые ткани. Аккуратно вырежьте небольшой стержень сосудистой ткани на пяточном конце и сведите к минимуму количество несосудистой ткани. (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Примечание. Отложите в сторону все (гниющие) клубни с подозрением на симптомы бурой гнили и проверьте их отдельно.

Если при удалении сердцевины пяточного конца наблюдаются подозрительные симптомы бурой гнили, следует провести визуальный осмотр клубня и разрезать клубень возле пяточного конца. Любой разрезанный клубень с подозрением на симптомы следует хранить не менее двух дней при комнатной температуре, чтобы обеспечить суберизацию, и хранить в холодильнике (при температуре от 4 до 10 °C) в надлежащих карантинных условиях. Все клубни, включая клубни с подозрительными симптомами, следует хранить в соответствии с Приложением III.

1.1.2. Соберите сердцевины пяточных концов в неиспользованные одноразовые контейнеры, которые можно закрыть и/или опечатать (в случае повторного использования контейнеров их следует тщательно очистить и продезинфицировать хлорсодержащими соединениями). Предпочтительно, чтобы стержни пяточного конца обрабатывались немедленно. Если это невозможно, храните их в контейнере без добавления буфера в холодильнике не более 72 часов или не более 24 часов при комнатной температуре.

Обработайте сердцевины пяточного конца одной из следующих процедур:

(а)

Накройте ядра достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 4) и перемешивайте на ротационном шейкере (50-100 об/мин) в течение 4 часов при температуре ниже 24 °C или в течение 16 – 24 часов в холодильнике.

или

(б)

Гомогенизируйте ядра с достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 4) либо в блендере (например, Waring или Ultra Thurax), либо путем измельчения в герметичном одноразовом мешке для мацерации (например, Stomacher или прочный полиэтилен Bioreba, 150 мм). × 250 мм; радиационная стерилизация) с использованием резинового молотка или подходящего шлифовального аппарата (например, Homex).

Примечание. Риск перекрестного загрязнения образцов высок, если образцы гомогенизируют с помощью блендера. Примите меры предосторожности, чтобы избежать образования или разлива аэрозолей в процессе экстракции. Убедитесь, что для каждого образца используются свежестерилизованные лезвия и сосуды блендера. Если будет использоваться ПЦР-тест, избегайте переноса ДНК на контейнеры или измельчительные устройства. При использовании ПЦР рекомендуется измельчение в одноразовых мешках и использование одноразовых пробирок.

1.1.3. Декантировать надосадочную жидкость. В случае чрезмерной мутности проведите осветление либо путем медленного центрифугирования (при ускорении не более 180 g в течение 10 минут при температуре от 4 до 10 °C), либо с помощью вакуумной фильтрации (от 40 до 100 мкм), промывая фильтр дополнительным количеством (приблизительно 10 мл) ) буфер экстракции.

1.1.4. Концентрируют бактериальную фракцию центрифугированием при 7 000 g в течение 15 минут (или 10 000 g в течение 10 минут) при температуре от 4 до 10 °C и удаляют надосадочную жидкость, не нарушая осадок.

1.1.5. Ресуспендируйте осадок в 1,5 мл буфера для осадка (Приложение 4). Используйте 500 мкл для тестирования на R. solanacearum, 500 мкл на Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus и 500 мкл для справочных целей. Добавьте стерильный глицерин до конечной концентрации от 10 до 25 % (по объему) к 500 мкл эталонной аликвоты и к оставшейся тестируемой аликвоте, перемешайте на вортексе и храните при температуре от –16 до –24 °C (недели) или при температуре от –68 до –86 °С (месяцы). Во время тестирования храните тестовые аликвоты при температуре от 4 до 10 °C.

Повторное замораживание и оттаивание нежелательно.

Если требуется транспортировка экстракта, обеспечьте доставку в холодильнике в течение 24–48 часов.

1.1.6. Крайне важно, чтобы все положительные контроли и образцы R. solanacearum обрабатывались отдельно во избежание контаминации. Это относится к слайдам IF и ко всем тестам.

1.2. Тестирование

См. блок-схему и описание тестов и оптимизированных протоколов в соответствующих приложениях:

Селективная изоляция (см. Раздел VI.A.4.)

Испытание ПЧ (см. Раздел VI.A.5.)

ПЦР-тесты (см. Раздел VI.A.6.)

FISH-тест (см. Раздел VI.A.7.)

Тесты ELISA (см. Раздел VI.A.8.)

Биоанализ (см. Раздел VI.A.9.)

2. Подробные методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в образцах бессимптомного картофеля, томата или других растений-хозяев.

2.1. Базовые приготовления

Примечание. Для обнаружения латентных популяций R. solanacearum рекомендуется тестировать составные образцы. Эту процедуру можно удобно применять для составных образцов, содержащих до 200 частей штока. При проведении обследований они должны основываться на статистически репрезентативной выборке исследуемой популяции растений.

2.1.1. Соберите сегменты стебля размером 1–2 см в закрытый стерильный контейнер в соответствии со следующими процедурами отбора проб:

Саженцы томатов из питомника: чистым продезинфицированным ножом удалите сегмент длиной 1 см от основания каждого стебля, чуть выше уровня почвы.

Растения томатов, выращенные в открытом грунте или в теплице: чистым продезинфицированным ножом удалите самый нижний боковой побег с каждого растения, срезая его чуть выше места соединения с основным стеблем. Удалите самый нижний сегмент длиной 1 см с каждого бокового побега.

Другие хозяева: чистым продезинфицированным ножом или секатором удалите сегмент длиной 1 см от основания каждого стебля, чуть выше уровня почвы. В случае S. dulcamara или других растений-хозяев, растущих в воде, удалите срезы длиной 1–2 см из подводных стеблей или столонов с водными корнями.

При отборе проб из определенного места рекомендуется протестировать статистически репрезентативную выборку, состоящую как минимум из 10 растений на точку отбора каждого потенциального хозяина сорняков. Обнаружение возбудителя будет наиболее надежным в конце весны, лета и осени, хотя естественные инфекции можно обнаружить круглый год у многолетнего Solanum dulcamara, растущего в водотоках. Известные растения-хозяева включают растения картофеля-добровольца (земледержатели), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium и других представителей семейства пасленовых. Дальнейшими хозяевами являются Pelargonium spp. и портулак огородный. Некоторые европейские виды сорняков. которые потенциально могут содержать популяции R. solanacearum биовара 2/Расы 3 в корнях и/или ризосферах в определенных условиях окружающей среды, включают Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp. ., Silene alba, S. nutans., Tussilago Farfarra и Urtica dioica.

Примечание. На этом этапе можно провести визуальный осмотр внутренних симптомов (окрашивание сосудов или бактериальное выделение). Отложите в сторону все сегменты стебля с симптомами и проведите тестирование отдельно (см. Раздел II).

2.1.2. Кратковременно продезинфицируйте сегменты стебля 70 % этанолом и сразу же промокните насухо на папиросной бумаге. Затем обработайте сегменты стебля одной из следующих процедур: либо,

(а)

Накройте сегменты достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 4) и перемешивайте на ротационном шейкере (от 50 до 100 об/мин) в течение четырех часов при температуре ниже 24 °C или в течение 16–24 часов в холодильнике, или

(б)

Немедленно обработайте сегменты, измельчив сегменты в прочном мешке для мацерации (например, Stomacher или Bioreba) с соответствующим объемом экстракционного буфера (Приложение 4) с помощью резинового молотка или соответствующего измельчительного устройства (например, Homex). Если это невозможно, храните сегменты стебля в холодильнике не более 72 часов или не более 24 часов при комнатной температуре.

2.1.3. Слейте супернатант после отстаивания в течение 15 минут.

2.1.4. Дальнейшее осветление экстракта или концентрирование бактериальной фракции обычно не требуется, но может быть достигнуто путем фильтрации и/или центрифугирования, как описано в Разделах III.1.1.3 – 1.1.5.

2.1.5. Разделите чистый или концентрированный экстракт образца на две равные части. Во время тестирования одну половину храните при температуре от 4 до 10 °C, а другую половину храните со стерильным глицерином, содержащим 10–25 % (об./об.), при температуре от –16 до –24 °C (недели) или при температуре от –68 до –86 °C (месяц). ) в случае необходимости дальнейшего тестирования.

2.2. Тестирование

См. блок-схему и описание тестов и оптимизированных протоколов в соответствующих приложениях:

Селективная изоляция (см. Раздел VI.A.4.)

Испытание ПЧ (см. Раздел VI.A.5.)

ПЦР-тесты (см. Раздел VI.A.6.)

FISH-тест (см. Раздел VI.A.7.)

Тесты ELISA (см. Раздел VI.A.8.)

Биоанализ (см. Раздел VI.A.9.)

РАЗДЕЛ IV

1. Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в воде.

2. Методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в воде.

Принцип

Утвержденная схема обнаружения, описанная в этом разделе, применима для обнаружения патогенов в пробах поверхностных вод, а также может применяться для тестирования проб продуктов переработки картофеля или сточных вод. Однако важно отметить, что ожидаемая чувствительность обнаружения будет варьироваться в зависимости от подложки. На чувствительность теста на выделение влияют популяции конкурирующих сапрофитных бактерий, которые обычно намного выше при переработке картофеля и в сточных водах, чем в поверхностных водах. Хотя ожидается, что приведенная ниже схема позволит обнаружить всего лишь 103 клеток на литр в поверхностных водах, чувствительность обнаружения при переработке картофеля или в сточных водах, вероятно, будет значительно ниже. По этой причине рекомендуется проверять сточные воды после любых очистительных процедур (например, седиментации или фильтрации), в ходе которых снижается популяция сапрофитных бактерий. Ограничения чувствительности схемы тестирования следует учитывать при оценке надежности любых полученных отрицательных результатов. Несмотря на то, что эта схема успешно использовалась в исследовательских работах для определения присутствия или отсутствия патогена в поверхностных водах, следует осознавать ее ограничения при использовании в аналогичных исследованиях при переработке картофеля или сточных водах.

2.1. Базовые приготовления

Примечание:

—

Обнаружение R. solanacearum в поверхностных водах наиболее надежно в поздневесенний, летний и осенний сезоны, когда температура воды превышает 15 °C.

—

Повторный отбор проб в разное время в течение вышеупомянутого периода в определенных точках отбора проб повысит надежность обнаружения за счет уменьшения влияния климатических изменений.

—

Примите во внимание влияние сильных дождей и географию водотока, чтобы избежать значительного эффекта разбавления, который может скрыть присутствие патогена.

—

Возьмите пробы поверхностных вод вблизи растений-хозяев, если эти хозяева присутствуют.

2.1.1. В выбранных точках отбора проб отбирайте пробы воды, заполняя одноразовые стерильные пробирки или бутылки на глубине, по возможности, менее 30 см и в пределах 2 м от берега. Для технологических и канализационных стоков отбирают пробы в месте сброса стоков. Рекомендуемые размеры проб до 500 мл на точку отбора проб. Если предпочтительны образцы меньшего размера, рекомендуется отбирать пробы как минимум три раза из каждой точки отбора проб, при этом каждый образец состоит из двух повторных подвыборок объемом не менее 30 мл. Для интенсивных исследовательских работ выберите не менее трех точек отбора проб на 3 км водотока и убедитесь, что пробы также отбираются из притоков, впадающих в водоток.

2.1.2. Транспортируйте образцы в прохладных темных условиях (от 4 до 10 °C) и исследуйте в течение 24 часов.

2.1.3. При необходимости бактериальную фракцию можно концентрировать одним из следующих методов:

(а)

Центрифугируйте подобразцы объемом от 30 до 50 мл при 10 000 g в течение 10 минут (или 7 000 g в течение 15 минут), предпочтительно при 4-10 °C, отбрасывайте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для гранул (Приложение 4).

(б)

Мембранная фильтрация (минимальный размер пор 0,45 мкм) с последующей промывкой фильтра в буфере для гранул объемом от 5 до 10 мл и сохранением промывных вод. Этот метод подходит для больших объемов воды, содержащих небольшое количество сапрофитов.

Концентрирование обычно не рекомендуется для образцов, полученных при переработке картофеля или сточных вод, поскольку увеличение популяции конкурирующих сапрофитных бактерий будет препятствовать обнаружению Ralstonia solanacearum.

2.2. Тестирование

См. блок-схему и описание испытаний в соответствующих приложениях.

РАЗДЕЛ V

1. Схема обнаружения и идентификации R. solanacearum в почве.

2. Методы обнаружения и идентификации R. solanacearum в почве.

Принципы

Утвержденная схема обнаружения, описанная в этом разделе, применима для обнаружения патогенов в образцах почвы, но также может использоваться для тестирования образцов твердых отходов переработки картофеля или осадка сточных вод. Однако следует отметить, что эти методы недостаточно чувствительны, чтобы гарантировать обнаружение низких и/или неравномерно рассредоточенных популяций Ralstonia solanacearum, которые могут встречаться в естественно зараженных образцах этих субстратов.

Ограничения чувствительности этой схемы испытаний следует учитывать при оценке надежности любых полученных отрицательных результатов, а также при использовании в исследованиях для определения присутствия или отсутствия патогена в почвах или илах. Самый надежный тест на наличие патогена в полевой почве — это посадить восприимчивого хозяина и следить за ним на предмет заражения, но даже при использовании этого метода небольшие уровни заражения не будут обнаружены.

2.1. Базовые приготовления

2.1.1. Отбор проб полевой почвы должен осуществляться в соответствии со стандартными принципами отбора проб нематод. Соберите от 0,5 до 1 кг почвы на образец из 60 участков на 0,3 га с глубины от 10 до 20 см (или сеткой 7 x 7 метров). Если есть подозрение на присутствие патогена, увеличьте количество точек сбора до 120 на 0,3 га. Перед тестированием храните образцы при температуре от 12 до 15 °C. Отберите образцы осадка от переработки картофеля и сточных вод, собрав в общей сложности 1 кг с участков, представляющих общий объем осадка, подлежащего тестированию. Перед тестированием тщательно перемешайте каждый образец.

2.1.2. Распределите подпробы от 10 до 25 г почвы или ила с помощью вращательного встряхивания (250 об/мин) в буфере для экстракции объемом от 60 до 150 мл (Приложение 4) на срок до двух часов. При необходимости добавление 0,02 % стерильного Твина-20 и 10–20 г стерильного гравия может способствовать диспергированию.

2.1.3. Во время тестирования поддерживайте суспензию при температуре 4 °C.

2.2. Тестирование

См. блок-схему и описание испытаний в соответствующих приложениях.

РАЗДЕЛ VI

ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ПРОТОКОЛЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ R. SOLANACEARUM

A. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ВЫЯВЛЯЮЩИЕ ТЕСТЫ

1. Тест потоковой передачи

Присутствие R. solanacearum в стеблях увядающего картофеля, томатов или других растений-хозяев можно определить с помощью следующего простого предварительного теста: срежьте стебель чуть выше уровня почвы. Подвесьте поверхность среза в трубке с чистой водой. Через несколько минут наблюдают за характерным самопроизвольным истечением нитей бактериальной слизи из разрезанных сосудистых пучков.

2. Обнаружение гранул поли-ß-гидроксибутирата.

Приготовьте мазок бактериальной жидкости из инфицированной ткани или 48-часовой культуры на среде YPGA или SPA (Приложение 2) на предметном стекле микроскопа.

Приготовьте мазки положительного контроля штамма R. solanacearum биовара 2 и, если это будет сочтено полезным, мазок отрицательного контроля известного отрицательного по PHB sp.

Дайте высохнуть на воздухе и быстро проведите нижней поверхностью каждого предметного стекла над пламенем, чтобы зафиксировать мазки.

Окрасьте препарат нильским синим или суданским черным и наблюдайте под микроскопом, как описано ниже:

Нильский голубой тест:

(а)

Залейте каждое предметное стекло 1 % водным раствором нильского голубого А и инкубируйте в течение 10 минут при 55 °C.

(б)

Слейте красящий раствор. Ненадолго промойте в слегка проточной водопроводной воде. Удалите лишнюю воду салфеткой.

(с)

Залейте мазок 8 % водным раствором уксусной кислоты и инкубируйте в течение одной минуты при температуре окружающей среды.

(г)

Ненадолго промойте в слегка проточной водопроводной воде. Удалите лишнюю воду салфеткой.

