Директива Комиссии 2006/56/EC от 12 июня 2006 г., вносящая поправки в Приложения к Директиве Совета 93/85/EEC о борьбе с кольцевой гнилью картофеля

4 июля 2006 г.

В

Официальный журнал Европейского Союза

Л 182/1

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 2006/56/EC

от 12 июня 2006 г.

внесение изменений в Приложения к Директиве Совета 93/85/EEC о борьбе с кольцевой гнилью картофеля

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 93/85/EEC от 4 октября 1993 (1) о борьбе с кольцевой гнилью картофеля, и в частности, ее статью 12,

Тогда как:

(1)

Одним из важных организмов, вредных для картофеля, является Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ссп. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., возбудитель кольцевой гнили картофеля (далее именуемый «организм»).

(2)

Этот организм все еще встречается в некоторых частях Сообщества.

(3)

Директива Совета 93/85/EEC установила подробные меры, которые необходимо принять в государствах-членах против этого организма, чтобы определить его местонахождение и определить его распространение; предотвратить его возникновение и распространение; и в случае обнаружения предотвратить его распространение и контролировать его с целью искоренения.

(4)

С тех пор произошли значительные изменения в понимании биологии, процедурах обнаружения и идентификации организма; кроме того, практический опыт, полученный при контроле над организмом, требует пересмотра ряда технических положений, касающихся мер контроля.

(5)

В результате таких событий представляется необходимым пересмотреть и обновить меры, включенные в Приложения к Директиве 93/85/EEC.

(6)

Что касается процедур обнаружения и идентификации, в них включены недавно разработанные процедуры, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), а также усовершенствованы различные технические элементы текущей процедуры обнаружения и идентификации.

(7)

Что касается технических элементов мер контроля, улучшены положения по: способу сохранения протестированных образцов для обеспечения отслеживания организма, элементам, необходимым для определения степени вероятного загрязнения, деталям уведомления. о любом подтвержденном присутствии организма и соответствующей загрязненной зоны, меры, которые следует принять на производственных объектах, обозначенных как загрязненные, и в пределах демаркированных зон.

(8)

Меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по здоровью растений.

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Приложения к Директиве 93/85/EEC настоящим заменяются соответствующими текстами в Приложении к настоящей Директиве.

Статья 2

1.   Государства-члены ЕС должны принять и опубликовать не позднее 31 марта 2007 г. законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно передать Комиссии текст этих положений и таблицу корреляции между этими положениями и Директивой.

Они начнут применять эти положения с 1 апреля 2007 г.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в ​​случае их официальной публикации. Государства-члены ЕС должны определить, как следует делать такую ​​ссылку.

2.   Государства-члены должны немедленно сообщить Комиссии текст основных положений национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на третий день после ее публикации в Официальном журнале Европейского Союза.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 12 июня 2006 г.

Для Комиссии

Маркос Киприану

Член Комиссии

(1) OJ L 259, 18.10.1993, с. 2.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

ТЕСТ-СХЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИИ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ссп. СЕПЕДОНИК (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

ОБЪЕМ СХЕМЫ ИСПЫТАНИЙ

Представленная схема описывает различные процедуры, связанные с:

(я)

Диагностика кольцевой гнили клубней и растений картофеля;

(ii)

Обнаружение Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в пробах клубней и растений картофеля;

(iii)

Идентификация Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Оптимизированные протоколы для различных методов, проверенные реагенты и подробные сведения о подготовке тестовых и контрольных материалов представлены в Приложениях. Список лабораторий, участвовавших в оптимизации и валидации протоколов, представлен в Приложении 1.

Поскольку протоколы предусматривают выявление карантинного организма и будут включать использование жизнеспособных культур C. m. подвид sepedonicus в качестве контрольных материалов, необходимо будет выполнять процедуры в подходящих карантинных условиях с соответствующими объектами для удаления отходов и при наличии соответствующих лицензий, выданных официальными органами по карантину растений.

Параметры тестирования должны обеспечивать последовательное и воспроизводимое обнаружение уровней C. m. подвид sepedonicus при установленных пороговых значениях выбранных методов.

Точная подготовка положительных контролей является обязательным условием.

Тестирование в соответствии с требуемыми пороговыми значениями также подразумевает правильные настройки, техническое обслуживание и калибровку оборудования, бережное обращение и сохранение реагентов, а также все меры по предотвращению загрязнения между образцами, например: отделение положительного контроля от тестируемых образцов. Необходимо применять стандарты контроля качества, чтобы избежать административных и других ошибок, особенно в отношении маркировки и документации.

Предполагаемое событие, как указано в статье 4(2) директивы 93/85/EEC, подразумевает положительный результат диагностических или скрининговых тестов, проведенных на образце, как указано в блок-схемах.

Если первый скрининговый тест (IF или PCR/FISH) положительный, то подозревается заражение Cms и необходимо провести второй скрининговый тест. Если второй скрининговый тест положительный, то подозрение подтверждается (подозрение на возникновение) и тестирование по схеме необходимо продолжить. Если второй скрининговый тест отрицательный, то образец считается не контаминированным Cms.

Таким образом, положительный результат теста IF, упомянутый в статье 4(2), определяется положительным показателем IF, подтвержденным вторым скрининговым тестом (ПЦР/FISH).

Подтвержденное присутствие, как указано в статье 5(1) директивы 93/85/EEC, подразумевает выделение и идентификацию чистой культуры C. m. подвид sepedonicus с подтверждением патогенности.

1.   ПРЕЗЕНТАЦИЯ БЛОК-СХЕМЫ

1.1. Схема выявления кольцевой гнили клубней картофеля и растений картофеля с признаками кольцевой гнили

Методика испытаний предназначена для клубней и растений картофеля с симптомами, типичными или подозрительными на кольцевую гниль. Он предполагает экспресс-тест, выделение возбудителя из инфицированной сосудистой ткани на диагностических средах и в случае положительного результата идентификацию культуры как C. m. подвид сепедоник.

1.2. Схема обнаружения и идентификации Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в образцах бессимптомных клубней картофеля

Принцип

Процедура тестирования предназначена для выявления скрытых инфекций в клубнях картофеля. Положительный результат как минимум двух скрининговых тестов, основанных на разных биологических принципах, должен быть дополнен выделением возбудителя; с последующим, в случае выделения типичных колоний, подтверждением чистой культуры как C. m. подвид сепедоник. Положительного результата только одного из скрининговых тестов недостаточно, чтобы считать образец подозрительным.

Скрининговые тесты и изолирующие тесты должны обеспечивать порог обнаружения от 103 до 104 клеток/мл ресуспендированного осадка, включенного в качестве положительного контроля в каждую серию тестов.

1.3. Схема обнаружения и идентификации Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в образцах бессимптомных растений картофеля

2.   ВИЗУАЛЬНЫЙ ОБСЛЕДОВАНИЕ НА СИМПТОМЫ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ.

2.1. Картофельные растения

В европейских климатических условиях симптомы редко обнаруживаются в поле и часто только в конце сезона. Более того, симптомы часто маскируются или путаются с другими заболеваниями, старением или механическими повреждениями или с ними. Поэтому при полевых инспекциях можно легко пропустить симптомы. Симптомы увядания сильно отличаются от симптомов бурой гнили; увядание обычно происходит медленно и первоначально ограничивается краями листьев. Молодые зараженные листья часто продолжают разрастаться, хотя в зараженных зонах это происходит в меньшей степени. Это приводит к появлению листьев необычной формы. На листьях, пораженных закупоркой сосудистых тканей ниже по стеблю, часто появляются хлоротичные межреберные участки желтого или оранжевого цвета. Зараженные листочки, листья и даже стебли со временем могут погибнуть. Часто листья и клубни просто уменьшаются в размерах. Иногда растения отстают в росте. Цветные изображения ряда симптомов можно найти на веб-сайте http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2. Клубни картофеля

Самыми ранними симптомами являются небольшая стекловидность или прозрачность тканей вокруг сосудистой системы, особенно возле пяточного конца, без размягчения. Сосудистое кольцо на пяточном конце может быть немного темнее, чем обычно. Первым легко распознаваемым симптомом является то, что сосудистое кольцо приобретает желтоватый цвет, а при осторожном сдавливании клубня из сосудов выходят столбики сыроподобного вещества. Этот экссудат содержит миллионы бактерий. Может развиться побурение сосудистой ткани, и симптомы клубней на этой стадии аналогичны симптомам бурой гнили, вызываемой Ralstonia solanacearum. Сначала эти симптомы могут ограничиваться одной частью кольца, не обязательно вблизи пяточного конца, и могут постепенно распространяться на все кольцо. По мере прогрессирования инфекции происходит разрушение сосудистой ткани; внешняя кора может отделиться от внутренней коры. На поздних стадиях заражения на поверхности клубня появляются трещины, края которых часто красновато-коричневые. Недавно в Европе произошло несколько случаев, когда центральная кора гнила одновременно с сосудистым кольцом, что приводило к вторичной инвазии с внутренней полостью и некрозом. Вторичная грибковая или бактериальная инвазия может маскировать симптомы, и может быть трудно, если вообще возможно, отличить запущенные симптомы кольцевой гнили от других клубневых гнилей. Возможны нетипичные симптомы. Цветные изображения ряда симптомов можно найти на веб-сайте http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3.   ПОДГОТОВКА ПРОБ

3.1. Клубни картофеля

Примечание:

—

Стандартный размер выборки – 200 клубней на испытание. Более интенсивная выборка требует большего количества тестов на выборках такого размера. Большее количество клубней в образце приведет к ингибированию или затруднению интерпретации результатов. Однако эту процедуру можно удобно применять для образцов с количеством клубней менее 200, где доступно меньше клубней.