(е)

Снова смочите каплей воды и нанесите покровное стекло.

(е)

Осмотрите окрашенный мазок с помощью эпифлуоресцентного микроскопа при длине волны 450 нм в масляной иммерсии при увеличении от 600 до 1000, используя масляный или водоиммерсионный объектив.

(г)

Наблюдайте за ярко-оранжевой флуоресценцией гранул ПГБ. Также наблюдайте в проходящем нормальном свете, чтобы убедиться, что гранулы являются внутриклеточными и что морфология клеток типична для R. solanacearum.

Судан Блэк тест:

(а)

Залейте каждое предметное стекло 0,3 % раствором Sudan Black B в 70 % этаноле и инкубируйте в течение 10 минут при температуре окружающей среды.

(б)

Слейте красящий раствор и промойте изделие в водопроводной воде, удаляя излишки воды салфеткой.

(с)

Окуните предметные стекла ненадолго в ксилол и промокните насухо папиросной бумагой. Внимание: Ксилол вреден, соблюдайте необходимые меры предосторожности и работайте в вытяжном шкафу.

(г)

Залейте предметные стекла 0,5 % (мас./об.) водным раствором сафранина и оставьте на 10 секунд при температуре окружающей среды. Внимание: Сафранин вреден, соблюдайте необходимые меры предосторожности и работайте в вытяжном шкафу.

(е)

Промойте осторожно проточной водопроводной водой, промокните насухо папиросной бумагой и наложите покровное стекло.

(е)

Окрашенные мазки исследуйте с помощью светового микроскопа в проходящем свете под масляной иммерсией при увеличении 1000 с использованием масляно-иммерсионного объектива.

(г)

Наблюдайте за сине-черным окрашиванием гранул ПОБ в клетках R. solanacearum с розовыми клеточными стенками.

3. Работы серологической агглютинации.

Агглютинацию клеток R. solanacearum в бактериальном иле или экстрактах тканей с симптомами лучше всего наблюдать с использованием проверенных антител (см. Приложение 3), меченных соответствующими цветными маркерами, такими как красные клетки Staphylococcus aureus или цветные частицы латекса. При использовании имеющегося в продаже комплекта (см. Приложение 3) следуйте инструкциям производителя. В противном случае выполните следующую процедуру:

(а)

Смешайте капли суспензии меченого антитела и бактериальной слизи (приблизительно по 5 мкл каждая) на окнах многолуночных предметных стекол.

(б)

Подготовьте положительные и отрицательные контроли, используя суспензии биовара 2 R. solanacearum и гетерологичного штамма.

(с)

Наблюдайте за агглютинацией в положительных образцах после осторожного перемешивания в течение 15 секунд.

4. Селективная изоляция

4.1. Селективное покрытие

Примечание. Прежде чем использовать этот метод в первый раз, проведите предварительные тесты, чтобы обеспечить воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 колониеобразующих единиц R. solanacearum на мл, добавленных к экстрактам из образцов, которые ранее дали отрицательный результат.

Используйте соответствующим образом проверенную селективную среду, такую как SMSA (в модификации Elphinstone et al., 1996; см. Приложение 2).

Требуется осторожность, чтобы дифференцировать R. solanacearum от других бактерий, способных образовывать колонии на среде. Кроме того, колонии R. solanacearum могут иметь атипичную морфологию, если чашки переполнены или присутствуют бактерии-антагонисты. При подозрении на влияние конкуренции или антагонизма образец следует протестировать повторно, используя другой тест.

Наибольшую чувствительность обнаружения этим методом можно ожидать при использовании свежеприготовленных экстрактов проб. Однако метод также применим для использования с экстрактами, которые хранились в глицерине при температуре от –68 до –86°C.

В качестве положительного контроля готовят десятичные разведения из суспензии 106 КОЕ на мл вирулентного штамма биовара 2 R. solanacearum (например, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Чтобы избежать любой возможности контаминации, подготавливайте положительные контроли отдельно от тестируемых образцов.

Для каждой вновь приготовленной партии селективной среды следует проверить ее пригодность для роста возбудителя, прежде чем она будет использована для тестирования рутинных образцов.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

4.1.1. Выполните соответствующую технику посева с разбавлением, чтобы гарантировать, что любые фоновые сапрофитные колониеобразующие популяции разбавлены. Распределите по 50–100 мкл экстракта образца и каждого разведения на чашку.

4.1.2. Инкубируйте планшеты при 28 °C. Считывайте таблички через 48 часов и в дальнейшем ежедневно в течение шести дней. Типичные колонии R. solanacearum на среде SMSA имеют молочно-белый цвет, плоские, неравномерные и текучие, а после трех дней инкубации в центре приобретают окраску от розовой до кроваво-красной с внутренними полосками или мутовками. (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Примечание. На этой среде иногда образуются атипичные колонии R. solanacearum. Они могут быть маленькими, круглыми, полностью красного цвета, нежидкими или лишь частично текучими, и поэтому их трудно отличить от сапрофитных колониеобразующих бактерий.

4.1.3. Очистите предполагаемые колонии R. solanacearum после посева штрихами или разведениями на обычную питательную среду для получения изолированных колоний (см. Приложение 2).

4.1.4. Храните культуры кратковременно в стерильной воде (рН от 6 до 8, без хлора) при комнатной температуре в темноте или в течение длительного времени в подходящей криозащитной среде при температуре от –68 до –86 °C или в лиофилизированном виде.

4.1.5. Определите предполагаемые культуры (см. Раздел VI.B.) и проведите тест на патогенность (см. Раздел VI.C).

Интерпретация результатов испытаний выборочного покрытия

Селективная посевная проба считается отрицательной, если через шесть дней не обнаружено никаких бактериальных колоний или если не обнаружено никаких предполагаемых колоний, типичных для R. solanacearum, при условии, что нет подозрений на ингибирование, вызванное конкуренцией или антагонизмом со стороны других бактерий, и что типичные колонии R. solanacearum не обнаружены. обнаружен в положительном контроле.

Селективная посевная проба дает положительный результат, если изолированы предполагаемые колонии R. solanacearum.

4.2. Процедура обогащения

Используйте проверенную обогатительную среду, например модифицированный бульон Уилбринка (см. Приложение 2).

Эту процедуру можно использовать для выборочного увеличения популяции R. solanacearum в экстрактах образцов и повышения чувствительности обнаружения. Процедура также эффективно разбавляет ингибиторы реакции ПЦР (1:100). Однако следует отметить, что обогащение R. solanacearum может оказаться неудачным из-за конкуренции или антагонизма со стороны сапрофитных организмов, которые часто обогащаются одновременно. По этой причине выделение R.solanacearum из обогащенных бульонных культур может быть затруднено. Кроме того, поскольку популяции серологически родственных сапрофитов могут увеличиваться, при проведении теста ELISA рекомендуется использовать специфические моноклональные антитела, а не поликлональные антитела.

4.2.1. Для обогащенной ПЦР перенесите 100 мкл экстракта образца в 10 мл накопительного бульона (Приложение 2), предварительно разлитого в пробирки или колбы без ДНК. Для обогащенного ИФА можно использовать более высокие пропорции экстракта образца в бульоне (например, 100 мкл в 1,0 мл обогащенного бульона).

4.2.2. Инкубируйте в течение 72 часов при температуре от 27 до 30 °C в качающейся культуре или в статической культуре со свободно закрытыми крышками для обеспечения аэрации.

4.2.3. Тщательно перемешайте перед использованием в тестах ELISA или PCR.

4.2.4. Обращайтесь с обогащенным бульоном так же, как с образцами в вышеуказанных тестах.

Примечание. Если ожидается ингибирование обогащения R. solanacearum из-за высоких популяций некоторых конкурирующих сапрофитных бактерий, обогащение экстрактов образцов перед любым центрифугированием или другими этапами концентрирования может дать лучшие результаты.

5. Тест ЕСЛИ

Принцип

Использование теста IF в качестве основного скринингового теста рекомендуется из-за его доказанной надежности для достижения требуемых пороговых значений.

Если тест IF используется в качестве основного скринингового теста и результат IF положительный, тесты IF, PCR или FISH должны быть выполнены в качестве второго скринингового теста. Если тест IF используется в качестве второго скринингового теста и результат IF положительный, для завершения анализа требуется дальнейшее тестирование в соответствии с блок-схемой.

Примечание. Используйте проверенный источник антител к R. solanacearum (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Рекомендуется определять титр для каждой новой партии антител. Титр определяется как наибольшее разведение, при котором происходит оптимальная реакция при тестировании суспензии, содержащей от 105 до 106 клеток на мл гомологичного штамма R. solanacearum, и использовании соответствующего конъюгата изотиоцианата флуоресцеина (FITC) в соответствии с рекомендациями производителя. Все проверенные поликлональные антисыворотки имели титр IF не менее 1:2 000. Во время тестирования антитела следует использовать в рабочих разведениях, близких к титру или равных ему.

Тест следует проводить на свежеприготовленных экстрактах образцов. При необходимости его можно успешно провести на экстрактах, хранящихся при температуре от –68 до –86 °С в глицерине. Глицерин можно удалить из образца путем добавления 1 мл буфера для пеллет (Приложение 4), повторного центрифугирования в течение 15 минут при 7000 g и ресуспендирования в равном объеме буфера для пеллет. Зачастую в этом нет необходимости, особенно если образцы фиксируются на предметных стеклах методом обжига.

Подготовьте отдельные слайды положительного контроля гомологичного штамма или любого другого эталонного штамма R. solanacearum, суспендированного в картофельном экстракте, как указано в Приложении 3 B, и, необязательно, в буфере.

Естественно инфицированную ткань (сохраненную путем лиофилизации или замораживания при температуре от –16 до –24 °C) следует использовать, где это возможно, в качестве аналогичного контроля на том же предметном стекле.

В качестве отрицательного контроля можно использовать аликвоты экстракта образца, который ранее дал отрицательный результат на R. solanacearum.

Стандартизированные положительные и отрицательные контрольные материалы, доступные для использования в этом тесте, перечислены в Приложении 3.

Используйте многолуночные предметные стекла для микроскопа с желательно 10 окнами диаметром не менее 6 мм.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

5.1. Подготовьте тестовые слайды, выполнив одну из следующих процедур:

(я)

Для гранул с относительно небольшим осадком крахмала:

Внесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм – увеличьте объем для окон большего размера) разведения 1/100 ресуспендированного картофельного гранулята в первое окно. Затем пипеткой внесите аналогичный объем неразбавленного осадка (1/1) в оставшиеся окна ряда. Вторая строка может использоваться как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 1.

(ii)

Для других пеллет:

Приготовьте десятичные разведения (1/10, 1/100) ресуспендированного осадка в буфере для осадка. Отнесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм – увеличьте объем для окон большего размера) ресуспендированного осадка и каждого разведения в ряду окон. Вторая строка может использоваться как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 2.

5.2. Высушите капли при температуре окружающей среды или нагревая до температуры от 40 до 45 °C. Зафиксируйте бактериальные клетки на предметном стекле либо путем нагревания (15 минут при 60 °C), прокаливания 95 % этанолом, либо в соответствии со специальными инструкциями поставщиков антител.

При необходимости фиксированные предметные стекла можно затем хранить в замороженном виде в высушенном ящике в течение необходимого короткого времени (максимум до трех месяцев) перед дальнейшим тестированием.

5.3. ЕСЛИ процедура

(я)

Согласно подготовке тестовых слайдов в 5.1(i):

Приготовьте набор двойных разведений. В первой лунке должно быть 1/2 титра (Т/2), в остальных - 1/4 титра (Т/4), 1/2 титра (Т/2), титр (Т) и двойной титр (2Т).

(ii)

Согласно подготовке предметных стекол в 5.1(ii):

Подготовьте рабочее разведение (WD) антитела в буфере IF. Рабочее разведение влияет на специфичность.

Рисунок 1. Подготовка предметного стекла в соответствии с 5.1(i) и 5.3(i)

Разведения ресуспендированного осадка

1/100

1/1



Разбавление ресуспендированного осадка

(Т = заголовок)

Т/2

Т/4

Т/2

кот



Двукратные разведения антисыворотки/антитела

Образец 1

Дубликат образца 1 или образца 2

Рисунок 2. Подготовка предметного стекла в соответствии с 5.1(ii) и 5.3(ii).

Рабочее разведение антисыворотки/антитела

1/1

1/10

1/100

пустой



Десятичное разведение ресуспендированного осадка

Образец 1

Дубликат образца 1 или образца 2

5.3.1. Разложите слайды на влажной папиросной бумаге. Полностью закройте каждое тестовое окно разведением(ями) антитела. Объем антитела, нанесенного на каждое окно, должен быть не меньше объема нанесенного экстракта.

Следующую процедуру следует проводить при отсутствии конкретных инструкций от поставщиков антител:

5.3.2. Инкубируйте предметные стекла на влажной бумаге под крышкой в течение 30 минут при температуре окружающей среды (от 18 до 25 °C).

5.3.3. Стряхните капли с каждого предметного стекла и тщательно промойте буфером IF. Промойте, погрузив на пять минут в буфер IF-Tween (Приложение 4), а затем в буфер IF. Избегайте попадания аэрозолей или капель, которые могут привести к перекрестному загрязнению. Осторожно удалите лишнюю влагу, аккуратно промокнув.

5.3.4. Разложите слайды на влажной бумаге. Закройте тестовые окна разведением конъюгата FITC, использованного для определения титра. Объем конъюгата, нанесенного на окна, должен быть идентичен объему нанесенного антитела.

5.3.5. Инкубируйте предметные стекла на влажной бумаге под крышкой в течение 30 минут при температуре окружающей среды (от 18 до 25 °C).

5.3.6. Стряхните капли конъюгата со предметного стекла. Прополощите и постирайте, как указано выше (5.3.3).

Тщательно удалите лишнюю влагу.

5.3.7. Нанесите пипеткой 5–10 мкл 0,1М фосфатно-буферного глицерина (Приложение 4) или имеющегося в продаже средства, препятствующего выцветанию, на каждое окно и нанесите покровное стекло.

5.4. Чтение теста IF:

5.4.1 Исследуют предметные стекла на эпифлуоресцентном микроскопе с фильтрами, подходящими для возбуждения ФИТЦ, под масляной или водной иммерсией при увеличении 500–1000. Сканируют окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру. Для образцов, в которых клетки отсутствуют или имеют небольшое количество клеток, наблюдайте как минимум в 40 полях микроскопа.

Сначала проверьте слайд положительного контроля. Клетки должны быть ярко флуоресцентными и полностью окрашенными при определенном титре антител или рабочем разведении. Тест IF (Раздел VI.A.5.) необходимо повторить, если окрашивание отклоняется от нормы.

5.4.2. Наблюдайте за яркими флуоресцирующими клетками с характерной морфологией R. solanacearum в тестовых окнах тестовых слайдов (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интенсивность флуоресценции должна быть эквивалентна штамму положительного контроля при том же разведении антител. Клетки с неполным окрашиванием или со слабой флуоресценцией следует игнорировать.

При подозрении на какое-либо загрязнение испытание необходимо повторить. Это может произойти в том случае, если на всех предметных стеклах в партии наблюдаются положительные клетки из-за загрязнения буфера или если на покрытии предметного стекла (за пределами окон предметного стекла) обнаружены положительные клетки.

5.4.3. Существует несколько проблем, связанных со специфичностью иммунофлуоресцентного теста. Фоновые популяции флуоресцирующих клеток с атипичной морфологией и перекрестно реагирующих сапрофитных бактерий с размером и морфологией, сходными с R. solanacearum, вероятно, встречаются в сердцевине пятки картофеля и гранулах сегментов стебля.

5.4.4. Рассматривайте только флуоресцирующие клетки типичного размера и морфологии при титре или рабочем разведении антител, как указано в 5.3.

5.4.5. Интерпретация показаний IF:

(я)

Если обнаружены яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией, оцените среднее количество типичных клеток на поле микроскопа и рассчитайте количество типичных клеток на мл ресуспендированного осадка (Приложение 5).

Показание IF является положительным для образцов, содержащих не менее 5 × 103 типичных клеток на мл ресуспендированного осадка. Образец считается потенциально загрязненным и требует дальнейшего тестирования.

(ii)

Показание IF является отрицательным для образцов с содержанием клеток менее 5 × 103 на мл ресуспендированного осадка, и образец считается отрицательным. Дальнейшее тестирование не требуется.

6. ПЦР-тесты

Принципы

Если ПЦР-тест используется в качестве основного скринингового теста и оказывается положительным, изоляция или ИФ должны выполняться в качестве второго обязательного скринингового теста. Если ПЦР используется в качестве второго скринингового теста и оказывается положительной, для завершения диагноза требуется дальнейшее тестирование в соответствии с блок-схемой.

Полное использование этого метода в качестве основного скринингового теста рекомендуется только при наличии специального опыта.

Примечание. Предварительное тестирование с помощью этого метода должно обеспечить воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 клеток R. solanacearum на мл, добавленных к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат. Во всех лабораториях могут потребоваться эксперименты по оптимизации для достижения максимального уровня чувствительности и специфичности.

Используйте проверенные реагенты и протоколы ПЦР (см. Приложение 6). Предпочтительно выбрать метод с внутренним контролем.

Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения образца целевой ДНК. ПЦР-тест должен проводиться опытными специалистами в специализированных лабораториях молекулярной биологии, чтобы свести к минимуму возможность загрязнения целевой ДНК.

Отрицательные контроли (для процедур экстракции ДНК и ПЦР) всегда следует рассматривать как окончательные образцы процедуры, чтобы выявить, произошел ли какой-либо перенос ДНК.

В ПЦР-тест должны быть включены следующие отрицательные контроли:

—

Экстракт образца, который ранее дал отрицательный результат на R. solanacearum,

—

Буферные контроли, используемые для извлечения бактерии и ДНК из образца,

—

ПЦР-реакционная смесь.

Должны быть включены следующие положительные контроли:

—

Аликвоты ресуспендированных гранул, к которым был добавлен R. solanacearum (приготовление см. в Приложении 3 B).

—

Суспензия 106 клеток на мл R. solanacearum в воде из вирулентного изолята (например, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; см. Приложение 3 B).

—

Если возможно, используйте также ДНК, выделенную из образцов положительного контроля в ПЦР тесте.

Чтобы избежать потенциального загрязнения, подготовьте положительные контроли в отдельной среде от образцов, подлежащих тестированию.

Экстракты проб должны быть максимально очищены от почвы. Поэтому в некоторых случаях может быть целесообразно приготовить экстракты из промытого картофеля, если будут использоваться протоколы ПЦР.

Стандартизированные положительные и отрицательные контрольные материалы, доступные для использования в этом тесте, перечислены в Приложении 3).

6.1. Методы очистки ДНК

Используйте положительные и отрицательные контрольные образцы, как описано выше (см. Приложение 3).

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

Доступны различные методы очистки целевой ДНК от сложных субстратов образца, таким образом удаляя ингибиторы ПЦР и других ферментативных реакций и концентрируя целевую ДНК в экстракте образца. Следующий метод оптимизирован для использования с проверенными методами ПЦР, показанными в Приложении 6.

(a) Метод по Пастрику (2000)

Внесите пипеткой 220 мкл лизирующего буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА [pH 8,0]) в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл.

Добавьте 100 мкл экстракта образца и поместите в нагревательный блок или на водяную баню при температуре 95 °C на 10 минут.

Положите пробирку на лед на 5 минут.

Добавьте 80 мкл маточного раствора лизоцима (50 мг лизоцима на мл в 10 мМ трис-HCl, pH 8,0) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.

Добавьте 220 мкл раствора Easy DNA® A (Invitrogen), хорошо перемешайте встряхиванием и инкубируйте при 65 °C в течение 30 мин.

Добавьте 100 мкл раствора Easy DNA® B (Invitrogen), энергично встряхивайте до тех пор, пока осадок не начнет свободно течь в пробирке и образец не станет однородным по вязкости.

Добавьте 500 мкл хлороформа и перемешивайте на вортексе до тех пор, пока вязкость не уменьшится и смесь не станет однородной.

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 20 минут при 4 °C для разделения фаз и образования интерфазы.

Перенесите верхнюю фазу в свежую пробирку Эппендорфа.

10)

Добавьте 1 мл 100 % этанола (–20 °C) на встряхивание и инкубируйте на льду в течение 10 минут.

11)

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 20 минут при 4 °C и удалите этанол из осадка.

12)

Добавьте 500 мкл 80 % этанола (–20 °C) и перемешайте, перевернув пробирку.

13)

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 10 минут при 4 °C, сохраните осадок и удалите этанол.

14)

Дайте осадку высохнуть на воздухе или в вакууме DNA Speed.

15)

Ресуспендируйте осадок в 100 мкл стерильного UPW и оставьте при комнатной температуре минимум на 20 минут.

16)

Хранить при –20 °C до тех пор, пока не потребуется ПЦР.

17)

Центрифугируйте любой белый осадок и используйте 5 мкл супернатанта, содержащего ДНК, для ПЦР.

(б) Другие методы

Другие методы экстракции ДНК, например. Набор Qiagen DNeasy Plant Kit можно применять при условии, что они доказали свою столь же эффективную очистку ДНК из контрольных образцов, содержащих от 103 до 104 клеток патогена на мл.

6.2. ПЦР

6.2.1. Подготовьте тестовые и контрольные шаблоны для ПЦР в соответствии с утвержденными протоколами (раздел VI.A.6.). Подготовьте одно десятичное разведение экстракта ДНК образца (1:10 в UPW).

6.2.2. Подготовьте соответствующую реакционную смесь для ПЦР в свободной от контаминации среде в соответствии с опубликованными протоколами (Приложение 6). Там, где это возможно, рекомендуется использовать протокол мультиплексной ПЦР, который также включает внутренний контроль ПЦР.

6.2.3. Добавьте 2–5 мкл экстракта ДНК на 25 мкл реакции ПЦР в стерильные пробирки для ПЦР в соответствии с протоколами ПЦР (см. Приложение 6).

6.2.4. Добавьте образец отрицательного контроля, содержащий только реакционную смесь ПЦР, и вместо образца добавьте тот же источник UPW, который использовался в смеси ПЦР.

6.2.5. Поместите пробирки в тот же термоциклер, который использовался при предварительном тестировании, и запустите соответствующим образом оптимизированную программу ПЦР (Приложение 6).

6.3. Анализ продукта ПЦР

6.3.1. Разрешите ампликоны ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Проведите по меньшей мере 12 мкл реакционной смеси амплифицированной ДНК из каждого образца, смешанного с 3 мкл загрузочного буфера (Приложение 6) в 2,0 % (масс./об.) агарозных гелях в трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфере (Приложение 6) при от 5 до 8 В на см. Используйте соответствующий ДНК-маркер, например. Лестница 100 б.п.

6.3.2. Выявите полосы ДНК путем окрашивания бромистым этидием (0,5 мг на л) в течение 30–60 минут, соблюдая соответствующие меры предосторожности при обращении с этим мутагеном.

6.3.3. Осмотрите окрашенный гель под коротковолновым УФ-трансиллюминированием (λ = 302 нм) на предмет амплифицированных продуктов ПЦР ожидаемого размера (Приложение 6) и документирования.

6.3.4. Для всех новых результатов/случаев проверяйте подлинность ампликона ПЦР, выполняя анализ ферментов рестрикции на образце оставшейся амплифицированной ДНК путем инкубации при оптимальной температуре и времени с соответствующим ферментом и буфером (см. Приложение 6). Распределите переваренные фрагменты с помощью электрофореза в агарозном геле, как указано выше, и наблюдайте характерную картину рестрикционных фрагментов при УФ-трансиллюминации после окрашивания бромидом этидия и сравните с непереваренным и переваренным положительным контролем.

Интерпретация результата ПЦР-теста:

ПЦР-тест является отрицательным, если специфичный для R. solanacearum ПЦР-ампликон ожидаемого размера не обнаружен в рассматриваемом образце, но обнаружен во всех образцах положительного контроля (в случае мультиплексной ПЦР с праймерами внутреннего контроля, специфичными для растений: второй ПЦР-тест). продукт ожидаемого размера должен быть амплифицирован с помощью рассматриваемого образца).

ПЦР-тест считается положительным, если обнаружен специфичный для R. solanacearum ПЦР-ампликон ожидаемого размера и характера рестрикции (при необходимости) при условии, что он не амплифицируется ни в одном из образцов отрицательного контроля. Надежное подтверждение положительного результата также можно получить, повторив тест со вторым набором праймеров для ПЦР (Приложение 6).

Примечание. Ингибирование ПЦР можно заподозрить, если ожидаемый ампликон получен из образца положительного контроля, содержащего R. solanacearum в воде, но отрицательные результаты получены из положительного контроля с R. solanacearum в экстракте картофеля. В протоколах мультиплексной ПЦР с внутренним контролем ПЦР ингибирование реакции указывается, когда ни один из двух ампликонов не получен.

Заражение можно заподозрить, если ожидаемый ампликон получен из одного или нескольких отрицательных контролей.

7. FISH-тест

Принцип

Если тест FISH используется в качестве первого скринингового теста и оказывается положительным, изоляция или тест IF должны выполняться в качестве второго обязательного скринингового теста. Если тест FISH используется в качестве второго скринингового теста и оказывается положительным, для завершения диагноза требуется дальнейшее тестирование в соответствии со схемой потока.

Примечание. Используйте проверенные олигозонды, специфичные для R. solanacearum (см. Приложение 7). Предварительное тестирование с помощью этого метода должно обеспечить воспроизводимое обнаружение по меньшей мере 103–104 клеток R. solanacearum на мл, добавленных к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат.

Описанную ниже процедуру предпочтительно следует выполнять со свежеприготовленным экстрактом образца, но ее также можно успешно выполнить с экстрактом образца, который хранился в глицерине при температуре от –16 до –24 или от –68 до –86 °C.

В качестве отрицательного контроля используйте аликвоты экстракта образца, который ранее дал отрицательный результат на R. solanacearum.

В качестве положительного контроля готовят суспензии, содержащие от 105 до 106 клеток на мл биовара 2 R. solanacearum (например, штамм NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, см. Приложение 3) в 0,01 М фосфатном буфере (PB) из 3-5-дневной культуры. ). Подготовьте отдельные слайды положительного контроля гомологичного штамма или любого другого эталонного штамма R. solanacearum, суспендированного в экстракте картофеля, как указано в Приложении 3 B.

Использование эубактериального олигозонда, меченного FITC, позволяет контролировать процесс гибридизации, поскольку он окрашивает все эубактерии, присутствующие в образце.

Стандартизированные положительные и отрицательные контрольные материалы, доступные для использования в этом тесте, перечислены в Приложении 3А).

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

7.1. Фиксация экстракта картофеля

Следующий протокол основан на Wullings et al. (1998):

7.1.1. Приготовьте фиксирующий раствор (см. Приложение 7).

7.1.2. Отнесите пипеткой по 100 мкл экстракта каждого образца в пробирку Эппендорфа и центрифугируйте в течение 7 минут при 7000 g.

7.1.3. Удалите надосадочную жидкость и растворите осадок в 200 мкл фиксатора, приготовленного менее 24 часов назад. Перемешайте и инкубируйте в холодильнике в течение одного часа.

7.1.4. Центрифугируйте в течение 7 минут при 7 000 g, удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок в 75 мкл 0,01 М PB (см. Приложение 7).

7.1.5. Нанесите 16 мкл фиксированной суспензии на чистое предметное стекло для мультитеста, как показано на рис. 7.1. Наносят два разных образца на предметное стекло в неразбавленном виде и используют 10 мкл для разведения 1:100 (в 0,01 М ПБ). Оставшийся раствор образца (49 мкл) можно хранить при –20 °C после добавления одного объема 96 % этанола. Если анализ FISH требует повторения, удалите этанол центрифугированием и добавьте равный объем 0,01 ПБ (смешайте встряхиванием).

Рис. 7.1 Макет слайда FISH

Образец 1

Пустой

Образец 2

окно 1

окно 2

окно 3

окно 4

окно 5

Образец 1

Пустой

Образец 2

окно 6

окно 7

окно 8

окно 9

окно 10

Покровное стекло 1

Покровное стекло 2

7.1.6. Высушите предметные стекла на воздухе (или в сушилке для предметных стекол при температуре 37 °C) и зафиксируйте их пламенем.

На этом этапе процедуру можно прервать и продолжить гибридизацию на следующий день. Слайды следует хранить в защищенном от пыли и сухом месте при комнатной температуре.

7.2. Гибридизация

7.2.1. Обезвоживайте клетки с помощью ступенчатой серии этанола 50 %, 80 % и 96 % в течение одной минуты каждая. Высушите слайды на воздухе в держателе слайдов.

7.2.2. Подготовьте влажную инкубационную камеру, накрыв дно воздухонепроницаемой коробки салфеткой или фильтровальной бумагой, пропитанной 1 гибридной смесью (Приложение 7). Предварительно инкубируйте коробку в печи для гибридизации при температуре 45 °C в течение не менее 10 минут.

7.2.3. Нанесите 10 мкл раствора для гибридизации (Приложение 7) на восемь окон (окна 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10; см. рис. 7.1) каждого предметного стекла, оставив два центральных окна (3 и 8) пустыми.

7.2.4. Нанесите покровные стекла (24 × 24 мм) на первые и последние четыре окна, не задерживая воздух. Поместите предметные стекла в предварительно нагретую влажную камеру и гибридизуйте в течение пяти часов в духовке при температуре 45 °C в темноте.

7.2.5. Подготовьте три стакана, содержащие 1 л воды Milli Q (молекулярного класса), 1 л 1x гибридной смеси (334 мл 3x гибридной смеси и 666 мл воды Milli Q) и 1 л 1/8x гибридной смеси (42 мл 3x гибридной смеси и 958 мл Milli Q) вода). Предварительно инкубируйте каждый на водяной бане при температуре 45°C.

7.2.6. Снимите покровные стекла со слайдов и поместите их в держатель слайдов.

7.2.7. Смойте излишки зонда путем инкубации в течение 15 минут в стакане с 1x гибридной смесью при 45 °C.

7.2.8. Перенесите держатель предметных стекол в промывочный раствор Hybmix 1/8 и инкубируйте еще 15 минут.

7.2.9. Окуните предметные стекла ненадолго в воду Milli Q и поместите их на фильтровальную бумагу. Удалите лишнюю влагу, аккуратно накрыв поверхность фильтровальной бумагой. Нанесите пипеткой от 5 до 10 мкл раствора для защиты от выцветания (например, Vectashield, Vecta Laboratories, Калифорния, США или эквивалент) на каждое окно и нанесите большое покровное стекло (24 × 60 мм) на все предметное стекло.

7.3. Чтение теста FISH

7.3.1. Немедленно осмотрите предметные стекла с помощью микроскопа, приспособленного для эпифлуоресцентной микроскопии с увеличением 630 или 1000 × под иммерсионным маслом. С помощью фильтра, подходящего для флуоресцеинизотиоцианата (FITC), эубактериальные клетки (включая большинство грамотрицательных клеток) в образце окрашиваются флуоресцентным зеленым цветом. При использовании фильтра для тетраметилродамин-5-изотиоцианата окрашенные Cy3 клетки R. solanacearum выглядят флуоресцентно-красными. Сравните морфологию клеток с морфологией положительного контроля. Клетки должны быть ярко флуоресцентными и полностью окрашенными. Тест FISH (раздел VI.A.7.) необходимо повторить, если окрашивание аномальное. Сканируйте окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру. Для образцов, в которых клетки отсутствуют или имеют небольшое количество клеток, наблюдайте как минимум в 40 полях микроскопа.

7.3.2. Наблюдайте за яркими флуоресцирующими клетками с характерной морфологией R. solanacearum в тестовых окнах тестовых слайдов (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интенсивность флуоресценции должна быть эквивалентна или выше, чем у штамма положительного контроля. Клетки с неполным окрашиванием или со слабой флуоресценцией следует игнорировать.

7.3.3. При подозрении на какое-либо загрязнение испытание необходимо повторить. Это может произойти в том случае, когда на всех предметных стеклах в партии наблюдаются положительные клетки из-за загрязнения буфера или если положительные клетки обнаружены (за пределами окон предметных стекол) на покрытии предметного стекла.