—

Валидация всех описанных ниже методов обнаружения основана на тестировании образцов из 200 клубней.

—

Описанный ниже экстракт картофеля также можно использовать для обнаружения бактерии коричневой гнили картофеля Ralstonia solanacearum.

Дополнительная предварительная обработка перед пробоподготовкой:

Промойте клубни. Используйте соответствующие дезинфицирующие средства (соединения хлора, если необходимо использовать ПЦР-тест для удаления возможной ДНК патогена) и моющие средства между каждым образцом. Высушите клубни на воздухе. Эта процедура промывки особенно полезна (но не обязательна) для образцов с избытком загрязнений, а также если необходимо провести ПЦР-тест или процедуру прямого выделения.

3.1.1. Чистым и продезинфицированным скальпелем или ножом для овощей удалите кожицу на пяточном конце каждого клубня, чтобы стала видна сосудистая ткань. Аккуратно вырежьте небольшой стержень сосудистой ткани на пяточном конце и сведите к минимуму количество несосудистой ткани (см. веб-сайт: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ основной)

Примечание:

Отложите клубни с подозрением на симптомы кольцевой гнили и проверьте отдельно.

Если при удалении сердцевины пяточного конца наблюдаются подозрительные признаки кольцевой гнили, клубень следует осмотреть визуально после разрезания возле пяточного конца. Любой разрезанный клубень с подозрением на симптомы следует подвергнуть субэризации при комнатной температуре в течение двух дней и хранить под карантином (при температуре от 4 до 10 °C) до завершения всех анализов. Все клубни в образце (включая клубни с подозрительными симптомами) следует хранить в соответствии с Приложением II.

3.1.2. Соберите сердцевины пяточных концов в неиспользованные одноразовые контейнеры, которые можно закрыть и/или опечатать (в случае повторного использования контейнеров их следует тщательно очистить и продезинфицировать хлорсодержащими соединениями). Предпочтительно, чтобы стержни пяточного конца обрабатывались немедленно. Если это невозможно, храните их в контейнере без добавления буфера в холодильнике не более 72 часов или не более 24 часов при комнатной температуре. Высыхание и опробковение кернов, а также рост сапрофитов во время хранения могут препятствовать обнаружению бактерии кольцевой гнили.

3.1.3. Обработайте сердцевины пяточного конца одной из следующих процедур:

(а)

накройте ядра достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 3) и перемешивайте на ротационном шейкере (от 50 до 100 об/мин) в течение четырех часов при температуре ниже 24 °C или в течение 16 – 24 часов в холодильнике,

или

(б)

гомогенизировать ядра с достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 3) либо в блендере (например, Waring или Ultra Thurax), либо путем измельчения в герметичном одноразовом мешке для мацерации (например, Stomacher или прочный полиэтилен Bioreba, 150 мм). × 250 мм; радиационная стерилизация) с использованием резинового молотка или подходящего шлифовального аппарата (например, Homex).

Примечание:

Риск перекрестного загрязнения образцов высок, если образцы гомогенизируют с помощью блендера. Примите меры предосторожности, чтобы избежать образования или разлива аэрозолей в процессе экстракции. Убедитесь, что для каждого образца используются свежестерилизованные лезвия и сосуды блендера. Если будет использоваться ПЦР-тест, избегайте переноса ДНК на контейнеры или измельчительные устройства. При использовании ПЦР рекомендуется измельчение в одноразовых мешках и использование одноразовых пробирок.

3.1.4. Декантировать надосадочную жидкость. В случае чрезмерной мутности проведите осветление либо путем медленного центрифугирования (при ускорении не более 180 g в течение 10 минут при температуре от 4 до 10 °C), либо с помощью вакуумной фильтрации (от 40 до 100 мкм), промывая фильтр дополнительным количеством (10 мл) буфер экстракции (Приложение 3).

3.1.5. Концентрируют бактериальную фракцию центрифугированием при 7 000 g в течение 15 минут (или 10 000 g в течение 10 минут) при температуре от 4 до 10 °C и удаляют надосадочную жидкость, не нарушая осадок.

3.1.6. Ресуспендируйте осадок в 1,5 мл буфера для осадка (Приложение 3). Используйте 500 мкл для проверки на C. m. подвид sepedonicus, 500 мкл для Ralstonia solanacearum и 500 мкл для справочных целей. Добавьте стерильный глицерин до конечной концентрации от 10 до 25 % (по объему) к 500 мкл эталонной аликвоты и к оставшейся тестируемой аликвоте, перемешайте на вортексе и храните при температуре от –16 до –24 °C (недели) или при температуре от 68 до – 86 °С (месяцы). Во время тестирования храните тестовые аликвоты при температуре от 4 до 10 °C.

Повторное замораживание и оттаивание нежелательно.

Если требуется транспортировка экстракта, обеспечьте доставку в холодильнике в течение 24–48 часов.

3.1.7. Крайне важно, чтобы все C. m. подвид sepedonicus положительные контроли и образцы обрабатываются отдельно во избежание контаминации. Это относится к слайдам IF и ко всем тестам.

3.2. Картофельные растения

Примечание:

Для обнаружения латентной C. m. подвид sepedonicus рекомендуется тестировать составные образцы. Эту процедуру можно удобно применять для составных образцов, содержащих до 200 частей штока. (При проведении обследований они должны основываться на статистически репрезентативной выборке исследуемой популяции растений.)

3.2.1. Чистым продезинфицированным ножом или секатором удалите сегмент длиной 1–2 см от основания каждого стебля, чуть выше уровня почвы.

Кратковременно продезинфицируйте сегменты стебля 70 % этанолом и сразу же промокните насухо на папиросной бумаге.

Соберите сегменты стебля в закрытый стерильный контейнер в соответствии со следующими процедурами отбора проб:

3.2.2. Обработайте сегменты стебля одной из следующих процедур: либо,

(а)

накройте сегменты достаточным объемом (приблизительно 40 мл) экстракционного буфера (Приложение 3) и перемешивайте на ротационном шейкере (от 50 до 100 об/мин) в течение четырех часов при температуре ниже 24 °C или в течение 16–24 часов в холодильнике,

или

(б)

обработать немедленно. Путем измельчения сегментов в прочном мешке для мацерации (например, Stomacher или Bioreba) с соответствующим объемом экстракционного буфера (Приложение 3) с использованием резинового молотка или соответствующего измельчительного устройства (например, Homex). Если это невозможно, храните сегменты стебля в холодильнике не более 72 часов или не более 24 часов при комнатной температуре.

3.2.3. Слейте супернатант после отстаивания в течение 15 минут.

3.2.4. Дальнейшее осветление экстракта или концентрирование бактериальной фракции обычно не требуется, но может быть достигнуто путем фильтрации и/или центрифугирования, как описано в разделах 3.1.4–3.1.6.

3.2.5. Разделите чистый или концентрированный экстракт образца на 2 равные части. Во время тестирования одну половину храните при температуре от 4 до 10 °C, а другую половину храните со стерильным глицерином, содержащим 10 – 25 % (по объему) при температуре от –16 до –24 °C (недели) или при температуре от –68 до –86 °C (месяцы). ) в случае необходимости дальнейшего тестирования.

4.   ЕСЛИ ТЕСТ

Принцип

Использование теста IF в качестве основного скринингового теста рекомендуется из-за его доказанной надежности для достижения требуемых пороговых значений.

Если тест IF используется в качестве основного скринингового теста и результат IF положительный, тест PCR или FISH должен быть выполнен в качестве второго скринингового теста. Если тест IF используется в качестве второго скринингового теста и результат IF положительный, для завершения анализа требуется дальнейшее тестирование в соответствии с блок-схемой.

Примечание:

Всегда используйте поликлональные антитела, если тест IF используется в качестве основного скринингового теста. В случае положительного результата IF с помощью поликлонального антитела дальнейший скрининг образца с помощью моноклонального антитела может обеспечить большую специфичность, но может быть менее чувствительным.

Используйте антитела к эталонному штамму C. m. подвид сепедоник. Рекомендуется определять титр для каждой новой партии антител. Титр определяют как наибольшее разведение, при котором происходит оптимальная реакция при тестировании суспензии, содержащей от 105 до 106 клеток на мл гомологичного штамма C. m. подвид sepedonicus и используя соответствующий конъюгат изотиоцианата флуоресцеина (FITC) в соответствии с рекомендациями производителя. Неочищенные поликлональные или моноклональные антитела должны иметь титр IF не менее 1:2000. Во время тестирования антитела следует использовать в рабочих разведениях (WD), близких к титру или соответствующих ему. Используйте проверенные антитела (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Тест следует проводить на свежеприготовленных экстрактах образцов. При необходимости его можно успешно провести на экстрактах, хранящихся при температуре от –68 до –86 °С в глицерине. Глицерин можно удалить из образца путем добавления 1 мл буфера для пеллет (Приложение 4), повторного центрифугирования в течение 15 минут при 7000 g и ресуспендирования в равном объеме буфера для пеллет. Зачастую в этом нет необходимости, особенно если образцы предметных стекол прикреплены к предметным стеклам путем обжига (см. 2.2).