7.3.4. Есть несколько проблем, присущих специфике теста FISH. Фоновые популяции флуоресцирующих клеток с атипичной морфологией и перекрестно реагирующими сапрофитными бактериями с размером и морфологией, сходными с R. solanacearum, могут встречаться, хотя и гораздо реже, чем в тесте IF, в сердцевине пятки картофеля и гранулах сегментов стебля.

7.3.5. Рассмотрим только флуоресцирующие клетки типичного размера и морфологии.

7.3.6. Интерпретация результата теста FISH:

(я)

Достоверные результаты теста FISH получаются, если ярко-зеленые флуоресцентные клетки размера и морфологии, типичных для R. solanacearum, наблюдаются при использовании фильтра FITC, а ярко-красные флуоресцентные клетки при использовании родаминового фильтра наблюдаются во всех положительных контролях, но не ни в одном из отрицательных контролей. Если обнаружены яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией, оцените среднее количество типичных клеток на поле микроскопа и рассчитайте количество типичных клеток на мл ресуспендированного осадка (Приложение 4). Образцы, содержащие не менее 5 × 103 типичных клеток на мл ресуспендированного осадка, считаются потенциально загрязненными. Требуется дальнейшее тестирование. Образцы с содержанием менее 5 × 103 типичных клеток на мл ресуспендированного осадка считаются отрицательными.

(ii)

FISH-тест является отрицательным, если при использовании родаминового фильтра не наблюдаются ярко-красные флуоресцентные клетки с размером и морфологией, типичными для R. solanacearum, при условии, что в препаратах положительного контроля при использовании родаминового фильтра наблюдаются типичные ярко-красные флуоресцентные клетки.

8. ИФА-тесты

Принцип

ИФА можно использовать только в качестве дополнительного теста в дополнение к ИФ, ПЦР или FISH из-за относительно низкой чувствительности этого теста. При использовании DAS ELISA обогащение и использование моноклональных антител являются обязательными (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Обогащение образцов перед использованием ИФА может быть полезно для повышения чувствительности теста, но оно может оказаться неудачным из-за конкуренции со стороны других организмов в образце.

Примечание. Используйте проверенный источник антител к R. solanacearum (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Рекомендуется определять титр для каждой новой партии. антител. Титр определяется как наибольшее разведение, при котором происходит оптимальная реакция при тестировании суспензии, содержащей от 105 до 106 клеток на мл гомологичного штамма R. solanacearum, и использовании соответствующих конъюгатов вторичных антител в соответствии с рекомендациями производителя. Во время тестирования антитела следует использовать в рабочем разведении, близком к коммерческому препарату или его титре.

Определите титр антител на суспензии от 105 до 106 клеток на мл гомологичного штамма R. solanacearum.

В качестве отрицательного контроля включите экстракт образца, который ранее дал отрицательный результат на R. solanacearum, и суспензию неперекрестно реагирующей бактерии в фосфатно-солевом буфере (PBS).

В качестве положительного контроля используют аликвоты экстракта образца, который ранее дал отрицательный результат, смешанного с 103–104 клетками на мл биовара 2 R. solanacearum (например, штамм NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, см. Приложение 2 A и B). Для сравнения результатов на каждом планшете используют стандартную суспензию от 105 до 106 клеток на мл в PBS R. solanacearum. Убедитесь, что положительные контроли хорошо отделены на микротитровальном планшете от тестируемого образца(ов).

Стандартизированные материалы положительного и отрицательного контроля, доступные для использования в этом тесте, перечислены в Приложении 3 А.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

Были валидированы два протокола ELISA.

(а) Непрямой ИФА (Робинсон Смит и др., 1995)

Используйте аликвоты экстракта образца объемом от 100 до 200 мкл. (Нагревание при 100 °C в течение четырех минут на водяной бане или в нагревательном блоке может в некоторых случаях снизить неспецифические результаты).

Добавьте равный объем буфера для покрытия двойной прочности (Приложение 4) и перемешайте.

Нанесите аликвоты по 100 мкл в каждую из как минимум двух лунок микротитровального планшета (например, Nunc-Polysorp или эквивалента) и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C или в течение ночи при 4 °C.

Вытряхните экстракты из лунок. Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 4), оставив последний промывной раствор в лунках как минимум на пять минут.

Подготовьте соответствующее разведение антител против-R. solanacearum в блокирующем буфере (Приложение 4). Для проверенных коммерческих антител используйте рекомендуемые разведения (обычно концентрация в два раза превышает титр).

Добавьте по 100 мкл в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C.

Вылейте раствор антител из лунок и промойте, как указано выше (4).

Подготовьте соответствующее разведение конъюгата вторичного антитела-щелочной фосфатазы в блокирующем буфере. Добавьте по 100 мкл в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C.

Вытряхните конъюгированные антитела из лунок и промойте, как раньше (4).

10)

Добавьте в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата щелочной фосфатазы (Приложение 4). Инкубируйте в темноте при температуре окружающей среды и измеряйте поглощение при длине волны 405 нм через равные промежутки времени в течение 90 минут.

(b) ГАЛСТУК ИФА

Подготовьте соответствующее разведение анти-R. solanacearum поликлональные иммуноглобулины в покрывающем буфере с pH 9,6 (Приложение 4). Добавьте по 200 мкл в каждую лунку. Инкубируйте при 37 °C в течение четырех-пяти часов или при 4 °C в течение 16 часов.

Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 4).

Добавьте 190 мкл экстракта образца как минимум в две лунки. Также добавьте положительные и отрицательные контроли в две лунки на каждую пластину. Инкубируйте в течение 16 часов при 4 °C.

Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 4).

Приготовьте соответствующее разведение моноклональных антител, специфичных для R. solanacearum, в PBS (Приложение 4), также содержащем 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (BSA), и добавьте по 190 мкл в каждую лунку. Инкубируйте при 37°C в течение двух часов.

Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 4).

Подготовьте соответствующее разведение антимышиных иммуноглобулинов, конъюгированных с щелочной фосфатазой в PBS. Добавьте по 190 мкл в каждую лунку. Инкубируйте при 37°C в течение двух часов.

Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 4).

Приготовьте раствор субстрата щелочной фосфатазы, содержащий 1 мг п-нитрофенилфосфата на мл буферного субстрата (Приложение 4). Добавьте по 200 мкл в каждую лунку. Инкубируйте в темноте при температуре окружающей среды и измеряйте поглощение при длине волны 40 нм через равные промежутки времени в течение 90 минут.

Интерпретация результатов теста ИФА:

Тест ELISA является отрицательным, если среднее значение оптической плотности (ОП), измеренное в лунках с дублированными образцами, <2x ОП, чем в контрольной лунке с экстрактом отрицательного образца, при условии, что ОП для всех положительных контролей превышает 1,0 (после 90 минут инкубации). с субстратом) и более чем в два раза превышают ОП, полученную для экстрактов отрицательных образцов.

Тест ELISA является положительным, если средние показания ОП из лунок с дублированными образцами > 2x OD в лунках с экстрактом отрицательного образца при условии, что показания OD во всех лунках с отрицательным контролем < 2x превышают значения в лунках с положительным контролем.

Отрицательные результаты ELISA в лунках с положительным контролем указывают на то, что тест был выполнен неправильно или что он был заблокирован. Положительные результаты ELISA в лунках с отрицательным контролем указывают на то, что произошло перекрестное загрязнение или неспецифическое связывание антител.

9. Биоанализ

Примечание. Предварительное тестирование с использованием этого метода должно обеспечивать воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 колониеобразующих единиц R. solanacearum на мл, добавленных к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат (подготовка см. Приложение 3).

Наибольшую чувствительность обнаружения можно ожидать при использовании свежеприготовленного экстракта образца и оптимальных условиях роста. Однако метод можно успешно применять к экстрактам, хранившимся в глицерине при температуре от –68 до –86 °С.

Следующий протокол основан на Янсе (1988):

9.1. Используйте 10 тестовых растений восприимчивого сорта томата (например, Манимейкер или сорта с эквивалентной восприимчивостью, как определено испытательной лабораторией) на стадии третьего настоящего листа для каждого образца. Подробную информацию о культурах см. в Приложении 8. В качестве альтернативы можно использовать баклажаны (например, сорт Black Beauty или сорта с эквивалентной восприимчивостью), использовать только растения на стадии второго-третьего листа до полного раскрытия третьего настоящего листа. Было показано, что у баклажанов симптомы менее выражены и развиваются медленнее. Поэтому там, где это возможно, рекомендуется использовать рассаду томатов.

Распределите 100 мкл экстракта образца между тестируемыми растениями.

9.2.1. Прививка шприцем

Инокулируют стебли растения чуть выше семядолей с помощью шприца с иглой для подкожных инъекций (не менее 23G). Распределите образец между испытательными растениями.

9.2.2. Щелевая прививка

Держа растение двумя пальцами, нанесите пипеткой каплю (примерно 5–10 мкл) взвешенного осадка на стебле между семядолями и первым листом.

С помощью стерильного скальпеля сделайте диагональный надрез длиной около 1,0 см и глубиной примерно 2/3 толщины стебля, начиная надрез с капли гранулы.

Заклейте разрез стерильным вазелином из шприца.

9.3. По той же методике инокулируют пять сеянцев водной суспензией с концентрацией от 105 до 106 клеток на мл, полученной из 48-часовой культуры вирулентного штамма биовара 2 R. solanacearum в качестве положительного контроля и с буфером для гранул (Приложение 4) в качестве отрицательного контроля. . Отделите растения положительного и отрицательного контроля от других растений, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

9.4. Выращивайте тестовые растения в карантинных помещениях в течение четырех недель при температуре от 25 до 30 °C и высокой относительной влажности с соответствующим поливом, чтобы предотвратить заболачивание или увядание из-за дефицита воды. Во избежание загрязнения инкубируйте растения положительного и отрицательного контроля на четко разделенных скамьях в теплице или камере выращивания или, в случае ограниченного пространства, обеспечьте строгое разделение между обработками. Если растения для разных образцов необходимо инкубировать близко друг к другу, разделите их соответствующими экранами. При удобрении, поливе, осмотре и любых других манипуляциях соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать перекрестного заражения. Очень важно содержать теплицы и камеры выращивания свободными от насекомых-вредителей, поскольку они могут передавать бактерию от образца к образцу.

Наблюдайте за симптомами увядания, эпинастии, хлороза и/или задержки роста.

9.5. Изолировать от зараженных растений (Раздел II.3.) и идентифицировать очищенные культуры предположительного R. solanacearum (Раздел VI.B.).

9.6. Если через три недели симптомы не наблюдаются, выполните ИФ/ПЦР/выделение составного образца из срезов стебля толщиной 1 см каждого тестируемого растения, взятых над местом инокуляции. Если тест положительный, выполните посев для разведения (раздел 4.1).

9.7. Определите любые очищенные культуры предположительного R. solanacearum (Раздел VI.B.).

Интерпретация результатов биоанализа

Действительные результаты биоанализа получаются, когда растения положительного контроля демонстрируют типичные симптомы, бактерии могут быть повторно выделены из этих растений, а на отрицательном контроле никаких симптомов не обнаружено.

Биологический тест является отрицательным, если тестируемые растения не заражены R. solanacearum и при условии, что R. solanacearum обнаруживается в положительном контроле.

Биологический анализ считается положительным, если тестируемые растения заражены R. solanacearum.

Б. ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ ТЕСТЫ

Определите чистые культуры предполагаемых изолятов R. solanacearum, используя как минимум два из следующих тестов, основанных на различных биологических принципах.

Включите известные эталонные штаммы, где это возможно, для каждого проведенного теста (см. Приложение 3).

1. Пищевые и ферментативные тесты на идентификацию

Определите следующие фенотипические свойства, которые повсеместно присутствуют или отсутствуют у R. solanacearum, согласно методам Lelliott and Stead (1987), Klement et al. (1990), Шаад (2001).

Тест

Ожидаемый результат

Производство флуоресцентных пигментов

–

Включения поли-ß-гидроксибутирата

Тест на окисление/ферментацию (OF)

О+/Ф–

Каталазная активность

Оксидазный тест Ковача

Снижение нитратов

Использование цитрата

Рост при 40 °C

–

Рост в 1 % NaCl

Рост в 2 % NaCl

–

Активность аргининдигидролазы

–

Разжижение желатина

–

Гидролиз крахмала

–

Гидролиз эскулина

–

Леван производство

–

2. тест ЕСЛИ

2.1. Приготовьте суспензию из примерно 106 клеток на мл в буфере IF (Приложение 4).

2.2. Подготовьте серию двукратных разведений соответствующей антисыворотки (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Примените процедуру ЕСЛИ (раздел VI.A.5.).

2.4. Положительный результат теста IF достигается, если титр IF культуры эквивалентен титру положительного контроля.

3. ИФА-тест

Примечание. При проведении только двух идентификационных тестов не используйте еще один серологический тест в дополнение к этому методу.

3.1. Приготовьте суспензию примерно 108 клеток на мл в 1X PBS (Приложение 4).

3.2. Выполните соответствующую процедуру ELISA со специфическим моноклональным антителом к R. solanacearum.

3.3. Положительный результат теста ELISA считается, если результат ELISA, полученный из культуры, составляет по крайней мере половину результата, полученного для положительного контроля.

4. ПЦР-тесты

4.1. Приготовьте суспензию примерно 106 клеток на мл в стерильной воде молекулярного качества.

4.2. Нагрейте 100 мкл клеточной суспензии в закрытых пробирках в нагревательном блоке или на кипящей водяной бане при температуре 100 °C в течение четырех минут. Затем образцы можно хранить при температуре от –16 до –24 °C до тех пор, пока они не потребуются.

4.3. Примените соответствующие процедуры ПЦР для амплификации специфичных для R. solanacearum ампликонов (например, Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. ( 1997), Веллер и др. (1999).

4.4. Положительная идентификация R. solanacearum достигается, если ПЦР-ампликоны имеют тот же размер и такой же полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, что и штамм положительного контроля.

5. FISH-тест

5.1. Подготовьте суспензию примерно 106 клеток на мл в UPW.

5.2. Примените процедуру FISH (раздел VI.A.7.) как минимум с двумя олигозондами, специфичными для R. solanacearum (Приложение 7).

5.3. Положительный результат FISH-теста достигается, если в культуре и положительном контроле получены одинаковые реакции.

6. Профилирование жирных кислот (FAP)

6.1. Выращивайте культуру на триптиказо-соевом агаре (Оксоид) в течение 48 часов при 28 °C.

6.2. Примените соответствующую процедуру FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Положительный тест FAP достигается, если профиль предполагаемой культуры идентичен профилю положительного контроля. Наличие характерных жирных кислот 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH и 18:1 2OH, а также отсутствие 16:0 3OH высоко указывает на Ralstonia sp.

7. Методы характеристики деформации

Характеристика штамма с использованием одного из следующих методов рекомендуется для каждого нового случая выделения R. solanacearum.

Включите известные эталонные штаммы, где это необходимо, для каждого проведенного теста (см. Приложение 3).

7.1. Определение Биовара

R. solanacearum разделяют на биовары на основании способности утилизировать и/или окислять три дисахарида и три гексозных спирта (Hayward, 1964 и Hayward et al., 1990). Среды для выращивания для биоварного теста описаны в Приложении 2. Тест может быть успешно проведен путем инокуляции среды чистыми культурами изолятов R. solanacearum и инкубации при 28 °C. Если среды распределяются в стерильные 96-луночные планшеты для культивирования клеток (200 мкл на лунку), изменение цвета с оливково-зеленого на желтый можно наблюдать в течение 72 часов, что указывает на положительный результат теста.

Биовар

Использование:

Мальтоза

–

Лактоза

–

D (+) Целлобиоза

–

Маннитол

–

Сорбитол

–

Дульцит

–

Дополнительные тесты позволяют дифференцировать субфенотипы биовара 2.

Он обеспечивает любые

(Распространение по всему миру)

Он обеспечивает любые

(Найден в Чили и Колумбии)

Биовар 2Т

(Найден в тропических регионах)

Использование трегалозы

Использование мезо-инозитола

Использование D-рибозы

Пектолитическая активность (1)

низкий

высокий

7.2. Геномная дактилоскопия

Молекулярная дифференциация штаммов комплекса R. solanacearum может быть достигнута с помощью нескольких методов, в том числе:

7.2.1. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (Cook et al., 1989).

7.2.2. ПЦР с повторяющимися последовательностями с использованием праймеров REP, BOX и ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. ПЦР-методы

Специфические праймеры для ПЦР (Пастрик и др., 2002; см. Приложение 6) можно использовать для дифференциации штаммов, принадлежащих к разделу 1 (биовары 3, 4 и 5) и разделу 2 (биовары 1, 2А и 2Т) R. solanacearum, как было первоначально определяется с помощью RFLP-анализа (Cook et al., 1989) и секвенирования 16S рДНК (Taghavi et al., 1996).

C. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЙ ТЕСТ

Тест на патогенность необходимо проводить для окончательного подтверждения диагноза R. solanacearum и для оценки вирулентности культур, идентифицированных как R. solanacearum.

Подготовьте инокулят с концентрацией приблизительно 106 клеток на мл из 24-48-часовой культуры тестируемого изолята и соответствующий штамм положительного контроля R. solanacearum (например, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; см. Приложение 3).

Инокулируют от 5 до 10 восприимчивых сеянцев томатов или баклажанов на стадии третьего настоящего листа (см. Раздел VI.A.9).

Инкубируйте до двух недель при температуре от 25 до 28 °C и высокой относительной влажности с соответствующим поливом, чтобы избежать переувлажнения или стресса от засухи. При использовании чистых культур типичное увядание должно быть получено в течение 14 дней. Если по истечении этого периода симптомы отсутствуют, культура не может быть подтверждена как патогенная форма R. solanacearum.

Наблюдайте за симптомами увядания и/или эпинастии, хлороза и задержки роста.

Изолируйте от растений с симптомами, удалив часть стебля примерно на 2 см выше точки инокуляции. Измельчите и суспендируйте в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды или 50 мМ фосфатного буфера (Приложение 4). Изолируют из суспензии путем распределения разведения или нанесения штрихов на подходящую среду, предпочтительно на селективную среду (Приложение 2), инкубируют в течение 48–72 часов при 28 °C и наблюдают за образованием колоний, типичных для R. solanacearum.

Приложение 1

Лаборатории, занимающиеся оптимизацией и проверкой протоколов

Лаборатория (2)

Расположение

Страна

Агентство здравоохранения и продовольственной безопасности

Вена и Линц

Австрия

Департамент защиты растений

Мерелбеке

Бельгия

Дирекция завода

Люнгбю

Дания

Центральная научная лаборатория

Йорк

Англия

Шотландское агентство сельскохозяйственных наук

Эдинбург

Шотландия

Национальная лаборатория защиты растений, отделение бактериологии

Анже

Франция

Национальная лаборатория защиты растений, Картофельная карантинная станция

Реу

Франция

Федеральный биологический институт

Кляйнмахнов

Германия

Ганноверское управление по защите растений

Ганновер

Германия

Государственная лаборатория

Дублин

Ирландия

Департамент агроэкологических наук и технологий

Болонья

Италия

Периферийное подразделение фитосанитарных услуг региона Венето

Верона

Италия

Генеральная инспекционная служба Голландии

Эммелорд

Нидерланды

Служба защиты растений

Вагенинген

Нидерланды

Главное управление охраны культуры

Лиссабон

Португалия

Диагностический центр Альдеаррубия

Саламанка

Испания

Валенсийский институт аграрных исследований

Валенсия

Испания

Шведский университет сельскохозяйственных наук

Уппсала

Швеция

Приложение 2

СМИ для изоляции и культуры Р. solanacearum

(a) Общие среды роста

Питательный агар (NA)

Питательный агар (Дифко)

23,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин.

Дрожжево-пептонно-глюкозный агар (ЙОГА)

Дрожжевой экстракт (Difco)

5,0 г

Бакто-Пептон (Дифко)

5,0 г

D(+) Глюкоза (моногидрат)

10,0 г

Бакто-агар (Дифко)

15,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Сахарозно-пептонный агар (SPA)

Сахароза

20,0 г

Бакто-Пептон (Дифко)

5,0 г

К2HPO4

0,5 г

MgSO4.7H2O

0,25 г

Бакто-агар (Дифко)

15,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

pH 7,2 – 7,4

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Тетразолиевая среда Кельмана

Казаминокислоты (Difco)

1,0 г

Бакто-Пептон (Дифко)

10,0 г

Декстроза

5,0 г

Бакто-агар (Дифко)

15,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Охладите до 50 °C и добавьте простерилизованный фильтрованием раствор хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия (Sigma) до получения конечной концентрации 50 мг на л.

(b) Проверенные селективные питательные среды

Среда SMSA (Englebrecht, 1994 в модификации Elphinstone et al., 1996)

Базальная среда

Казаминокислоты (Difco)

1,0 г

Бакто-Пептон (Дифко)

10,0 г

Глицерин

5,0 мл

Бакто-Агар (Дифко); см. примечание 2.

15,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Охладите до 50 °C и добавьте простерилизованные фильтрованием исходные водные растворы следующих ингредиентов до получения указанных конечных концентраций:

Кристально-фиолетовый (Сигма)

5 мг на л

Полимиксин-B-сульфат (Sigma P-1004)

600 000 ЕД (приблизительно 100 мг) на л

Бацитрацин (Сигма B-0125)

1 250 ЕД (приблизительно 25 мг) на л

Хлорамфеникол (Сигма C-3175)

5 мг на л

Пенициллин-G (Сигма P-3032)

825 ЕД (приблизительно 0,5 мг) на л

2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (Сигма)

50 мг на л

Примечание:

Использование реагентов, отличных от указанных выше, может повлиять на рост R. solanacearum.

Вместо бакто-агара (Difco) можно использовать оксоидный агар №1. В этом случае рост R. solanacearum будет замедляться, хотя рост конкурирующих сапрофитов также может замедлиться. Для формирования типичных колоний R. solanacearum может потребоваться на 1–2 дня больше времени, а красная окраска может быть более светлой и размытой, чем на бакто-агаре.

Увеличение концентрации бацитрацина до 2 500 ЕД/л может снизить популяции конкурирующих бактерий, не влияя на рост Ralstonia solanacearum.

Храните среды и исходные растворы антибиотиков при температуре 4 °C в темноте и используйте в течение одного месяца.

Перед использованием пластины должны быть очищены от поверхностного конденсата.

Избегайте чрезмерного высыхания пластин.

Контроль качества следует проводить после приготовления каждой новой партии среды путем высева суспензии эталонной культуры R. solanacearum (см. Приложение 3) и наблюдения за образованием типичных колоний после инкубации при 28 °C в течение двух-пяти дней.

SMSA бульон (Эльфинстон и др., 1996)

Приготовьте, как для селективной агаровой среды SMSA, но не добавляйте бактоагар и 2,3,5-тетразолий хлорид.

Модифицированный бульон Уилбринка (Caruso et al., 2002)

Сахароза

10 г

Протеозный пептон

5 г

К2HPO4

0,5 г

MgSO4

0,25 г

Нааааааааааааааааааааааааа

0,25 г

Дистиллированная вода

1 л

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 минут и охладить до 50 °С.

Добавьте исходные растворы антибиотиков, как для бульона SMSA.

Приложение 3

A. Коммерчески доступный стандартизированный контрольный материал.

(а) Бактериальные изоляты

Следующие бактериальные изоляты рекомендуется использовать в качестве стандартного эталонного материала либо в качестве положительного контроля (Таблица 1), либо при оптимизации тестов во избежание перекрестных реакций (Таблица 2). Все штаммы коммерчески доступны по адресу:

Национальная коллекция фитопатогенных бактерий (NCPPB), Центральная научная лаборатория, Йорк, Великобритания

Коллекция культур Службы защиты растений (PD), Вагенинген, Нидерланды.

Французская коллекция фитопатогенных бактерий (CFBP), Фитобактериологическая станция INRA, Анже, Франция.

Таблица 1. Эталонная панель SMT изолятов R. solanacearum

Код NCPPB

СМТ

Другие коды

Страна происхождения

Биовар

НЦППБ 4153

ЦФБП 4582, Пр 3020, EURS11

Египет

НЦППБ 4154

CFBP 4585, 550, 21 евро

Турция

НЦППБ 3857

ЦФБП 4587, Пр 1140, EURS26

Англия

НЦППБ 1584

CFBP 4598, 49 евро

Кипр

НЦППБ 2505

CFBP 4599, 50 евро

Швеция

НЦППБ 4155

CFBP 4601, 502, 55 евро

Бельгия

НЦППБ 4156 (3)

71 (3)

ПД 2762, ЦФБП 3857

Нидерланды

НЦППБ 4157

ЛНПВ 15,59

Франция

НЦППБ 4158

CFBP 4608, порт 448, EURS80

Португалия

НЦППБ 4160

ИВИА-1632-2

Испания

НЦППБ 4161

БЗБ

Германия

НЦППБ 325

ЦБП 2047, КЕЛ60-1, Р842

США

НЦППБ 3967

ЦБП 4610, Р285, ГОНг7

Коста-Рика

НЦППБ 4028

КФБП 4611, Р303/571, КИП310, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ205

Колумбия

НЦППБ 3985

КФБП 4612, Р578, СИП312

Перу

кот

НЦППБ 3989

КФБП 4613, Р568, КИП226

Бразилия

кот

НЦППБ 3996

Кафбаб 3928, Рахит/355, Субха, Сакак

Перу

НЦППБ 3997

КФБП 4614, Р280/363, КИП49, ХАЙ0131а

Австралия

НЦППБ 4029

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Шри-Ланка

НЦППБ 4005

ЦФБП 4616, Р470

Филиппины

НЦППБ 4011

CFBP 4617, R288, HEmps2

Китай

Примечание. Подлинность вышеуказанных штаммов может быть гарантирована только в том случае, если они получены из коллекции аутентичных культур.

Таблица 2. Эталонная панель SMT серологически или генетически родственных бактерий для использования при оптимизации тестов обнаружения

Код NCPPB

СМТ

Другой код

Идентификация

НЦППБ 4162

CFBP 1954 г.

Бацилла полимикса (4)

НЦППБ 4163

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. маргиналис (4)

НЦППБ 4164

—

ЦФБП 2227

Буркхолдерия цепасия (5)

НЦППБ 4165

—

ЦФБП 2459

Ралстон пикетирует (5)

НЦППБ 4166

ЦФБП 3567

КСЛ Пр1150

Ралстон пикетирует (4)

НЦППБ 4167

ЦБП 4618

ПД 2778

Ральстония сп. (4)

НЦППБ 1127

CFBP 3575

Буркхолдерия андропогонис (4)

НЦППБ 353

CFBP 3572

Буркхолдерия кариофилли (4)

НЦППБ 945

CFBP 3569

Буркхолдерия цепасия (4)

НЦППБ 3708

ЦФБП 3574

Буркхолдерия глюма (4)

НЦППБ 3590

ЦФБП 3573

Буркхолдерия плантарии (4)

НЦППБ 3726

ЦФБП 3568

Банановая бактерия заболевания крови (4) (5) (6)

НЦППБ 4168

ЦФБП 4619

ИПО S339

Энтеробактер сп. (4)

НЦППБ 4169

ИПО 1695

Энтеробактер сп. (4)

НЦППБ 4170

ЦФБП 4621

ИПО S306

Охробактрум антропи (4) (5)

НЦППБ 4171

ЦФБП 4622

ИПО 1693

Куртобактерия сп. (4) (5)

НЦППБ 4172

ИПО 1696а

Псевдомонас сп. (4)

НЦППБ 4173

—

ПД 2318

Ауреобактерия сп. (5)

НЦППБ 4174

ИВИА 1844.06

Флавобактерии sp. (4) (5)

(b) Коммерчески доступный стандартизированный контрольный материал

Следующий стандартный контрольный материал доступен из коллекции культур NCPPB.

Лиофилизированные гранулы картофельного экстракта из 200 здоровых клубней картофеля в качестве отрицательного контроля для всех тестов.

Лиофилизированный осадок картофельного экстракта из 200 здоровых клубней картофеля, содержащий от 103 до 104 и от 104 до 106 клеток биовара 2 R. solanacearum (штамм NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) в качестве положительного контроля для серологических и ПЦР-тестов. Поскольку при лиофилизации снижается жизнеспособность клеток, они не подходят в качестве стандартных контролей для выделения или биоанализа.

Фиксированные формалином суспензии биовара 2 R. solanacearum (штамм NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) в концентрации 106 клеток на мл в качестве положительного контроля для серологических тестов.

B. Подготовка положительных и отрицательных контролей для основных скрининговых тестов PCR/IF и FISH.

Производят 48-часовую культуру вирулентного штамма R. solanacearum Race3/biovar2 (например, штамм NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) на базальной среде SMSA и суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере для получения плотности клеток приблизительно 2 × 108 КОЕ. за мл. Обычно его получают в виде слегка мутной суспензии, эквивалентной оптической плотности 0,15 при длине волны 600 нм.

Удалите сердцевины на пяточных концах 200 клубней, взятых из сорта с белой кожицей, который, как известно, не содержит R. solanacearum.

Обработайте пяточные кончики как обычно и ресуспендируйте осадок в 10 мл.

Приготовьте 10 стерильных микрофлаконов по 1,5 мл с 900 мкл ресуспендированного осадка.

Перенесите 100 мкл суспензии R. solanacearum в первый микропробирку. Вортекс.

Установите десятичные уровни загрязнения путем дальнейшего разведения в следующих пяти микропробирках.

Шесть загрязненных микропробирок будут использоваться в качестве положительного контроля. Четыре незагрязненных микропробирки будут использоваться в качестве отрицательного контроля. Промаркируйте микропробирки соответствующим образом.

Приготовьте аликвоты по 100 мкл в стерильных микрофлаконах емкостью 1,5 мл, получив таким образом девять повторов каждого контрольного образца. Хранить при температуре от –16 до –24 °C до использования.

Присутствие и количественное определение R. solanacearum в контрольных образцах должно быть сначала подтверждено ИФ.

Для теста ПЦР выполните экстракцию ДНК из положительных и отрицательных контрольных образцов с каждой серией тестовых образцов.

Для тестов IF и FISH выполняйте анализы положительных и отрицательных контрольных образцов в каждой серии тестовых образцов.

Для анализов IF, FISH и ПЦР R. solanacearum должен быть обнаружен как минимум в 106 и 104 клеток/мл положительного контроля, но не ни в одном из отрицательных контролей.

Приложение 4

Буферы для тестовых процедур

Общие сведения: неоткрытые стерилизованные буферы можно хранить до одного года.

1. Буферы для процедуры экстракции

1.1. Буфер для экстракции (50 мМ фосфатный буфер, pH 7,0)

Этот буфер используется для экстракции бактерий из растительных тканей путем гомогенизации или встряхивания.

Na2HPO4 (безводный)

4,26 г

Х2ПО4

2,72 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Дополнительные компоненты могут быть полезны следующим образом:

Цель

Количество (за л)

Люброл хлопья

Дефлокулянт (7)

0,5 г

Силиконовый пеногаситель постоянного тока

Антипенный агент (7)

1,0 мл

Тетранатрия пирофосфат

антиоксидант

1,0 г

Поливинилпирролидон-40000 (ПВП-40)

Связывание ингибиторов ПЦР

50 г

1.2. Пеллетный буфер (10 мМ фосфатный буфер, pH 7,2)

Этот буфер используется для ресуспендирования и разбавления экстрактов сердцевины пяточной части клубней картофеля после концентрирования в осадок центрифугированием.

Na2HPO4.12H2O

2,7 г

NaH2PO4.2H2O

0,4 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

2. Буферы для теста ПЧ

2.1. IF-буфер (10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2)

Этот буфер используется для разведения антител.

Na2HPO4.12H2O

2,7 г

NaH2PO4.2H2O

0,4 г

НаКЛ

8,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

2.2. IF-буфер-Tween

Этот буфер используется для мытья слайдов.

Добавьте 0,1 % Tween 20 в буфер IF.

2.3. Глицерин с фосфатным буфером, pH 7,6

Этот буфер используется в качестве горючей жидкости на окнах слайдов IF для усиления флуоресценции.