Подготовьте отдельные слайды положительного контроля гомологичного штамма или любого другого эталонного штамма C. m. подвид sepedonicus, суспендированный в картофельном экстракте, как указано в Приложении 2, и, необязательно, в буфере.

Естественно инфицированную ткань (сохраненную путем лиофилизации или замораживания при температуре от –16 до –24 °C) следует использовать, где это возможно, в качестве аналогичного контроля на том же предметном стекле.

В качестве отрицательного контроля используйте аликвоты экстракта образца, который ранее дал отрицательный результат.

Используйте многолуночные предметные стекла для микроскопа предпочтительно с 10 окнами диаметром не менее 6 мм.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

4.1. Подготовьте тестовые слайды, выполнив одну из следующих процедур:

(я)

Для гранул с относительно небольшим осадком крахмала:

Внесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм, увеличивая объем для окон большего размера) ресуспендированного картофельного гранулята в разведении 1/100 в первое окно. Затем пипеткой внесите аналогичный объем неразбавленного осадка (1/1) в оставшиеся окна ряда. Вторая строка может использоваться как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 1.

(ii)

Для других пеллет:

Приготовьте десятичные разведения (1/10 и 1/100) ресуспендированного осадка в буфере для осадка. Отнесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм, увеличивая объем для окон большего размера) ресуспендированного осадка и каждого разведения в ряду окон. Вторая строка может использоваться как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 2.

4.2. Высушите капли при температуре окружающей среды или нагревая при температуре от 40 до 45 °C. Зафиксируйте бактериальные клетки на предметном стекле либо путем нагревания (15 минут при 60 °C), прокаливания 95 % этанолом, либо в соответствии со специальными инструкциями поставщиков антител.

При необходимости фиксированные предметные стекла можно затем хранить в замороженном виде в высушенном ящике в течение необходимого короткого времени (максимум до 3 месяцев) перед дальнейшим тестированием.

ЕСЛИ процедура:

(я)

Согласно подготовке тестовых слайдов в 4.1(i):

Подготовьте набор двукратных разведений антитела в буфере IF. В первой лунке должно быть 1/2 титра (Т/2), в остальных - 1/4 титра (Т/4), 1/2 титра (Т/2), титр (Т) и дважды титр (2T).

(ii)

Согласно подготовке предметных стекол в 4.1(ii):

Подготовьте рабочее разведение (WD) антитела в буфере IF. Рабочее разведение влияет на специфичность.

Рисунок 1.   Подготовка предметного стекла в соответствии с 4.1(i) и 4.3(i)

Разведения ресуспендированного осадка

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Разбавление ресуспендированного осадка

(Т = заголовок)

Т/2

Т/4

Т/2

Т

кот



Двукратные разведения антисыворотки/антитела

Образец 1

1

2

3

4

5

Дубликат образца 1 или образца 2.

6

7

8

9

10

Рисунок 2.   Подготовка предметного стекла в соответствии с 4.1(ii) и 4.3(ii)

Рабочее разведение антисыворотки/антитела

1/1

1/10

1/100

пустой

пустой



Десятичное разведение ресуспендированного осадка

Образец 1

1

2

3

4

5

Дубликат образца 1 или образца 2.

6

7

8

9

10

4.3.1. Разложите слайды на влажной бумаге. Полностью закройте каждое тестовое окно разведением(ями) антитела. Объем антитела, нанесенного на каждое окно, должен быть не меньше объема нанесенного экстракта.

Следующую процедуру следует проводить при отсутствии конкретных инструкций от поставщиков антител:

4.3.2. Инкубируйте предметные стекла на влажной бумаге под крышкой в ​​течение 30 минут при температуре окружающей среды (от 18 до 25 °C).

4.3.3. Стряхните капли с каждого предметного стекла и тщательно промойте буфером IF. Промойте, погрузив на 5 минут в буфер IF-Tween (Приложение 3), а затем на 5 минут в буфер IF. Избегайте попадания аэрозолей или капель, которые могут привести к перекрестному загрязнению. Осторожно удалите лишнюю влагу, аккуратно промокнув.

4.3.4. Разложите слайды на влажной бумаге. Закройте тестовые окна разведением конъюгата FITC, использованного для определения титра. Объем конъюгата, нанесенного на окна, должен быть идентичен объему нанесенного антитела.

4.3.5. Инкубируйте предметные стекла на влажной бумаге под крышкой в ​​течение 30 минут при температуре окружающей среды (от 18 до 25 °C).

4.3.6. Стряхните капли конъюгата со предметного стекла. Прополоскать и постирать, как указано выше (4.3.3).

Тщательно удалите лишнюю влагу.

4.3.7. Нанесите пипеткой от 5 до 10 мкл 0,1М фосфатно-буферного глицерина (Приложение 3) или имеющегося в продаже средства, препятствующего выцветанию, на каждое окно и нанесите покровное стекло.

Чтение теста IF:

4.4.1. Исследуйте предметные стекла на эпифлуоресцентном микроскопе с фильтрами, подходящими для возбуждения FITC, под масляной или водной иммерсией при увеличении от 500 до 1000. Сканируйте окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру. Для образцов, в которых клетки отсутствуют или имеют небольшое количество клеток, наблюдайте как минимум в 40 полях микроскопа.

Сначала проверьте слайд положительного контроля. Клетки должны быть ярко флуоресцентными и полностью окрашенными при определенном титре антител или рабочем разведении. Тест IF (раздел 4) необходимо повторить, если окрашивание отклоняется от нормы.

4.4.2. Наблюдайте за яркими флуоресцирующими клетками с характерной морфологией C. m. подвид sepedonicus в тестовых окнах тестовых слайдов (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интенсивность флуоресценции должна быть эквивалентна или выше, чем у штамма положительного контроля при том же разведении антител. Клетки с неполным окрашиванием или со слабой флуоресценцией следует игнорировать.

При подозрении на какое-либо загрязнение испытание необходимо повторить. Это может произойти в том случае, если на всех предметных стеклах в партии наблюдаются положительные клетки из-за загрязнения буфера или если на покрытии предметного стекла (за пределами окон предметного стекла) обнаружены положительные клетки.

4.4.3. Существует несколько проблем, связанных со специфичностью иммунофлуоресцентного теста. Фоновые популяции флуоресцирующих клеток с атипичной морфологией и перекрестно реагирующих сапрофитных бактерий размером и морфологией, сходными с C. m. sepedonicus, вероятно, встречаются в сердцевине пятки картофеля и сегментах стебля.

4.4.4. Рассматривайте только флуоресцирующие клетки типичного размера и морфологии при титре или рабочем разведении антител, как указано в 4.3.

4.4.5. Интерпретация показаний IF:

(я)

Если обнаружены яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией, оцените среднее количество типичных клеток на поле микроскопа и рассчитайте количество типичных клеток на мл ресуспендированного осадка (Приложение 4).

Показание IF является положительным для образцов, содержащих не менее 5 × 103 типичных клеток на мл ресуспендированного осадка. Образец считается потенциально загрязненным. и необходимы дальнейшие испытания.

(ii)

Показание IF является отрицательным для образцов с содержанием клеток менее 5 × 103 на мл ресуспендированного осадка, и образец считается отрицательным. Дальнейшее тестирование не требуется.

5.   ТЕСТ РЫБЫ

Принцип

Если тест FISH используется в качестве первого скринингового теста и оказывается положительным, тест IF должен выполняться в качестве второго обязательного скринингового теста. Если тест FISH используется в качестве второго скринингового теста и оказывается положительным, для завершения диагноза требуется дальнейшее тестирование в соответствии со схемой потока.

Примечание:

Используйте проверенный C. m. подвид sepedonicus-специфичные олигозонды (Приложение 7). Предварительное тестирование с помощью этого метода должно обеспечить воспроизводимое обнаружение не менее 103–104 клеток C. m. подвид sepedonicus на мл, добавленный к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат.

Описанную ниже процедуру предпочтительно следует выполнять со свежеприготовленным экстрактом образца, но ее также можно успешно выполнить с экстрактом образца, который хранился в глицерине при температуре от –16 до –24 °C или от –68 до –86 °C.

В качестве отрицательного контроля используйте аликвоты экстракта образца, который ранее дал отрицательный результат на C. m. подвид сепедоник.

В качестве положительного контроля готовят суспензии, содержащие от 105 до 106 клеток на мл C. m. подвид sepedonicus (например, штамм NCPPB 4053 или PD 406) в 0,01М фосфатном буфере (PB) из трех-пятидневной культуры (препарат см. в Приложении 2). Подготовьте отдельные слайды положительного контроля гомологичного штамма или любого другого эталонного штамма C. m. подвид sepedonicus, суспендированные в картофельном экстракте, как указано в Приложении 2.

Использование эубактериального олигозонда, меченного FITC, позволяет контролировать процесс гибридизации, поскольку он окрашивает все эубактерии, присутствующие в образце.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

5.1. Фиксация экстракта картофеля

Следующий протокол основан на Wullings et al., (1998):

5.1.1. Приготовьте фиксирующий раствор (см. Приложение 7).

5.1.2. Отнесите пипеткой по 100 мкл экстракта каждого образца в пробирку Эппендорфа и центрифугируйте в течение восьми минут при 7000 g.

5.1.3. Удалите надосадочную жидкость и растворите осадок в 500 мкл фиксатора, приготовленного менее чем за 24 часа назад. Перемешайте и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.

Альтернативным фиксатором является 96 % этанол. Для этого растворите осадок, полученный на этапе 5.1.2, в 50 мкл 0,01 М PB и 50 мкл 96 % этанола. Перемешайте на вортексе и инкубируйте при 4 °C в течение 30–60 минут.

5.1.4. Центрифуга в течение 8 мин. при 7000 g удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок в 75 мкл 0,01М PB (см. Приложение 3).

5.1.5. Нанесите 16 мкл фиксированной суспензии на чистое мультитестовое предметное стекло, как показано на рис. 3. Нанесите два разных образца на предметное стекло в неразведенном виде и используйте 10 мкл, чтобы получить разведение 1:100 (в 0,01 М ПБ). Оставшийся раствор образца (49 мкл) можно хранить при –20 °C после добавления 1 объема 96 % этанола. Если анализ FISH требует повторения, удалите этанол центрифугированием и добавьте равный объем 0,01 М PB (смешайте встряхиванием).

Рисунок 3.   Макет слайда FISH.

Образец 1

Пустой

Пустой

Пустой

Образец 2

окно 1

окно 2

окно 3

окно 4

окно 5

Образец 1

Пустой

Пустой

Пустой

Образец 2

окно 6

окно 7

окно 8

окно 9

окно 10

Покровное стекло 1

Покровное стекло 2

5.1.6. Высушите предметные стекла на воздухе (или в сушилке для предметных стекол при температуре 37 °C) и зафиксируйте их пламенем.

На этом этапе процедуру можно прервать и продолжить гибридизацию на следующий день. Слайды следует хранить в защищенном от пыли и сухом месте при комнатной температуре.

5.2. Прегибридизация и гибридизация

5.2.1. Приготовьте раствор лизоцима, содержащий 10 мг лизоцима (Sigma L-6876) в 10 мл буфера (100 мМ Трис-HCl, 50 мМ ЭДТА, pH 8,0). Этот раствор можно хранить, но его следует замораживать-оттаивать только один раз. Накройте лунку каждого образца примерно 50 мкл раствора лизоцима и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем окуните предметные стекла в деминерализованную воду только один раз и высушите фильтровальной бумагой.

Альтернативно, вместо лизоцима добавьте в каждую лунку по 50 мкл протеиназы K от 40 до 400 мкг/мл в буфере (20 мМ Трис-HCl, 2 мМ CaCl2, pH 7,4) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.

5.2.2. Обезвоживайте клетки с помощью ступенчатой ​​серии этанола 50 %, 80 % и 96 % в течение одной минуты каждая. Высушите слайды на воздухе в держателе слайдов.

5.2.3. Подготовьте влажную инкубационную камеру, накрыв дно воздухонепроницаемой коробки салфеткой или фильтровальной бумагой, пропитанной 1 гибридной смесью (Приложение 7). Предварительно инкубируйте коробку в печи для гибридизации при температуре 55 °C в течение не менее 10 минут.

5.2.4. Приготовьте раствор для гибридизации (Приложение 7), из расчета 45 мкл на предметное стекло, и предварительно инкубируйте в течение пяти минут при 55 °C.

5.2.5. Поместите предметные стекла на горячую пластину при температуре 45 °C и нанесите по 10 мкл раствора для гибридизации в каждую из четырех лунок на предметном стекле(ях).

5.2.6. Нанесите два покровных стекла (24 × 24 мм) на каждое предметное стекло, не задерживая воздух. Поместите предметные стекла в предварительно нагретую влажную камеру и гибридизуйте в течение ночи в духовке при температуре 55 °C в темноте.

5.2.7. Подготовьте три стакана, содержащие 1 л сверхчистой воды (UPW), 1 л 1x гибридной смеси (334 мл 3x гибридной смеси и 666 мл UPW) и 1 л 1/2x гибридной смеси (167 мл 3x гибридной смеси и 833 мл UPW). Предварительно инкубируйте каждый на водяной бане при температуре 55°C.

5.2.8. Снимите покровные стекла со слайдов и поместите слайды в держатель слайдов.

5.2.9. Смойте излишки зонда путем инкубации в течение 15 минут. в стакане с 1x гибридной смесью при 55 °C.

5.2.10. Перенесите держатель предметных стекол в 1/2 промывочного раствора Hybmix и инкубируйте еще 15 минут.

5.2.11. Ненадолго окуните предметные стекла в UPW и поместите их на фильтровальную бумагу. Удалите лишнюю влагу, аккуратно накрыв поверхность фильтровальной бумагой. Нанесите пипеткой от 5 до 10 мкл раствора для защиты от выцветания (например, Vectashield, Vecta Laboratories, Калифорния, США или эквивалент) на каждое окно и нанесите большое покровное стекло (24 × 60 мм) на все предметное стекло.

5.3. Чтение теста FISH

5.3.1. Немедленно осмотрите предметные стекла с помощью микроскопа, приспособленного для эпифлуоресцентной микроскопии с увеличением 630 или 1000 раз под иммерсионным маслом. С помощью фильтра, подходящего для флуоресцеинизотиоцианата (FITC), эубактериальные клетки (включая большинство грамотрицательных клеток) в образце окрашиваются флуоресцентным зеленым цветом. Используя фильтр для тетраметилродамин-5-изотиоцианата, окрашенные Cy3 клетки C. m. подвид sepedonicus выглядят флуоресцентно-красными. Сравните морфологию клеток с морфологией положительного контроля. Клетки должны быть ярко флуоресцентными и полностью окрашенными. Тест FISH (раздел 9.4) необходимо повторить, если окрашивание отклонено от нормы. Сканируйте окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру. Для образцов, в которых клетки отсутствуют или имеют небольшое количество клеток, наблюдайте как минимум в 40 полях микроскопа.

5.3.2. Наблюдайте за яркими флуоресцирующими клетками с характерной морфологией C. m. подвид sepedonicus в тестовых окнах тестовых слайдов (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интенсивность флуоресценции должна быть эквивалентна или выше, чем у штамма положительного контроля. Клетки с неполным окрашиванием или со слабой флуоресценцией следует игнорировать.

5.3.3. При подозрении на какое-либо загрязнение испытание необходимо повторить. Это может произойти в том случае, если на всех предметных стеклах в партии наблюдаются положительные клетки из-за загрязнения буфера или если на покрытии предметного стекла (за пределами окон предметного стекла) обнаружены положительные клетки.

5.3.4. Есть несколько проблем, присущих специфике теста FISH. Фоновые популяции флуоресцирующих клеток с атипичной морфологией и перекрестно реагирующих сапрофитных бактерий размером и морфологией, сходными с C. m. подвид sepedonicus может встречаться, хотя и гораздо реже, чем в тесте IF, в сердцевине пятки картофеля и сегментах стебля.

5.3.5. Рассматривайте только флуоресцирующие клетки типичного размера и морфологии, см. 5.3.2.

5.3.6. Интерпретация результата теста FISH:

(я)

Достоверные результаты теста FISH получаются, если ярко-зеленые флуоресцентные клетки размера и морфологии типичны для C. m. подвид sepedonicus наблюдаются при использовании фильтра FITC, а при использовании ярко-красных флуоресцентных клеток при использовании родаминового фильтра во всех положительных контролях, но не ни в одном из отрицательных контролей. Если обнаружены яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией, оцените среднее количество типичных клеток на поле микроскопа и рассчитайте количество типичных клеток на мл ресуспендированного осадка (Приложение 4). Образцы, содержащие не менее 5 × 103 типичных клеток на мл ресуспендированного осадка, считаются потенциально загрязненными. Требуется дальнейшее тестирование. Образцы с количеством типичных клеток менее 5 × 103 на мл ресуспендированного осадка считаются отрицательными.

(ii)

FISH-тест является отрицательным, если ярко-красные флуоресцентные клетки размером и морфологией типичны для C. m. подвид sepedonicus не наблюдаются при использовании родаминового фильтра при условии, что при использовании родаминового фильтра в препаратах положительного контроля наблюдаются типичные ярко-красные флуоресцентные клетки.

6.   ПЦР-ТЕСТ

Принципы

Если ПЦР-тест используется в качестве основного скринингового теста и оказывается положительным, тест IF должен выполняться в качестве второго обязательного скринингового теста. Если ПЦР-тест используется в качестве второго скринингового теста и оказывается положительным, для завершения диагноза требуется дальнейшее тестирование в соответствии с блок-схемой.

Полное использование этого метода в качестве основного скринингового теста рекомендуется только при наличии специального опыта.

Примечание:

Предварительное тестирование с помощью этого метода должно обеспечить воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 клеток C. m. подвид sepedonicus на мл, добавленный к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат. Во всех лабораториях могут потребоваться эксперименты по оптимизации для достижения максимального уровня чувствительности и специфичности.

Используйте проверенные реагенты и протоколы ПЦР. Предпочтительно выбрать метод с внутренним контролем.

Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения образца целевой ДНК. ПЦР-тест должен проводиться опытными специалистами в специализированных лабораториях молекулярной биологии, чтобы свести к минимуму возможность загрязнения целевой ДНК.

Отрицательные контроли (для процедур экстракции ДНК и ПЦР) всегда следует рассматривать как окончательные образцы в процедуре, чтобы выявить, произошел ли какой-либо перенос ДНК .

В ПЦР-тест должны быть включены следующие отрицательные контроли:

—

экстракт образца, который ранее дал отрицательный результат на C. m. подвид Сепедоник,

—

контрольные буферы, используемые для извлечения бактерий и ДНК из образца,

—

ПЦР-реакционная смесь.