Na2HPO4.12H2O

3,2 г

NaH2PO4.2H2O

0,15 г

Глицерин

50 мл

Дистиллированная вода

100 мл

Решения для крепления, предотвращающие выцветание, имеются в продаже, например: Vectashield® (Vector Laboratories) или Citifluor® (Leica).

3. Буферы для непрямого теста ELISA.

3.1. Буфер для покрытия двойной прочности, pH 9,6.

Мы едим

6,36 г

Мы счастливы

11,72 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Сульфит натрия (0,2%) может быть добавлен в качестве антиоксиданта, если необходимо предотвратить накопление окисленных ароматических соединений.

3.2. 10X физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), pH 7,4

НаКЛ

80,0 г

Х2ПО4

2,0 г

Na2HPO4.12H2O

29,0 г

КСl

2,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

3.3. PBS-Твин

10X ПБС

100 мл

10 % Твин 20

5 мл

Дистиллированная вода

895 мл

3.4. Блокирующий (антителый) буфер (должен быть свежеприготовленным).

10X ПБС

10,0 мл

Поливинилпирролидон-44000 (ПВП-44)

2,0 г

10 % Твин 20

0,5 мл

Сухое молоко

0,5 г

Дистиллированная вода

приготовьте до 100 мл

3.5. Раствор субстрата щелочной фосфатазы, pH 9,8

Диэтаноламин

97 мл

Дистиллированная вода

800 мл

Перемешайте и доведите pH до 9,8 с помощью концентрированной HCl.

Доведите до 1 л дистиллированной водой.

Добавьте 0,2 г MgCl2.

Растворите 2 таблетки субстрата фосфатазы по 5 мг (Sigma) в 15 мл раствора.

4. Буферы для теста DASI ELISA

4.1. Буфер для покрытия, pH 9,6

Мы едим

1,59 г

Мы счастливы

2,93 г

Дистиллированная вода

1 000 мл

Растворите ингредиенты и проверьте pH 9,6.

4.2. 10X фосфатно-солевой буфер (PBS), pH от 7,2 до 7,4

NaCl

80,0 г

NaH2PO4.2 H2O

4,0 г

Na2HPO4.12H2O

27,0 г

Дистиллированная вода

1 000 мл

4.3. PBS-Твин

10X ПБС

50 мл

10 % Твин 20

5 мл

Дистиллированная вода

950 мл

4.4. Субстратный буфер, pH 9,8

Диэтаноламин

100 мл

Дистиллированная вода

900 мл

Перемешайте и доведите pH до 9,8 с помощью концентрированной HCl.

Приложение 5

Определение уровня загрязнения в тестах IF и FISH

Подсчитайте среднее количество типичных флуоресцентных клеток в поле зрения (с).

Подсчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на предметное стекло микроскопа (C).

С = с × С/с

где

"="

площадь поверхности окна многоточечного слайда

"="

площадь поверхности объективного поля

s = πi2/4G2K2

где

"="

коэффициент поля (варьируется от 8 до 24 в зависимости от типа окуляра)

"="

коэффициент трубки (1 или 1,25)

"="

увеличение объектива (100×, 40× и т.д.).

Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на мл ресуспендированного осадка (N).

N = C × 1 000/y × F

где

"="

объем ресуспендированной пеллеты на каждое окно

"="

коэффициент разбавления ресуспендированных гранул.

Приложение 6

Валидированные протоколы ПЦР и реагенты

Примечание. Предварительное тестирование должно обеспечивать воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 клеток R. solanacearum на мл экстракта образца.

Предварительное тестирование также не должно показывать ложноположительных результатов с использованием панели выбранных бактериальных штаммов (см. Приложение 3).

1. Протокол ПЦР Seal et al. (1993)

1.1. Олигонуклеотидные праймеры

Праймер Форвард ОЛИ-1

5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Обратный первый Y-2

5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Ожидаемый размер ампликона из матричной ДНК R. solanacearum = 288 п.н.

1.2. ПЦР-реакционная смесь

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

17,65 мкл

10-кратный буфер для ПЦР (8) (15 мМ MgCl2)

2,5 мкл

1X (1,5 мМ MgCl2)

Смесь дНТФ (20 мМ)

0,25 мкл

0,2 мм

OLI-1 Праймер (20 мкМ)

1,25 мкл

1 мкм

Праймер Y-2 (20 мкМ)

1,25 мкл

1 мкм

Taq-полимераза (5 ЕД/мкл) (8)

0,1 мкл

0,5 ЕД

Объем образца

2,0 мкл

Общий объем

25 мкл

1.3. Условия реакции ПЦР

Запустите следующую программу:

1 цикл:

(я)

2 минуты при 96 °C (денатурация матричной ДНК)

35 циклов:

(ii)

20 секунд при 94 °C (денатурация матричной ДНК)

(iii)

20 секунд при 68°С (отжиг праймеров)

(iv)

30 секунд при 72 °C (расширение копии)

1 цикл:

(в)

10 минут при 72 °C (окончательное удлинение)

(ви)

держать при 4 °C.

Примечание. Эта программа была оптимизирована для использования с термоциклером Perkin Elmer 9600. Изменение продолжительности этапов циклов (ii), (iii) и (iv) может потребоваться для использования с другими моделями.

1.4. Рестрикционный ферментный анализ ампликона.

Продукты ПЦР, амплифицированные из ДНК R. solanacearum, дают характерный полиморфизм длины рестрикционного фрагмента с ферментом Ava II после инкубации при 37°C.

2. Протокол ПЦР Пастрика и Майсса (2000).

2.1. Олигонуклеотидные праймеры

Капсюль передний Пс-1

5'- agt cga acg cca gcg ggg g -3'

Грунтовка обратная Пс-2

5'- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3'

Ожидаемый размер ампликона матричной ДНК R. solanacearum = 553 п.н.

2.2. ПЦР-реакционная смесь

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

16 025 мкл

10-кратный ПЦР-буфер (9)

2,5 мкл

1X (1,5 мМ MgCl2)

БСА (фракция V) (10 %)

0,25 мкл

0,1 %

смесь d-nTP (20 мМ)

0,125 мкл

0,1 мм

Праймер Ps-1 (10 мкМ)

0,5 мкл

0,2 мкм

Праймер Ps-2 (10 мкМ)

0,5 мкл

0,2 мкм

Taq-полимераза (5 ЕД/мкл) (9)

0,1 мкл

0,5 ЕД

Объем образца

5,0 мкл

Общий объем:

25,0 мкл

Н.Б. Первоначально оптимизирован для термоциклера MJ Research PTC 200 с полимеразой Gibco Taq.

Perkin Elmer AmpliTaq и буфер также можно использовать в тех же концентрациях.

2.3. Условия реакции ПЦР

Запустите следующую программу:

1 цикл:

(я)

5 минут при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

35 циклов:

(ii)

30 секунд при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

(iii)

30 секунд при 68 °С (отжиг праймеров)

(iv)

45 секунд при 72 °C (расширение копии)

1 цикл:

(в)

5 минут при 72 °C (окончательное удлинение)

(ви)

держать при 4 °C.

Примечание. Эта программа оптимизирована для использования с термоциклером MJ Research PTC 200. Изменение продолжительности этапов циклов (ii), (iii) и (iv) может потребоваться для использования с другими моделями.

2.4. Рестрикционный ферментный анализ ампликона.

Продукты ПЦР, амплифицированные из ДНК R. solanacearum, дают характерный полиморфизм длины рестрикционных фрагментов с помощью фермента Taq I после инкубации при 65 °C в течение 30 минут. Рестрикционные фрагменты, полученные из специфичного для R. solanacearum фрагмента, имеют размер 457 п.о. и 96 п.о.

3. Протокол мультиплексной ПЦР с внутренним ПЦР-контролем (Пастрик и др., 2002).

3.1. Олигонуклеотидные праймеры

Капсюль передний РС-1-Ф

5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'

Праймер обратный РС-1-Р

5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'

Капсюль передний НС-5-Ф

5'- ААС ТТА ААГ ГАА ТТГ ACG ГАА G -3'

Грунтовка обратная НС-6-Р

5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3'

Ожидаемый размер ампликона из матричной ДНК R. solanacearum = 718 п.н. (набор RS-праймеров)

Ожидаемый размер ампликона по внутреннему ПЦР-контролю 18S рРНК = 310 п.н. (набор NS-праймеров).

3.2. ПЦР-реакционная смесь

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

12 625 мкл

10-кратный ПЦР-буфер (10) (15 мМ MgCl2)

2,5 мкл

1X (1,5 мМ MgCl2)

БСА (фракция V) (10 %)

0,25 мкл

0,1 %

смесь d-nTP (20 мМ)

0,125 мкл

0,1 мм

Праймер РС-1-Ф (10 мкМ)

2,0 мкл

0,8 мкм

Праймер РС-1-Р (10 мкМ)

2,0 мкл

0,8 мкм

Праймер NS-5-F (10 мкМ) (11)

0,15 мкл

0,06 мкм

Праймер NS-6-R (10 мкМ) (11)

0,15 мкл

0,06 мкм

Taq-полимераза (5 ЕД/мкл) (10)

0,2 мкл

1,0 ЕД

Объем образца

5,0 мкл

Общий объем:

25,0 мкл

3.3. Условия реакции ПЦР

Запустите следующую программу:

1 цикл:

(я)

5 минут при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

35 циклов:

(ii)

30 секунд при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

(iii)

30 секунд при 58 °C (отжиг праймеров)

(iv)

45 секунд при 72 °C (расширение копии)

1 цикл:

(в)

5 минут при 72 °C (окончательное удлинение)

(ви)

держать при 4 °C.

3.4. Рестрикционный ферментный анализ ампликона.

Продукты ПЦР, амплифицированные из ДНК R. solanacearum, дают характерный полиморфизм длины рестрикционного фрагмента с ферментом Bsm I или изошизомером (например, Mva 1269 I) после инкубации при 65 °C в течение 30 минут.

4. Протокол ПЦР, специфичный для биовара R. solanacearum (Pastrik et al., 2001).

4.1. Олигонуклеотидные праймеры

Прямой капсюль Рс-1-Ф

5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'

Обратный праймер Rs-1-R

5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'

Обратный праймер Рс-3-Р

5'- ТТС ACG GCA AGA TCG CTC -3'

Ожидаемый размер ампликона матричной ДНК R. solanacearum:

с Rs-1-F/Rs-1-R = 718 п.н.

с Rs-1-F/Rs-3-R = 716 п.н.

4.2. ПЦР-реакционная смесь

(а)

ПЦР, специфичная для Биовара 1/2

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

12 925 мкл

10-кратный ПЦР-буфер (12)

2,5 мкл

1X (1,5 мМ MgCl2)

БСА (фракция V) (10 %)

0,25 мкл

0,1 %

Смесь d-NTP (20 мМ)

0,125 мкл

0,1 мм

Праймер Рс-1-Ф (10 мкМ)

2 мкл

0,8 мкм

Праймер Rs-1-R (10 мкМ)

2 мкл

0,8 мкм

Taq-полимераза (5 ЕД/мкл) (12)

0,2 мкл

1 ЕВ

Объем образца

5,0 мкл

Общий объем

25,0 мкл

(б)

ПЦР, специфичная для Биовара 3/4/5

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

14 925 мкл

10-кратный ПЦР-буфер (13)

2,5 мкл

1X (1,5 мМ MgCl2)

БСА (фракция V) (10 %)

0,25 мкл

0,1 %

Смесь дНТФ (20 мМ)

0,125 мкл

0,1 мм

Праймер Рс-1-Ф (10 мкМ)

1 мкл

0,4 мкм

Праймер Rs-3-R (10 мкМ)

1 мкл

0,4 мкм

Taq-полимераза (5 Ед/мкл) (13)

0,2 мкл

1 ЕВ

Объем образца

5,0 мкл

Общий объем

25,0 мкл

4.3. Условия реакции ПЦР

Запустите следующую программу для реакций, специфичных для биовара 1/2 и биовара 3/4/5:

1 цикл:

(я)

5 минут при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

35 циклов:

(ii)

30 секунд при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

(iii)

30 секунд при 58 °C (отжиг праймеров)

(iv)

45 секунд при 72 °C (расширение копии)

1 цикл:

(в)

5 минут при 72 °C (окончательное удлинение)

(ви)

держать при 4 °C.

Примечание. Эта программа была оптимизирована для использования с термоциклером MJ Research PTC 200. Изменение продолжительности этапов циклов (ii), (iii) и (iv) может потребоваться для использования с другими моделями.

4.4. Рестрикционный ферментный анализ ампликона.

Продукты ПЦР, амплифицированные из ДНК R. solanacearum с использованием праймеров Rs-1-F и Rs-1-R, дают характерный полиморфизм длины рестрикционного фрагмента с ферментом Bsm I или изошизомером (например, Mva 1269 I) после инкубации при 65 °C в течение 30 минут. . Продукты ПЦР, амплифицированные из ДНК R. solanacearum с использованием праймеров Rs-1-F и Rs-3-R, не имеют сайтов рестрикции.

5. Подготовка загрузочного буфера

5.1. Бромфеноловый синий (10 % исходный раствор)

Бромфеноловый синий

5 г

Дистиллированная вода (бидест)

50 мл

5.2. Загрузка буфера

Глицерин (86 %)

3,5 мл

Бромфеноловый синий (5,1)

300 мкл

Дистиллированная вода (бидест)

6,2 мл

6. 10X трис-ацетатный буфер с ЭДТА (TAE), pH 8,0.

Трис буфер

48,40 г

Ледяная уксусная кислота

11,42 мл

ЭДТА (динатриевая соль)

3,72 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Перед использованием разбавьте до 1X.

Также имеется в продаже (например, Invitrogen или эквивалент).

Приложение 7

Валидированные реагенты для теста FISH

1. Олигозонды

Специфический для R. solanacearum зонд OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'

Неспецифический эубактериальный зонд EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'

2. Фиксирующий раствор

(ВНИМАНИЕ! ФИКСАТИВ СОДЕРЖИТ ПАРАФОРМАЛЬДЕГИД, КОТОРЫЙ ЯВЛЯЕТСЯ ТОКСИЧНЫМ. НАДЕВАЙТЕ ПЕРЧАТКИ И НЕ ВДЫХАЙТЕ. РЕКОМЕНДУЕТСЯ РАБОТАТЬ В ВЫТЯЖИТЕЛЬНОМ ШКАФЕ.)

(я)

Нагрейте 9 мл воды молекулярного качества (например, сверхчистой воды (UPW)) примерно до 60 °C и добавьте 0,4 г параформальдегида. Параформальдегид растворяется после добавления 5 капель 1 н. NaOH и перемешивания магнитной мешалкой.

(ii)

Доведите pH до 7,0, добавив 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (PB; pH 7,0) и 5 капель 1 н. HCl. Проверьте pH с помощью индикаторных полосок и при необходимости отрегулируйте его с помощью HCl или NaOH. (ВНИМАНИЕ! НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ PH-МЕТР В РАСТВОРАХ С ПАРАФОРМАЛИДГИДОМ.)

(iii)

Отфильтруйте раствор через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и храните без пыли при температуре 4 °C до дальнейшего использования.

3. 3X Гибмикс

NaCl

2,7 М

Трис-HCl

60 мМ (рН 7,4)

ЭДТА (стерилизованная фильтрованием и автоклавированная)

15 мМ

При необходимости разбавьте до 1X.

4. Решение для гибридизации

1X Гибмикс

Додецилсульфат натрия (SDS)

0,01 %

формамид

30 %,

зонд EUB 338

5 нг/мкл

зонд ОЛИ-1 или ОЛИ-2

5 нг/мкл

Приготовьте количество раствора для гибридизации в соответствии с расчетами, приведенными в Таблице 1. Для каждого предметного стекла (содержащего 2 разных образца в двух экземплярах) требуется 90 мкл раствора для гибридизации. ВАЖНО: ФОРМАМИД ОЧЕНЬ ТОКСИЧЕН, ПОЭТОМУ НАДЕВАЙТЕ ПЕРЧАТКИ И ПРИНИМАЙТЕ НЕОБХОДИМЫЕ МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ!

Таблица 1 Рекомендуемые количества для приготовления гибридизационной смеси

Количество слайдов:

Стерильный УПВ

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3x гибридикс

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % паспорт безопасности

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

формамид

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Зонд EUB 338 (100 нг/мкл)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Зонд ОЛИ-1 или ОЛИ-2 (100 нг/мкл)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Общий объем (мкл)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Примечание. Все растворы, содержащие светочувствительные олигозонды, храните в темноте при температуре –20 °C.