Должны быть включены следующие положительные контроли:

—

аликвоты ресуспендированных гранул, в которых C. m. подвид добавлен sepedonicus (подготовку см. в Приложении 2),

—

суспензия 106 клеток на мл С. м. подвид sepedonicus в воде из вирулентного изолята (например, NCPPB 2140 или NCPPB 4053),

—

по возможности также используйте в ПЦР-тесте ДНК, выделенную из образцов положительного контроля.

Чтобы избежать потенциального загрязнения, подготовьте положительные контроли в отдельной среде от образцов, подлежащих тестированию.

Экстракты проб должны быть максимально очищены от почвы. Поэтому в некоторых случаях может быть целесообразно приготовить экстракты из промытого картофеля, если будут использоваться протоколы ПЦР.

6.1. Методы очистки ДНК

Используйте положительные и отрицательные контрольные образцы, как описано выше.

Подготовьте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

Доступны различные методы очистки целевой ДНК от сложных субстратов образца, таким образом удаляя ингибиторы ПЦР и других ферментативных реакций и концентрируя целевую ДНК в экстракте образца.

Следующий метод оптимизирован для использования с проверенным методом ПЦР, показанным в Приложении 6.

6.1.(a)   Метод по Пастрику (2000).

1.

Внесите пипеткой 220 мкл лизирующего буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА [pH 8,0]) в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл.

2.

Добавьте 100 мкл экстракта образца и поместите в нагревательный блок или на водяную баню при температуре 95 °C на 10 минут.

3.

Положите пробирку на лед на пять минут.

4.

Добавьте 80 мкл исходного раствора лизоцима (50 мг лизоцима на мл в 10 мМ трис-HCl, pH 8,0) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.

5.

Добавьте 220 мкл раствора Easy DNA® A (Invitrogen), хорошо перемешайте встряхиванием и инкубируйте при 65 °C в течение 30 минут.

6.

Добавьте 100 мкл раствора Easy DNA® B (Invitrogen), энергично встряхивайте до тех пор, пока осадок не начнет свободно течь в пробирке и образец не станет однородным вязким.

7.

Добавьте 500 мкл хлороформа и перемешивайте на вортексе до тех пор, пока вязкость не уменьшится и смесь не станет однородной.

8.

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 20 минут при 4 °C для разделения фаз и образования интерфазы.

9.

Перенесите верхнюю фазу в свежую пробирку Эппендорфа.

10.

Добавьте 1 мл 100 % этанола (–20 °C) на встряхивание и инкубируйте на льду в течение 10 минут.

11.

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 20 минут при 4 °C и удалите этанол из осадка.

12.

Добавьте 500 мкл 80 % этанола (–20 °C) и перемешайте, перевернув пробирку.

13.

Центрифугируйте при 15 000 g в течение 10 минут при 4 °C, сохраните осадок и удалите этанол.

14.

Дайте осадку высохнуть на воздухе или в вакууме DNA Speed.

15.

Ресуспендируйте осадок в 100 мкл стерильного UPW и оставьте при комнатной температуре минимум на 20 минут.

16.

Хранить при –20 °C до тех пор, пока не потребуется ПЦР.

17.

Центрифугируйте любой белый осадок и используйте 5 мкл супернатанта, содержащего ДНК, для ПЦР.

6.1.(b)   Другие методы

Могут быть применены другие методы экстракции ДНК (например, набор Qiagen DNeasy Plant Kit) при условии, что они доказали свою столь же эффективную очистку ДНК из контрольных образцов, содержащих от 103 до 104 клеток патогена на мл.

6.2. ПЦР

6.2.1. Подготовьте тестовые и контрольные шаблоны для ПЦР в соответствии с утвержденным протоколом (Приложение 6). Подготовьте одно десятичное разведение экстракта ДНК образца (1:10 в UPW).

6.2.2. Подготовьте соответствующую реакционную смесь для ПЦР в свободной от контаминации среде в соответствии с опубликованным протоколом (Приложение 6). Валидированный протокол ПЦР представляет собой мультиплексную реакцию, которая также включает внутренний ПЦР-контроль.

6.2.3. Добавьте 5 мкл экстракта ДНК на 25 мкл реакции ПЦР в стерильных пробирках для ПЦР.

6.2.4. Добавьте образец отрицательного контроля, содержащий только реакционную смесь ПЦР, и вместо образца добавьте тот же источник UPW, который использовался в смеси ПЦР.

6.2.5. Поместите пробирки в тот же термоциклер, который использовался при предварительном тестировании, и запустите соответствующим образом оптимизированную программу ПЦР (Приложение 6).

6.3. Анализ продукта ПЦР

6.3.1. Разрешите ампликоны ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Проведите по меньшей мере 12 мкл реакционной смеси амплифицированной ДНК из каждого образца, смешанного с 3 мкл загрузочного буфера (Приложение 6) в 2,0 % (масс./об.) агарозных гелях в трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфере (Приложение 6) при от 5 до 8 В на см. Используйте соответствующий ДНК-маркер, например. Лестница 100 б.п.

6.3.2. Выявите полосы ДНК путем окрашивания бромистым этидием (0,5 мг на л) в течение 30–45 минут, соблюдая соответствующие меры предосторожности при обращении с этим мутагеном.

6.3.3. Наблюдайте за окрашенным гелем при коротковолновом УФ-просвечивании (например, λ = 302 нм) на предмет амплифицированных продуктов ПЦР ожидаемого размера (Приложение 6) и документирования.

6.3.4. Для всех новых результатов/случаев проверяйте подлинность ампликона ПЦР, выполняя анализ ферментов рестрикции на образце оставшейся амплифицированной ДНК путем инкубации при оптимальной температуре и времени с соответствующим ферментом и буфером (см. Приложение 6). Распределите переваренные фрагменты с помощью электрофореза в агарозном геле, как указано выше, и наблюдайте характерную картину рестрикционных фрагментов при УФ-трансиллюминации после окрашивания бромидом этидия и сравните с непереваренным и переваренным положительным контролем.

Интерпретация результата ПЦР-теста:

ПЦР-тест отрицательный, если C. m. подвид sepedonicus-специфичный ПЦР-ампликон ожидаемого размера не обнаруживается для рассматриваемого образца, но выявляется для всех образцов положительного контроля (в случае мультиплексной ПЦР с праймерами внутреннего контроля, специфичными для растений: второй ПЦР-продукт ожидаемого размера должен быть амплифицирован с рассматриваемый образец).

ПЦР-тест положительный, если C. m. подвид sepedonicus-специфичный ПЦР-ампликон ожидаемого размера и характера рестрикции (при необходимости) обнаруживается при условии, что он не амплифицируется ни в одном из образцов отрицательного контроля. Надежное подтверждение положительного результата также можно получить, повторив тест со вторым набором праймеров для ПЦР (раздел 9.3).

Примечание:

Ингибирование ПЦР можно заподозрить, если ожидаемый ампликон получен из образца положительного контроля, содержащего C. m. подвид sepedonicus в воде, но отрицательные результаты получены при положительном контроле с C. m. подвид sepedonicus в экстракте картофеля. В протоколах мультиплексной ПЦР с внутренним контролем ПЦР ингибирование реакции указывается, когда ни один из двух ампликонов не получен.

Заражение можно заподозрить, если ожидаемый ампликон получен из одного или нескольких отрицательных контролей.

7.   БИОАНАЛИЗНЫЙ ТЕСТ

Примечание:

Предварительное тестирование с помощью этого метода должно обеспечить воспроизводимое обнаружение от 103 до 104 колониеобразующих единиц C. m. подвид sepedonicus на мл, добавленный к экстрактам образцов, которые ранее дали отрицательный результат (препарат см. в Приложении 2).

Наибольшую чувствительность обнаружения можно ожидать при использовании свежеприготовленного экстракта образца и оптимальных условиях роста. Однако метод можно успешно применять к экстрактам, хранившимся в глицерине при температуре от –68 до –86 °С.

Некоторые сорта баклажанов представляют собой прекрасную селективную обогатительную среду для роста C. m. подвид sepedonicus даже при отсутствии симптомов, а также являются отличным подтверждающим тестом на хозяина.

Условия роста должны быть оптимальными, чтобы снизить риск ложноотрицательных результатов теста.

Подробности о культурных традициях см. в Приложении 8.

7.1. Распределите всю оставшуюся тестируемую аликвоту ресуспендированного осадка из раздела 3.1.6 или 3.2.5 между баклажанами одним из методов, приведенных ниже (7.3 или 7.4). Используйте только растения на стадии второго-третьего листа до полного раскрытия третьего настоящего листа. Чтобы обеспечить полное использование ресуспендированного осадка, а также эффективную инокуляцию, для описанных ниже процедур потребуется от 15 до 25 баклажанов на образец.

7.2. Не поливайте баклажаны за один-два дня до инокуляции, чтобы снизить тургорное давление.

Щелевая прививка

7.3.1. Держа растение двумя пальцами, нанесите пипеткой каплю (примерно 5–10 мкл) взвешенного осадка на стебле между семядолями и первым листом.

7.3.2. С помощью стерильного скальпеля сделайте диагональный надрез длиной около 1,0 см и глубиной примерно 2/3 толщины стебля, начиная надрез от капли гранулы.

7.3.3. Заклейте разрез стерильным вазелином из шприца.

7.4. Прививка шприцем

Инокулируйте стебли баклажана чуть выше семядолей с помощью шприца с иглой для подкожных инъекций (не менее 23 G). Распределите образец между баклажанами.

7.5. В качестве положительного контроля инокулируют 5 растений водной суспензией от 105 до 106 клеток на мл известной культуры C. m. подвид sepedonicus и, где это возможно, естественно инфицированной тканью клубня (см. раздел 4) тем же методом инокуляции (7.3 или 7.4).

7.6. В качестве отрицательного контроля инокулируйте 5 растений стерильным буфером для гранул тем же методом инокуляции (7.3 или 7.4).

7.7. Инкубируйте растения в карантинных помещениях до четырех недель при температуре от 18 до 24 °C. Инкубируйте растения при достаточном освещении, высокой влажности (от 70 до 80 %) и воде, чтобы предотвратить заболачивание или увядание из-за дефицита воды. См. sepedonicus погибают при температуре выше 30°С, а оптимальная температура составляет 21°С. Во избежание загрязнения инкубируйте растения положительного и отрицательного контроля на четко разделенных скамьях в теплице или камере выращивания или, в случае ограниченного пространства, обеспечьте строгое разделение между обработками. Если растения для разных образцов необходимо инкубировать близко друг к другу, разделите их соответствующими экранами. При удобрении, поливе, осмотре и любых других манипуляциях соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать перекрестного заражения. Очень важно содержать теплицы и камеры выращивания свободными от насекомых-вредителей, поскольку они могут передавать бактерию от образца к образцу.

7.8. Регулярно проверяйте наличие симптомов, которые начинаются через неделю. Подсчитайте количество растений, у которых проявляются симптомы. См. подвид sepedonicus вызывает увядание листьев баклажанов, которое может начинаться с вялости краев или межжилок. Увядшая ткань может сначала выглядеть темно-зеленой или пятнистой, но затем становится бледнее, прежде чем стать некротической. Межжилковые увядания часто имеют жирный, пропитанный водой вид. Некротическая ткань часто имеет ярко-желтый край. Растения не обязательно погибают; чем дольше период до развития симптомов, тем больше шансов на выживание. Растения могут перерасти инфекцию. Молодые баклажаны гораздо более восприимчивы к низкой популяции C. m. подвид sepedonicus, чем более старые растения, поэтому необходимо использовать растения на стадии 3 листьев или непосредственно перед ней .

Увядание также может быть вызвано популяциями других бактерий или грибов, присутствующими в осадке ткани клубня. К ним относятся Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora и E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, а также большие популяции сапрофитных бактерий. В частности, Erwinia chrysanthemi может вызывать симптомы и увядание листьев, которые очень похожи на симптомы C. m. сепедоник. Единственное отличие – почернение стеблей при заражении Erwinia chrysanthemi. Другие увядания можно отличить от увяданий, вызванных C. m. подвид sepedonicus, поскольку целые листья или целые растения быстро увядают. Также можно приготовить окраску по Граму: этот тест позволит дифференцировать C. m. подвид sepedonicus из Erwinia spp.

7.9. При появлении симптомов у баклажанов следует провести повторную изоляцию, используя срезы увядшей ткани листьев или ткани стебля растений (см. мацерацию тканей в 3.1.3). Поверхность листьев и стеблей баклажанов дезинфицируют, протирая 70 % этанолом. Проведите IF-тест или ПЦР на соке баклажана и изолируйте на подходящей (селективной) среде (см. раздел 8). Также можно приготовить окраску по Граму (Приложение 9). Определить очищенные культуры предполагаемых C. m. подвид sepedonicus и подтвердите патогенность (см. раздел 9 и 10).

7.10. При определенных обстоятельствах, особенно если условия выращивания не являются оптимальными, C. m. подвид sepedonicus существовать в виде латентной инфекции в баклажанах даже после инкубационного периода до 4 недель. Если через 4 недели симптомы не наблюдаются, выполните ИФ/ПЦР на составном образце из срезов стебля толщиной 1 см каждого тестируемого растения, взятого над местом инокуляции. Если результат теста положительный, следует провести повторное выделение на подходящей (селективной) среде в соответствии с процедурой, описанной в разделе 8. Идентифицировать очищенные культуры предполагаемых C. m. подвид sepedonicus и подтвердите патогенность (разделы 9 и 10).

Интерпретация результатов биоанализа.

Действительные результаты биоанализа получаются, когда растения положительного контроля демонстрируют типичные симптомы, бактерии могут быть повторно выделены из этих растений, а на отрицательном контроле никаких симптомов не обнаружено.

Биоанализ отрицательный, если тест-растения не заражены C. m. подвид sepedonicus и при условии, что C. m. подвид sepedonicus обнаруживается в положительном контроле.

Биологический анализ считается положительным, если тестируемые растения заражены C. m. подвид сепедоник.

8.   ИЗОЛЯЦИЯ C. M. SUBSP. СЕПЕДОНИК

Примечание:

Диагностика завершается только в том случае, если C. m. подвид sepedonicus выделен, впоследствии идентифицирован (см. раздел 9). и подтверждено тестом на патогенность (раздел 10). Хотя К. м. подвид sepedonicus — требовательный организм, его можно выделить из симптоматической ткани.

Однако быстро растущие сапрофитные бактерии могут перерасти его, и, следовательно, выделение непосредственно из осадка ткани клубня или стебля (раздел 3.1.6 или 3.2.5) затруднено. При использовании селективной среды и соответствующем разбавлении ресуспендированного осадка из сердцевин пяточных концов или стеблей картофеля прямое выделение C. m. подвид sepedonicus может быть.

Изолирование должно быть сделано из всех клубней картофеля или сегментов стеблей с симптомами, а также из баклажанов, у которых не наблюдалось симптомов, но тест IF/PCR из составного образца был положительным (см. раздел 7.10). Мацерацию стеблей баклажанов при необходимости следует проводить, как описано в разделе 3.1.3.

В качестве положительного контроля готовят десятичные разведения из суспензии 106 КОЕ на мл С. м. подвид sepedonicus (например, NCPPB 4053 или PD 406). Во избежание любой возможности загрязнения подготавливайте положительные контроли, полностью отделенные от тестируемых образцов.

Для каждой вновь приготовленной партии селективной среды следует проверить ее пригодность для роста возбудителя, прежде чем она будет использована для тестирования рутинных образцов.

Испытайте контрольный материал таким же образом, как и образец(ы).

8.1. Селективное покрытие

8.1.1. Аликвоту объемом 100 мкл ресуспендированного образца картофельных гранул или сока баклажанов делают 10-кратные разведения в буфере для гранул (Приложение 3).

8.1.2. Выделение из неразбавленной картофельной гранулы обычно не удается из-за привередливости Cms к росту и конкуренции со стороны сапрофитов. Поскольку бактерия обычно присутствует в больших популяциях в инфицированных тканях, сапрофиты обычно растворяются, а патоген остается. Поэтому рекомендуется наносить по 100 мкл каждого из образцов в разведениях от 1/100 до 1/10 000 на среду MTNA или среду NCP-88 (Приложение 5) (при использовании чашек Петри диаметром 90 мм - отрегулируйте объем для альтернативной чашки). размеров), с использованием разбрасывателей (хоккейных клюшек) и техники разбрасывания пластин.

Примечание:

Альтернативная стратегия состоит в том, чтобы распределить первоначальную аликвоту картофельных гранул объемом 100 мкл на первую чашку с агаром с помощью разбрасывателя, а затем переместить разбрасыватель на вторую чашку с агаром, стирая штрихами любые остатки, оставшиеся на разбрасывателе; наконец, повторите это с третьей пластиной, создавая таким образом эффект разбавления с помощью распределителя.

8.1.3. Инкубируйте чашки в темноте при температуре от 21 до 23 °C.

8.1.4. Первоначальный осмотр чашек, включая, применительно к контрольным чашкам, подсчет любых C. m. подвид sepedonicus, колонии формируются через 3 дня, дальнейшие подсчеты проводятся через 5, 7 и, в конечном итоге, через 10 дней.

8.2. Очистка подозрительных колоний

Примечание:

Субкультивирование C. m. подвид sepedonicus-подобные колонии следует переносить на среду YGM для инокуляции баклажанов и/или последующей идентификации; делать это следует до того, как пластинки слишком разрастутся, т. е. желательно через три-пять дней.

8.2.1. Полоса C. м. подвид sepedonicus –подобные колонии на одну из следующих сред: (формулы приведены в Приложении 5):

питательный декстрозный агар (только для субкультивирования),

дрожжевой пептонно-глюкозный агар,

агар с дрожжевым экстрактом и минеральными солями.

Инкубируйте при температуре от 21 °C до 24 °C в течение 10 дней.

См. подвид sepedonicus растет медленно и обычно в течение 10 дней образует точечные кремовые куполообразные колонии. Фотографии типичных колоний C. m. подвид sepedonicus (см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Повторная полоса для установления чистоты.

Темпы роста улучшаются с помощью субкультуры. Типичные колонии кремово-белые или цвета слоновой кости, иногда желтые, округлые, гладкие, приподнятые, выпукло-купольные, слизисто-жидкие, с цельными краями и обычно диаметром от 1 до 3 мм.

Простое окрашивание по Граму (Приложение 9) может помочь выбрать колонии для дальнейшего тестирования.

8.2.3. Определите предполагаемые культуры (см. раздел 9) и проведите тест на патогенность (см. раздел 10).