Защищайте от прямых солнечных лучей или электрического света во время использования.

5. 0,1М Фосфатный буфер, pH 7,0

Na2HPO4

8,52 г

Х2ПО4

5,44 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Приложение 8

Культура баклажанов и томатов

Посейте семена томатов (Lycopersicon esculentum) или баклажанов (Solanum melongena) в пастеризованный семенной компост. Пересадите саженцы с полностью разросшимися семядолями (от 10 до 14 дней) в пастеризованный горшечный компост.

Баклажаны или помидоры перед инокуляцией следует выращивать в теплице при следующих условиях окружающей среды:

Продолжительность дня

14 часов или естественная продолжительность дня, если больше;

Температура

день 21 до 24 °С,

ночь от 14 до 18 °С.

Восприимчивый сорт томата

«Манимейкер»

Восприимчивый сорт баклажанов

"'Черная красота'"

Поставщики

см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Аманн, Р.И., Л. Крумхольц и Д.А. Шталь. 1990. Флуоресцентно-олигонуклеотидное зондирование целых клеток для детерминирующих, филогенетических и экологических исследований в микробиологии. Дж. Бактериол. 172: 762-770.

Анон. 1998. Директива Совета 98/57/EC от 20 июля 1998 г. о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Официальный журнал Европейских сообществ L235, 1-39.

Будазен, Ж., А.К. Ле Ру, К. Жози, П. Лабарр и Б. Жуан. 1999. Разработка праймеров, специфичных для деления Ralstonia solanacearum, и их применение для идентификации европейских изолятов. Европейский журнал патологии растений 105; 373-380.

Карузо П., Горрис М.Т., Камбра М., Паломо Дж.Л., Коллар Дж. и Лопес М.М. 2002. Обогатительный сэндвич с двойными антителами. Непрямой иммуноферментный анализ, в котором используются специфические моноклональные антитела для чувствительного обнаружения Ralstonia solanacearum в бессимптомных клубнях картофеля. Прикладная и экологическая микробиология, 68, 3634-3638.

Кук Д., Барлоу Э. и Секейра Л. 1989. Генетическое разнообразие Pseudomonas solanacearum: обнаружение полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов с помощью ДНК-зондов, которые определяют вирулентность и гиперчувствительную реакцию. Молекулярные взаимодействия растений и микробов 1: 113-121.

Эльфинстон Дж.Г., Хеннесси Дж., Уилсон Дж.К. и Стед, Д.Э. 1996. Чувствительность обнаружения Ralstonia solanacearum в экстрактах клубней картофеля. Бюллетень ЕОКЗР 26; 663-678.

Энглбрехт, М.К. (1994)Модификация полуселективной среды для выделения и количественного определения Pseudomonas solanacearum. В: AC Hayward (ред.) Информационный бюллетень о бактериальном увядании 10, 3–5. Австралийский центр международных сельскохозяйственных исследований, Канберра, Австралия.

Хейворд, AC 1964. Характеристики Pseudomonas solanacearum. Журнал прикладной бактериологии 27; 265-277.

Хейворд, А.К., Эль-Нашаар, Х.М., Нидеггер, У. и Де Линдо, Л. 1990. Изменение метаболизма нитратов в биоварах Pseudomonas solanacearum. Журнал прикладной бактериологии 69; 269-280.

10.

Ито, С., Ю. Усиджима, Т. Фуджи, С. Танака, М. Камея-Иваки, С. Ёсивара и Ф. Киши. 1998. Обнаружение жизнеспособных клеток Ralstonia solanacearum в почве с использованием полуселективной среды и метода ПЦР. Дж. Фитопатология 146; 379-3

11.

Янсе, Дж.Д. (1988)Метод обнаружения Pseudomonas solanacearum в бессимптомных клубнях картофеля и некоторые данные о его чувствительности и специфичности. Бюллетень OEPP/EPPO, Бюллетень 18, 343-351.

12.

Янсе, Дж. Д. 1991. Инфра- и внутривидовая классификация штаммов Pseudomonas solanacaerum с использованием анализа жирных кислот цельных клеток. Систематическая и прикладная микробиология 14; 335-345.

13.

Кельман, А. 1954. Связь патогенности Pseudomonas solanacearum с появлением колоний на тетразолиевой среде. Фитопатология 44; 693-695.

14.

Клемент З.; Рудольф, К. и Д.К. Песков, 1990. Методы фитобактериологии. Академическое издательство, Будапешт, 568 стр.

15.

Леллиотт, Р.А. и Стед, Д.Э. 1987. Методы диагностики бактериальных болезней растений. Blackwell Scientific Publications Ltd., Оксфорд. 216 стр.

16.

Лопес М.М., Горрис М.Т., Ллоп П., Куберо Дж., Вицедо Б., Камбра М., 1997. Селективное обогащение улучшает селективную изоляцию, серологическое и молекулярное обнаружение патогенных бактерий растений. В: Х.В. Дене и др. (ред.). Академическое издательство Клевер. стр. 117-121.

17.

Лоус, Ф.Дж., Фулбрайт, Д.В., Стивенс, К.Т. и Де Брёйн, Ф.Дж., 1994. Специфические геномные признаки фитопатогенных патоваров и штаммов Xanthomonas и Pseudomonas, полученные с помощью повторяющихся последовательностей и ПЦР. Прикладная и экологическая микробиология, 60, 2286–2295.

18.

Лоус, Ф.Дж., Фулбрайт, Д.В., Стивенс, К.Т. и Де Брёйн, Ф.Дж., 1995. Дифференциация геномной структуры с помощью повторной ПЦР-дактилоскопии для быстрой классификации Xanthomonas Campestris pv. везикатория. Фитопатология 85; 528-536.

19.

Опина, Н., Ф. Тавнер, Г. Холлоуэй, Дж.-Ф Ван, Т.-Х Ли, Р. Магиранг, М. Феган, А.С. Хейворд, В. Кришнапиллай, В.Ф. Хонг, Б.В. Холлоуэй, Дж.Н. Тиммис. 1997. Новый метод разработки видовых и штаммоспецифичных ДНК-зондов и праймеров для ПЦР для идентификации Burkholderia solanacearum (ранее Pseudomonas solanacearum). Как Пак. Дж. Мол. Биол. Биотехнология. 5; 19-33.

20.

Пастрик, К.Х. и Мейсс, Э. 2000. Обнаружение R. solanacearum в клубнях картофеля с помощью полимеразной цепной реакции. Дж. Фитопатология 148; 619-626.

21.

Пастрик, К.Х., Эльфинстон, Дж.Г. и Пукалл, Р. 2002. Анализ последовательностей и обнаружение Ralstonia solanacearum с помощью мультиплексной ПЦР-амплификации рибосомальной межгенной спейсерной области 16S-23S с внутренним положительным контролем. Европейский журнал патологии растений 108, 831-842.

22.

Робинсон-Смит А., Джонс П., Эльфинстон Дж.Г. и Форд, S.M.D. (1995)Продукция антител к Pseudomonas solanacearum, возбудителю бактериального увядания. Пищевая и сельскохозяйственная иммунология 7, 67-79.

23.

Шаад, В. 2001. Лабораторное руководство по идентификации фитопатогенных бактерий. Урон [Часов]. - 3. изд.; Сент-Пол, Миннесота: 373 стр.

24.

Сил, С.Э., Л.А. Джексон, J.P.W. Янг и М. Дж. Дэниелс. 1993. Обнаружение Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas Pickettii и бактерий заболеваний крови путем частичного секвенирования 16S рРНК: создание олигонуклеотидных праймеров для чувствительного обнаружения с помощью полимеразной цепной реакции. Дж. Генерал Микробиол. 139: 1587-1594.

25.

Смит, Дж. Дж., Оффорд, Л. К., Холдернесс, М. и Сэддлер, Г. С. 1995. Генетическое разнообразие расы 3 Burkholderia solanacearum (синоним Pseudomonas solanacearum) в Кении. Прикладная и экологическая микробиология 61; 4262-4268.

26.

Стед, Д.Э. 1992. Группировка фитопатогенов и некоторых других видов Pseudomonas. с использованием клеточных профилей жирных кислот. Международный журнал систематической бактериологии 42; 281-295.

27.

Тагави М., Хейворд А.К., Слай Л.И., Феган М. 1996. Анализ филогенетических взаимоотношений штаммов Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii и бактерий бананов, вызывающих заболевания крови, на основе последовательностей гена 16S рРНК. Международный журнал систематической бактериологии 46; 10-15.

28.

Ван дер Вольф, Дж.М., Бонантс, П.Дж.М., Смит, Дж.Дж., Хагенаар, М., Найхейс, Э., Ван Бекховен, Дж.Р.К., Сэддлер, Г.С., Тригалет, А., Фейяд, Р. 1998. Генетическое разнообразие расы Ralstonia solanacearum. 3 в Западной Европе по данным AFLP, RC-PFGE и повторной ПЦР. В: Прайор П., Аллен К. и Эльфинстоун Дж. (ред.) Бактериальное увядание: молекулярные и экологические аспекты. Шпрингер (Берлин), стр. 44-49.

29.

Веллер С.А., Эльфинстон Дж.Г., Смит Н., Стед Д.Э. и Бунэм, Н. 1999. Обнаружение штаммов Ralstonia solanacearum с использованием автоматического количественного анализа флуорогенной 5'-нуклеазы TaqMan. Прикладная и экологическая микробиология 66; 2853-2858.

30.

Вуллингс, Б.А., А.Р. ван Бёнинген, Дж. Д. Янсе и А. Д. Аккерманс. 1998. Обнаружение R. solanacearum, вызывающего коричневую гниль картофеля, путем флуоресцентной гибридизации in situ с зондами, нацеленными на 23s рРНК. Прил. Окружающая среда. Микробиол. 64: 4546-4554.

ПРИЛОЖЕНИЕ III

Для каждого подозрительного события, для которого был выявлен положительный результат в скрининговом тесте(ах) в соответствии с перечисленным растительным материалом и для всех других случаев соответствующими методами, изложенными в Приложении II, и подтверждение или опровержение путем завершения Ожидается, что указанные методы будут сохранены и надлежащим образом сохранены:

—

взяты пробы со всех клубней и, по возможности, со всех растений,

—

любой оставшийся экстракт и дополнительно подготовленный материал для скринингового теста(ов), например слайды иммунофлуоресценции,

—

всю соответствующую документацию,

до завершения указанных методов.

Сохранение клубней позволит при необходимости провести сортоиспытание.

В случае положительного подтверждения наличия организма следует обеспечить сохранение и соответствующую консервацию:

—

материал, указанный в пункте 1,

—

образец зараженного материала томата или баклажана, инокулированный экстрактом клубня или растения, при необходимости,

—

изолированная культура организма,

в течение как минимум одного месяца после процедуры уведомления в соответствии со статьей 5(2).

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

Элементы расследования, упомянутые в статье 5(1)(a)(i), должны включать, где это уместно:

(я)

места производства,

—

выращивание или выращивание картофеля, клонально родственного картофелю, у которого обнаружено заражение этим организмом,

—

выращивание или выращивание томатов, происходящих из того же источника, что и томаты, у которых обнаружено заражение этим организмом,

—

выращивание или выращивание картофеля или томатов, которые были помещены под официальный контроль из-за подозрения на появление микроорганизма,

—

выращивание или выращивание картофеля, клонально родственного картофелю, выращенному на местах производства, зараженных организмом,

—

выращивающие картофель или томаты и расположенные по соседству с зараженными местами производства, в том числе с такими местами производства, совместно использующими производственное оборудование и мощности напрямую или через общего подрядчика,

—

использование поверхностных вод для орошения или опрыскивания из любого источника, подтвержденного или предположительно зараженного этим организмом,

—

использование поверхностных вод для орошения или опрыскивания из источника, используемого совместно с местами производства, подтвержденными или предположительно зараженными организмом,

—

затоплены или были затоплены поверхностными водами, зараженными данным организмом или предположительно зараженными;

(ii)

поверхностные воды, используемые для орошения или опрыскивания или затопившие поля или места производства, подтвержденные как зараженные этим организмом.

ПРИЛОЖЕНИЕ V

Элементы, которые следует учитывать при определении степени вероятного загрязнения в соответствии со статьей 5(1)(a)(iii) и 5(1)(c)(iii), должны включать:

—

указанный растительный материал, выращенный на месте производства, обозначенном как загрязненный в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii),

—

место(а) производства, имеющее некоторую производственную связь с включенным в список растительным материалом, обозначенным как загрязненное в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii), включая места, совместно использующие производственное оборудование и помещения напрямую или через общего подрядчика,

—

внесенный в список растительный материал, произведенный в месте(ах) производства, указанном в предыдущем абзаце, или присутствующий в таком месте(ях) производства в течение периода, когда внесенный в список растительный материал был признан загрязненным в соответствии со статьей 5(1)(a) (ii) присутствовал на месте производства, указанном в первом абзаце,

—

помещения, осуществляющие обращение с перечисленным растительным материалом из мест производства, указанных в вышеуказанных абзацах,

—

любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или его части, а также любые другие предметы, включая упаковочный материал, которые могли вступить в контакт с включенным в список растительным материалом, обозначенным как загрязненный в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii),

—

любой из перечисленных растительных материалов, хранящихся в любых конструкциях или объектах, перечисленных в предыдущем абзаце, или находящихся в контакте с ними, до очистки и дезинфекции таких конструкций и объектов,

—

в результате исследования и испытаний в соответствии со Статьей 5(1)(a)(i) в случае картофеля - те клубни или растения, имеющие сестринское или родительское клональное родство, а в случае томата - те растения с тот же источник, что и внесенный в список растительный материал, признанный загрязненным в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii) и для которого, хотя они и могли иметь отрицательный результат на данный организм, представляется, что заражение вероятно через клональную связь. Сортовое тестирование может быть проведено для проверки идентичности загрязненных и клонально родственных клубней или растений,

—

место(а) производства перечисленного растительного материала, упомянутого в предыдущем абзаце,

—

место(а) производства перечисленного растительного материала с использованием воды для орошения или опрыскивания, которое было определено как загрязненное в соответствии со Статьей 5(1)(c)(ii),

—

перечисленный растительный материал, произведенный на полях, затопленных поверхностными водами, оказался загрязненным.

Элементы, которые следует учитывать при определении возможного распространения в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv) и 5(1)(c)(iii), должны включать:

(я)

в случаях, предусмотренных статьей 5(1)(a)(iv),

—

близость других мест производства, выращивающих указанное растительное сырье,

—

совместное производство и использование запасов семенного картофеля,

—

места производства, использующие поверхностные воды для орошения или опрыскивания перечисленного растительного материала, в случаях, когда существует или существовал риск стока поверхностных вод или затопления места(ов) производства, обозначенного как загрязненное в соответствии со статьей 5(1). )(а)(ii).

(ii)

в случаях, когда поверхностные воды были определены как загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(c)(ii):

—

место(а) производства, производящего внесенный в список растительный материал, прилегающее или подверженное риску затопления поверхностными водами, обозначенными как загрязненные,

—

любой отдельный оросительный бассейн, связанный с поверхностными водами, обозначенными как загрязненные,

—

водные объекты, связанные с поверхностными водами, отнесенными к загрязненным, с учетом:

—

направление и скорость потока воды, обозначенной как загрязненная,

—

наличие диких пасленовых растений-хозяев.

Уведомление, упомянутое в первом подпункте статьи 5(2), должно быть предоставлено следующим образом:

—

сразу после того, как присутствие организма было подтверждено лабораторным исследованием с использованием методов, изложенных в Приложении II, по крайней мере:

—

для картофеля,

(а)

название сорта лота,

(б)

тип (продукт, семена и т. д.) и, где применимо, категория семян,

—

для растений томата - название сорта партии и, если применимо, категория.