9.   ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Определить чистые культуры предполагаемых C. m. подвид sepedonicus, используя по крайней мере два из следующих тестов, основанных на различных биологических принципах.

Включите известные эталонные штаммы, где это возможно, для каждого проведенного теста.

9.1. Пищевые и ферментативные идентификационные тесты

Определите следующие фенотипические свойства, которые повсеместно присутствуют или отсутствуют у C. m. подвид sepedonicus, по методам Леллиотта и Стеда (1987), Клемента и др. (1990), Шаад (2001), Аноним (1987).

Все среды следует инкубировать при температуре 21 °C и исследовать через шесть дней. Если роста не произошло, инкубируйте до 20 дней.

Все тесты должны включать известный C. m. контроль subsp.sepedonicus. Пищевые и физиологические тесты необходимо проводить с использованием инокулята из субкультур питательного агара. Морфологические сравнения необходимо проводить с культурами на питательном декстрозном агаре.

Тесты

Ожидаемый результат

Тест на окисление/ферментацию (OF)

Инертный или слабоокислительный

Оксидазная активность

–

Рост при 37 °C

–

Уреазная активность

–

Гидролиз эскулина

+

Гидролиз крахмала

- или слабый

Допуск 7 % NaCl

–

Производство индола

–

Каталазная активность

+

Производство H2S

–

Использование цитрата

–

Разжижение желатина

–

Кислый глицерин

–

Кислота из лактозы

- или слабый

Кислота из рамнозы

–

Кислота из салицина

–

Окраска по Граму (Приложение 9)

+

9.2. IF-тест

(а)

Приготовьте суспензию из примерно 106 клеток на мл в буфере IF (Приложение 3).

(б)

Приготовьте серию двукратных разведений соответствующей антисыворотки.

(с)

Примените процедуру ЕСЛИ (раздел 4).

(г)

Положительный результат теста IF достигается, если титр IF культуры эквивалентен титру положительного контроля.

9.3. ПЦР-тест

(а)

Подготовьте суспензию примерно 106 клеток на мл в сверхчистой воде (UPW).

(б)

Нагрейте 100 мкл клеточной суспензии в закрытых пробирках в нагревательном блоке или на кипящей водяной бане при температуре 100 °C в течение четырех минут. При необходимости добавление свежеприготовленного NaOH до конечной концентрации 0,05М может способствовать лизису клеток. Затем образцы можно хранить при температуре от –16 до –24 °C до тех пор, пока они не потребуются.

(с)

Примените соответствующие процедуры ПЦР для амплификации C. m. подвид sepedonicus (например, Pastrik, 2000; см. Приложение 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

(г)

Положительная идентификация C. m. subsp.sepedonicus достигается, если ПЦР-ампликоны имеют тот же размер и такой же полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, что и штамм положительного контроля.

9.4. РЫБНЫЙ тест

(а)

Подготовьте суспензию примерно 106 клеток на мл в UPW.

(б)

Примените процедуру FISH (раздел 5).

(с)

Положительный результат FISH-теста достигается, если в культуре и положительном контроле получены одинаковые реакции.

9.5. Профилирование жирных кислот (FAP)

(а)

Выращивайте культуру на триптиказо-соевом агаре (Оксоид) в течение 72 часов при 21 °C (+/– 1°).

(б)

Примените соответствующую процедуру FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

(с)

Положительный тест FAP достигается, если профиль предполагаемой культуры идентичен профилю положительного контроля. Присутствие характерных жирных кислот: Anteiso A 15:1, Iso 15:0, Anteiso 15:0, Iso 16:0, 16:0 и Anteiso 17:0 весьма показательно для C. m. сепедоник. Другие роды, такие как Curtobacterium, Arthrobacter и Micrococcus, также содержат некоторые из этих кислот, но в соотношении 15:1 Anteiso A является редкой кислотой у этих бактерий, но встречается у всех видов Clavibacter. от 1 до 5 %. В С. м. sepedonicus, это значение обычно составляет около 5 %.

9.6. БОКС-ПЦР

(а)

Подготовьте суспензию примерно 106 клеток на мл в UPW.

(б)

Примените тест в соответствии с процедурой (Smith et al., 2001).

10.   ПОДТВЕРЖДАЮЩИЙ ТЕСТ

Тест на патогенность должен быть выполнен в качестве окончательного подтверждения диагноза C. m. подвид sepedonicus и для оценки вирулентности культур, идентифицированных как C. m. подвид сепедоник:

10.1. Приготовьте инокулят с концентрацией приблизительно 106 клеток на мл из трехдневных культур тестируемого изолята и соответствующий штамм положительного контроля C. m. подвид сепедоник.

10.2. Инокулируйте 5–10 стеблей баклажанов молодых саженцев на стадии 3 листьев (раздел 7.3 или 7.4).

10.3. Инкубируйте при температуре от 18 до 24 °C при достаточном освещении и высокой относительной влажности с соответствующим поливом, чтобы избежать переувлажнения или стресса от засухи (раздел 7.7). В случае чистых культур типичное увядание должно наблюдаться в течение двух недель, однако растения, не проявляющие симптомов (см. раздел 7.8) по истечении этого времени, следует инкубировать в течение трех недель при температурах, способствующих росту баклажанов, но не превышающих 25 °C (Приложение 8). Если через три недели симптомы отсутствуют, посев не может быть подтвержден как патогенная форма C. m. подвид сепедоник.

10.4. Изолируйте от растений с симптомами, удалив часть стебля на 2 см выше точки инокуляции. Измельчите и суспендируйте в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды или 50 мМ фосфатного буфера (Приложение 3). Изолируют из суспензии путем нанесения разведения или нанесения штрихов на MTNA и YPGA (Приложение 5), инкубируют в течение трех-пяти дней при температуре от 21 до 23 °C и наблюдают за образованием колоний, типичных для C. m. подвид сепедоник.

Приложение 1

Лаборатории, занимающиеся оптимизацией и проверкой протоколов

Лаборатория (1)

Расположение

Страна

Агентство здравоохранения и продовольственной безопасности

Вена и Линц

Австрия

Департамент защиты растений

Мерелбеке

Бельгия

Дирекция завода

Люнгбю

Дания

Центральная научная лаборатория

Йорк

Англия

Шотландское агентство сельскохозяйственных наук

Эдинбург

Шотландия

Национальная лаборатория защиты растений, отделение бактериологии

Анже

Франция

Национальная лаборатория защиты растений, Картофельная карантинная станция

Реу

Франция

Федеральный биологический институт

Кляйнмахнов

Германия

Ганноверское управление по защите растений

Ганновер

Германия

Государственная лаборатория

Дублин

Ирландия

Служба защиты растений

Вагенинген

Нидерланды

Норвежский научно-исследовательский институт растениеводства, Центр защиты растений

Аас

Норвегия

Главное управление охраны культуры

Лиссабон

Португалия

Национальный институт биологии

Любляна

Словения

Диагностический центр Альдеаррубия

Саламанка

Испания

(1)  Связаться с учеными: см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Приложение 2

Подготовка положительных и отрицательных контролей для основных скрининговых тестов PCR/IF и FISH.

Получите 72-часовую культуру вирулентного штамма C. m. подвид sepedonicus (NCPPB 4053 или PD 406) на базальной среде MTNA и суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере до получения плотности клеток приблизительно от 1 до 2 × 108 КОЕ на мл. Обычно его получают в виде слегка мутной суспензии, эквивалентной оптической плотности 0,20 при длине волны 600 нм.

Удалите сердцевины на пяточных концах 200 клубней, взятых из сорта с белой кожицей, который, как известно, свободен от C. m. подвид сепедоник.

Обработайте пяточные кончики как обычно и ресуспендируйте осадок в 10 мл.

Приготовьте 10 стерильных микрофлаконов по 1,5 мл с 900 мкл ресуспендированного осадка.

Переносят 100 мкл суспензии C. m. подвид sepedonicus к первому микропробирке. Вортекс.

Установите десятичные уровни загрязнения путем дальнейшего разведения в следующих пяти микропробирках.

Шесть загрязненных микропробирок будут использоваться в качестве положительного контроля. Четыре незагрязненных микропробирки будут использоваться в качестве отрицательного контроля. Маркируйте микропробирки соответствующим образом.

Приготовьте аликвоты по 100 мкл в стерильных микрофлаконах емкостью 1,5 мл, получив таким образом девять повторов каждого контрольного образца. Хранить при температуре от –16 до –24 °C до использования.

Присутствие и количественное определение C. m. подвид sepedonicus в контрольных образцах должна быть сначала подтверждена ИФ.

Для теста ПЦР выполните экстракцию ДНК из положительных и отрицательных контрольных образцов с каждой серией тестовых образцов.

Для тестов IF и FISH выполняйте анализы положительных и отрицательных контрольных образцов в каждой серии тестовых образцов.

Для анализов IF, FISH и ПЦР C. m. подвид sepedonicus должен быть обнаружен как минимум в 106 и 104 клеток/мл положительного контроля, но не ни в одном из отрицательных контролей.

Приложение 3

Буферы для тестовых процедур

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ: Неоткрытые стерилизованные буферы можно хранить до одного года.

1.   Буферы для процедуры экстракции

1.1. Буфер для экстракции (50 мМ фосфатный буфер, pH 7,0)

Этот буфер используется для экстракции бактерий из растительных тканей путем гомогенизации или встряхивания.