—

без ущерба для требований об уведомлении о подозрительном происшествии в Статье 4 (3), государство-член, в котором происшествие было подтверждено, должно, когда существует риск загрязнения списочного растительного материала из или в другие государства-члены ЕС , немедленно уведомить соответствующие государства-члены ЕС об информации, необходимой для соблюдения статьи 5 (3), например:

(а)

название сорта картофеля или партии томатов,

(б)

имя и адрес отправителя и грузополучателя,

(с)

дата поставки партии картофеля или томатов,

(г)

размер доставляемой партии картофеля или помидоров,

(е)

копия паспорта растения или, по крайней мере, номер паспорта растения, где это применимо, или, если применимо, регистрационный номер производителя или торговца, а также копия уведомления о доставке.

Комиссия должна быть немедленно уведомлена о предоставлении такой информации.

Подробная информация о дополнительном уведомлении, указанном во втором подпункте статьи 5(2), должна быть представлена следующим образом:

После завершения всех расследований по каждому делу:

(а)

дата подтверждения загрязнения,

(б)

краткое описание расследования, проведенного для определения источника и возможного распространения загрязнения, включая уровень взятого отбора проб,

(с)

информация об выявленных или предполагаемых источниках загрязнения,

(г)

сведения о степени обозначенного загрязнения, в том числе количество мест производства, а для картофеля - количество партий с указанием сорта, а в случае семенного картофеля - категории,

(е)

сведения о разграничении зон, в том числе количество мест производства, не признанных загрязненными, но включенных в зону,

(е)

сведения о назначении воды, включая название и расположение водного объекта, а также степень назначения/запрета на ирригацию,

(г)

для любой партии или партии растений томата, обозначенных как зараженные, сертификаты, предписанные в статье 13(1)(ii) Директивы 2000/29/EC, и номер паспорта в соответствии со списком в Приложении V, Часть A, Раздел I.2.2. согласно Директиве 2000/29/EC,

(час)

такую другую информацию, относящуюся к подтвержденной вспышке(ям), которую может потребовать Комиссия.

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

Положения, упомянутые в статье 6(1), должны быть следующими:

—

использовать в качестве корма для животных после термической обработки, чтобы исключить риск выживания организма,

или

—

утилизация на официально утвержденном специальном полигоне для утилизации отходов, на котором не существует идентифицируемого риска утечки организма в окружающую среду, например. через просачивание на сельскохозяйственные угодья или контакт с источниками воды, которые можно использовать для орошения сельскохозяйственных угодий,

или

—

сжигание,

или

—

промышленная обработка путем прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с официально утвержденными объектами утилизации отходов, для которых установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма, и с системой очистки и дезинфекции, по крайней мере, отъезжающих транспортных средств,

или

—

другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры и их обоснование должны быть доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.

Любые оставшиеся отходы, связанные с вышеуказанными вариантами и возникающие в результате их применения, должны быть утилизированы официально утвержденными методами в соответствии с Приложением VII к настоящей Директиве.

Надлежащее использование или утилизация внесенного в список растительного материала, упомянутого в статье 6(2), под контролем ответственных официальных органов соответствующего(их) государства(ов)-члена(ов) с надлежащей связью между ответственными официальными органами для обеспечения такого контроля в любое время. и одобрение ответственного официального органа государства-члена, в котором картофель должен быть упакован или переработан в отношении объектов по удалению отходов, указанных в первом и втором абзацах, должно быть:

(я)

для клубней картофеля,

—

использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для употребления в пищу, упакованного для непосредственной доставки и использования без переупаковки, на площадке, имеющей соответствующие сооружения для утилизации отходов. Картофель, предназначенный для посадки, можно обрабатывать только на одном и том же участке, если это делается отдельно или после очистки и дезинфекции.

или

—

использование в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для промышленной переработки и предназначенного для прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с соответствующими объектами по утилизации отходов и системой очистки и дезинфекции, по крайней мере, отъезжающих транспортных средств,

или

—

какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма и подлежит одобрению указанными ответственными официальными органами.

(ii)

для других частей растений, включая остатки стеблей и листвы,

—

разрушение,

или

—

какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; и при условии одобрения указанными ответственными официальными органами.

Соответствующими методами обеззараживания объектов, указанных в статье 6(3), должны быть очистка и, при необходимости, дезинфекция, исключающие опознаваемый риск распространения организма, и они должны применяться под надзором ответственных официальных органов государства-члены.

Ряд мер, которые должны быть реализованы государствами-членами в демаркированной зоне(ах), установленной в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv) и (c)(iii) и упомянутой в статье 6(4), должны включать:

4.1.

В случаях, когда места производства были признаны загрязненными в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii):

(а)

на поле или в единице выращивания защищенных сельскохозяйственных культур, обозначенных как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii), либо

(я)

в течение как минимум четырех лет выращивания после указанного загрязнения,

—

необходимо принять меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томата, а также других растений-хозяев организма, в том числе пасленовых сорняков,

—

Нельзя сажать:

—

клубни картофеля, растения или настоящие семена,

—

растения и семена томатов,

—

учитывая биологию организма,

—

другие растения-хозяева,

—

растения видов Brassica, для которых установлен риск выживания организма,

—

культуры, для которых установлен риск распространения микроорганизма;

—

в первый сезон выращивания картофеля или томатов, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, и при условии, что в ходе официальных проверок в течение как минимум двух последовательных проверок поле было признано свободным от добровольных растений картофеля, томата и других растений-хозяев, включая пасленовые сорняки. годы выращивания до посадки,

—

в отношении картофеля допускается производство только продовольственного картофеля,

—

в случае картофеля и томатов собранные клубни картофеля или растения томата, в зависимости от обстоятельств, должны быть проверены в соответствии с процедурой, подробно описанной в Приложении II;

—

в сезоне сбора урожая картофеля или томатов, следующем за сезоном, указанным в предыдущем абзаце, и после соответствующего цикла севооборота, который должен составлять не менее двух лет, если планируется выращивать семенной картофель, должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2(1). вестись;

или

(ii)

в течение пяти лет выращивания, следующих за годом указанного загрязнения,

—

должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томата, а также других естественных растений-хозяев организма, включая пасленовые сорняки,

—

Поле должно быть заложено и поддерживаться в течение первых трех лет либо под чистым паром, либо под зерновыми в зависимости от выявленного риска, либо на постоянном пастбище с частыми скашиваниями или интенсивным выпасом, либо в качестве травы для производства семян с последующей посадкой. в последующие два года с растениями, не являющимися хозяевами данного организма, для которых не выявлено риска выживания или распространения организма,

—

в случае картофеля допускается производство семенного или продовольственного картофеля,

—

собранные клубни картофеля или растения томата, в зависимости от обстоятельств, должны быть проверены в соответствии с процедурой, подробно описанной в Приложении II;

(б)

на всех других полях загрязненного места производства и при условии, что ответственные официальные органы удостоверятся в том, что риск, связанный с растениями картофеля-добровольца, растениями томата и другими естественными растениями-хозяевами организма, включая пасленовые сорняки, в соответствующих случаях, устранен:

—

в год вегетации, следующий за годом указанного загрязнения,

—

ни клубни картофеля, ни растения, ни настоящие семена, ни другие растения-хозяева организма не высаживаются,

или

—

в случае клубней картофеля сертифицированный семенной картофель можно высаживать только для производства продовольственных товаров,

—

в случае растений томата растения томата, выращенные из семян, соответствующих требованиям Директивы 2000/29/EC, могут быть посажены только для производства фруктов;

—

во второй год вегетации, следующий за годом указанного загрязнения,

—

в случае картофеля для производства семян или продовольственных товаров следует высаживать только сертифицированный семенной картофель или семенной картофель, официально проверенный на отсутствие бурой гнили и выращенный под официальным контролем на местах производства, кроме тех, которые указаны в 4.1,

—

в случае томатов – только растения томата, выращенные из семян, отвечающих требованиям Директивы 2000/29/EC, или, в случае вегетативного размножения, из растений томата, полученных из таких семян и выращенных под официальным контролем на местах производства, отличных от упомянутых. в 4.1, должны быть посажены для производства растений или фруктов;

—

по крайней мере в течение третьего года выращивания, следующего за годом указанного загрязнения,

—

в случае картофеля для производства семян или продовольственных товаров следует сажать только сертифицированный семенной картофель или семенной картофель, выращенный под официальным контролем из сертифицированного семенного картофеля,

—

в случае томатов для производства растений или фруктов должны высаживаться только растения томата, выращенные из семян, которые соответствуют требованиям Директивы 2000/29/EC, или растения томата, выращенные под официальным контролем из таких растений;

—

в каждый год выращивания, упомянутый в предыдущих абзацах, должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других растений-хозяев организма, встречающихся естественным путем, если таковые имеются, и в соответствующее время должна проводиться официальная проверка растущей культуры, и на каждом картофельном поле должно проводиться официальное тестирование собранного картофеля в соответствии с процедурой, указанной в Приложении II;

(с)

сразу после определения загрязнения в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii) и после первого последующего года выращивания:

—

все оборудование и складские помещения на месте производства, задействованные в производстве картофеля или томатов, должны быть очищены и, при необходимости, продезинфицированы с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3,

—

официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая их запрет, должен быть введен в случае необходимости, чтобы предотвратить распространение организма;

(г)

в единице выращивания защищенных культур, обозначенной как загрязненная в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii), где возможна полная замена питательной среды,

—

клубни картофеля, растения или настоящие семена или другие растения-хозяева организма, включая растения и семена томата, не должны высаживаться, если на производственной единице не были приняты официально контролируемые меры по уничтожению организма и удалению всего растительного материала-хозяина, в том числе, при по крайней мере, полную замену питательной среды, очистку и, при необходимости, дезинфекцию указанного агрегата и всего оборудования, а затем получение разрешения на производство картофеля или томатов от ответственных официальных органов,

—

при производстве картофеля эта продукция должна производиться из сертифицированного семенного картофеля или из мини-клубней или микрорастений, полученных из проверенных источников,

—

при производстве томатов это производство должно производиться из семян, соответствующих требованиям Директивы 2000/29/EC, или, в случае вегетативного размножения, из растений томата, полученных из таких семян и выращенных под официальным контролем,

—

Официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая их запрет, должен быть введен в случае необходимости, чтобы предотвратить распространение организма;

4.2.

В пределах демаркированной зоны, без ущерба для мер, подробно описанных в пункте 4.1, государства-члены должны:

(а)

сразу же после указанного загрязнения обеспечить, чтобы все оборудование и складские помещения в таких помещениях, используемые для производства картофеля или томатов, были очищены и продезинфицированы, при необходимости, с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3,

(б)

немедленно и в течение как минимум трех лет выращивания после указанного загрязнения:

(ба)

в случаях, когда демаркированная зона была определена в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv),

—

обеспечить надзор со стороны своих ответственных должностных лиц за помещениями, где выращивают, хранят или обращаются с клубнями картофеля или томатов, а также за помещениями, в которых эксплуатируется техника для производства картофеля или томатов по договору,

—

требовать посадки только сертифицированных семян или семян, выращенных под официальным контролем для всех культур картофеля в этой зоне, и проведения испытаний после сбора урожая семенного картофеля, выращенного в местах производства, определенных как вероятно загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(a)(iii) ,

—

требовать раздельной обработки запасов собранного семенного картофеля и продовольственных запасов во всех помещениях в пределах зоны или системы очистки и, при необходимости, дезинфекции, которая должна проводиться между обработками запасов семян и продовольственных запасов,

—

требовать посадки только растений томата, выращенных из семян, соответствующих требованиям Директивы 2000/29/EC, или, в случае вегетативного размножения, из растений томата, полученных из таких семян и выращенных под официальным контролем, для всех культур томатов в этой зоне,

—

провести официальный опрос, как подробно описано в статье 2(1);

(бб)

в случаях, когда поверхностные воды были определены как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(c)(ii) или включены в элементы возможного распространения организма в соответствии с пунктом 2 Приложения V,

—

проводить ежегодное обследование в подходящее время, включая отбор проб поверхностных вод и, при необходимости, растений-хозяев пасленовых в соответствующих источниках воды и тестирование в соответствии с соответствующими методами, изложенными в Приложении II, для внесенного в список растительного материала и для других случаев,

—

ввести официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая запрет на использование воды, признанной зараженной, для орошения и опрыскивания перечисленных растительных материалов и, при необходимости, других растений-хозяев, чтобы предотвратить распространение организма. Этот запрет может быть пересмотрен на основе результатов, полученных в ходе упомянутого ежегодного обследования, и его назначение может быть отменено, если ответственные официальные органы убедятся, что поверхностные воды больше не загрязнены. Использование воды, подпадающей под запрет, может быть разрешено под официальным контролем для орошения и опрыскивания растений-хозяев, если применяются официально утвержденные методы, которые уничтожают организм и предотвращают его распространение,

—

в случае загрязнения сбросов жидких отходов ввести официальный контроль за удалением сбросов твердых или жидких отходов предприятий промышленной переработки или упаковки, работающих с включенным растительным материалом;

(с)

разработать программу, где это возможно, для замены всех запасов семенного картофеля в течение соответствующего периода времени.

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

Официально утвержденные методы удаления отходов, упомянутые в пункте 1 Приложения VI, должны соответствовать следующим положениям, чтобы исключить любой идентифицируемый риск распространения организма:

(я)

Отходы картофеля и томатов (включая бракованный картофель, кожуру и помидоры) и любые другие твердые отходы, связанные с картофелем и томатами (включая почву, камни и другой мусор), должны утилизироваться либо:

—

утилизация на официально одобренном специальном полигоне для утилизации отходов, на котором не существует идентифицируемого риска утечки организма в окружающую среду, например через просачивание на сельскохозяйственные угодья или контакт с источниками воды, которые можно использовать для орошения сельскохозяйственных угодий. Отходы должны доставляться непосредственно на площадку в условиях локализации, исключающих риск потери отходов.

или

—

сжигание,

или

—

другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры должны быть доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.

(ii)

жидкие отходы: перед утилизацией жидкие отходы, содержащие взвешенные твердые вещества, должны быть подвергнуты процессам фильтрации или отстаивания для удаления таких твердых веществ. Эти твердые вещества подлежат удалению, как указано в подпункте (i).

В таком случае жидкие отходы должны быть либо:

—

нагреты минимум до 60 °C по всему объему в течение как минимум 30 минут перед утилизацией,

или

—

иным образом утилизируются при условии официального разрешения и под официальным контролем таким образом, чтобы не было идентифицируемого риска того, что отходы могут вступить в контакт с сельскохозяйственными угодьями или источниками воды, которые могут быть использованы для орошения сельскохозяйственных земель. Подробности об этом должны быть доведены до сведения других государств-членов ЕС и Комиссии.

Варианты, описанные в настоящем Приложении, также применимы к отходам, связанным с обращением, удалением и переработкой загрязненных партий.

' (1) См. Леллиотт и Стед (1987).

(2) Связаться с учеными: см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

(3) Использовать в качестве стандартного эталонного штамма биовар 2 R. solanacearum (раса 3).

(4) Потенциальный штамм, дающий перекрестную реакцию в серологических тестах (ИФ и/или ИФА) с поликлональными антисыворотками.

(5) Штамм, продукт ПЦР которого можно амплифицировать в некоторых лабораториях того же размера, что и ожидаемый, с использованием специфических праймеров OLI-1 и Y-2 (см. Приложение 6).

(6) Вероятно перекрёстная реакция в большинстве тестов, но известно, что она возникает только на бананах в Индонезии.

(7) Для использования с методом гомогенизационной экстракции.

(8) Метод был проверен с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.

(9) Методы были проверены с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.

Н.Б. Первоначально оптимизирован для термоциклера MJ Research PTC 200 с полимеразой Gibco Taq.

Perkin Elmer AmpliTaq и буфер также можно использовать в тех же концентрациях.

(10) Методы были проверены с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.

(11) Концентрация праймеров NS-5-F и NS-6-R была оптимизирована для экстракции сердцевины пяточного конца картофеля с использованием метода гомогенизации и очистки ДНК в соответствии с Пастриком (2000) (см. Раздел VI.A.6.1.a.) . Если будет использоваться экстракция встряхиванием или другие методы выделения ДНК, потребуется повторная оптимизация концентраций реагентов.

(12) Методы были проверены с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.

(13) Методы были проверены с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.

Вершина

Директива Комиссии 2006/63/EC от 14 июля 2006 г., вносящая поправки в Приложения II–VII Директивы Совета 98/57/EC о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Директива доступна на следующих языках

Директивы по годам