Na2HPO4 (безводный)

4,26 г

Х2ПО4

2,72 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Дополнительные компоненты могут быть полезны следующим образом:

Цель

Количество (за л)

Люброл хлопья

Дефлокулянт (1)

0,5 г

Силиконовый пеногаситель постоянного тока

Противопенный агент (1)

1,0 мл

Тетранатрия пирофосфат

антиоксидант

1,0 г

Поливинилпирролидон-40 000 (ПВП-40)

Связывание ингибиторов ПЦР

50 г

1.2. Пеллетный буфер (10 мМ фосфатный буфер, pH 7,2)

Этот буфер используется для ресуспендирования и разбавления экстрактов сердцевины пяточной части клубней картофеля после концентрирования в осадок центрифугированием.

Na2HPO4.12H2O

2,7 г

NaH2PO4.2H2O

0,4 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

2.   Буферы для теста ПЧ

2.1. IF-буфер (10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2)

Этот буфер используется для разведения антител.

Na2HPO4.12H2O

2,7 г

NaH2PO4.2H2O

0,4 г

NaCl

8,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

2.2. IF-буфер-Tween

Этот буфер используется для мытья слайдов.

Добавьте 0,1 % Tween 20 в буфер IF.

2.3. Глицерин с фосфатным буфером, pH 7,6

Этот буфер используется в качестве горючей жидкости на окнах слайдов IF для усиления флуоресценции.

Na2HPO4.12H2O

3,2 г

NaH2PO4.2H2O

0,15 г

Глицерин

50 мл

Дистиллированная вода

100 мл

Решения для крепления, предотвращающие выцветание, имеются в продаже, например: Vectashield® (Vector Laboratories) или Citifluor® (Leica).

(1)  Для использования с методом гомогенизационной экстракции.

Приложение 4

Определение уровня загрязнения в тестах IF и FISH

1.

Подсчитайте среднее количество типичных флуоресцентных клеток в поле зрения (в)

2.

Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на предметное стекло микроскопа (С)

С = с × С/с

где

С

"="

площадь поверхности окна многоточечного предметного стекла и

с

"="

площадь поверхности объективного поля.

s = πi2/4G2K2

где

я

"="

коэффициент поля (варьируется от 8 до 24 в зависимости от типа окуляра)

К

"="

коэффициент трубки (1 или 1,25)

г

"="

увеличение объектива (100х, 40х и т.д.).

3.

Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на мл ресуспендированного осадка (N).

N = C × 1 000/y × F

где

й

"="

объем ресуспендированной гранулы на каждом окне, и

Ф

"="

коэффициент разбавления ресуспендированного осадка.

Приложение 5

Среды для выделения и культивирования C. m. подвид сепедоник

(a)   Общие среды роста

Питательный агар (НА)

Питательный агар (Дифко)

23,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин.

Питательный декстрозный агар (NDA)

Питательный агар Difco bacto, содержащий 1 % D(+) глюкозы (моногидрат). Стерилизовать автоклавированием при температуре 115 °C в течение 20 минут.

Дрожжево-пептонно-глюкозный агар (ЙОГА)

Дрожжевой экстракт (Difco)

5,0 г

Бакто-Пептон (Дифко)

5,0 г

D(+) Глюкоза (моногидрат)

10,0 г

Бакто-агар (Дифко)

15,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин.

Среда с минеральными солями дрожжевого экстракта (YGM)

Бакто-дрожжевой экстракт (Difco)

2,0 г

D(+) Глюкоза (моногидрат)

2,5 г

К2HPO4

0,25 г

Х2ПО4

0,25 г

MgSO4.7H2O

0,1 г

MnSO4.H2O

0,015 г

NaCl

0,05 г

Фесох.7Х2О

0,005 г

Бакто-агар (Дифко)

18 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты и стерилизуйте 0,5-литровые объемы среды автоклавированием при 115 °C в течение 20 минут.

(b)   Проверенные селективные питательные среды

MTNA среда

Если не указано иное, все мультимедийные компоненты произведены BDH.

Дрожжевой экстракт (Difco)

2,0 г

Маннитол

2,5 г

К2HPO4

0,25 г

Х2ПО4

0,25 г

NaCl

0,05 г

MgSO4.7H2O

0,1 г

MnSO4.H2O

0,015 г

Фесох.7Х2О

0,005 г

Агар (Оксоид №1)

16,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты, доведите pH до 7,2. После автоклавирования (при 121°С в течение 15 минут) и охлаждения до 50°С добавляют антибиотики: триметоприм 0,06 г, налидиксовую кислоту 0,002 г, амфотерицин Б 0,01 г.

Исходные растворы антибиотиков: триметоприм (Sigma) и налидиксовая кислота (Sigma) (обе в концентрации 5 мг/мл) в 96 % метаноле, амфотерицин B (Sigma) (1 мг/мл) в диметилсульфоксиде. Маточные растворы стерилизуют фильтрованием.

Примечание:

Срок годности базальной среды составляет три месяца. После добавления антибиотиков срок годности составляет один месяц при хранении в холодильнике.

NCP-88 средний

Питательный агар (Дифко)

23 г

Дрожжевой экстракт (Difco)

2 г

D-маннитол

5 г

К2HPO4

2 г

Х2ПО4

0,5 г

MgSO4.7H2O

0,25 г

Дистиллированная вода

1,0 л

Растворите ингредиенты, доведите pH до 7,2. После автоклавирования и охлаждения до 50 °С добавляют следующие антибиотики: полимиксина В сульфат (Sigma) 0,003 г, налидиксовую кислоту (Sigma) 0,008 г, циклогексимид (Sigma) 0,2 г.

Антибиотики растворяют в исходных растворах следующим образом: налидиксовую кислоту в 0,01 М NaOH, циклогексимид в 50 % этаноле, сульфат полимиксина В в дистиллированной воде. Маточные растворы стерилизуют фильтрованием.

Примечание:

Срок годности базальной среды составляет три месяца. После добавления антибиотиков срок годности составляет один месяц при хранении в холодильнике.

Приложение 6

Валидированный протокол ПЦР и реагенты

Примечание:

Предварительное тестирование должно обеспечить воспроизводимое обнаружение не менее 103–104 клеток C. m. sepedonicus на мл экстракта образца.

Предварительное тестирование также не должно показывать ложноположительных результатов с использованием панели выбранных бактериальных штаммов.

1.   Протокол мультиплексной ПЦР с внутренним ПЦР-контролем (Пастрик, 2000).

1.1. Олигонуклеотидные праймеры

Праймер прямой ПСА-1

5'- ctc ctt gtg ggg tgg гаа гг -3'

Обратный праймер PSA-R

5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'

Капсюль передний НС-7-Ф

5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'

Праймер обратный NS-8-R

5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’

Ожидаемый размер ампликона C. m. подвид sepedonicus матричная ДНК = 502 п.о. (набор праймеров PSA).

Ожидаемый размер ампликона по внутреннему контролю ПЦР 18S рРНК = 377 п.о. (набор NS-праймеров).

1.2. ПЦР-реакционная смесь

Реагент

Количество на реакцию

Конечная концентрация

Стерильный УПВ

15 725 мкл

10-кратный буфер для ПЦР (1) (15 мМ MgCl2)

2,5 мкл

1x (1,5 мМ MgCl2)

БСА (фракция V) (10 %)

0,25 мкл

0,1 %

смесь d-nTP (20 мМ)

0,125 мкл

0,1 мМ

Праймер ПСА-1 (10 мкМ)

0,5 мкл

0,2 мкМ

Праймер PSA-R (10 мкМ)

0,5 мкл

0,2 мкМ

Праймер NS-7-F (10 мкМ) (2)

0,1 мкл

0,04 мкМ

Праймер NS-8-R (10 мкМ) (2)

0,1 мкл

0,04 мкМ

Taq-полимераза (5 ЕД/мкл) (1)

0,2 мкл

1,0 Е

Объем образца

5,0 мкл

Общий объем

25,0 мкл

1.3. Условия реакции ПЦР

Запустите следующую программу:

1 цикл:

(я)

3 минуты при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

10 циклов:

(ii)

1 минута при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

(iii)

1 минута при 64 °C (отжиг праймеров)

(iv)

1 минута при 72 °C (расширение копии)

25 циклов:

(в)

30 секунд при 95 °C (денатурация матричной ДНК)

(ви)

30 секунд при 62°С (отжиг праймеров)

(vii)

1 минута при 72 °C (расширение копии)

1 цикл:

(viii)

5 минут при 72 °C (окончательное удлинение)

(ix)

держать при 4 °C.

Примечание:

Эта программа оптимизирована для использования с термоциклером MJ Research PTC 200. Изменение продолжительности этапов циклов (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii) может потребоваться для использования с другими моделями.

1.4. Рестрикционный ферментный анализ ампликона.

Продукты ПЦР, амплифицированные из C. m. подвид sepedonicus вызывают характерный полиморфизм длины рестрикционного фрагмента с ферментом Bgl II после инкубации при 37 °C в течение 30 минут. Рестрикционные фрагменты, полученные из C. m. подвид sepedonicus имеют размер 282 п.н. и 220 п.н.

2.   Подготовка загрузочного буфера

2.1. Бромфеноловый синий (10 % исходный раствор)

Бромфеноловый синий

5 г

Дистиллированная вода (бидест)

50 мл

2.2. Загрузка буфера

Глицерин (86 %)

3,5 мл

Бромфеноловый синий (5.1)

300 мкл

Дистиллированная вода (бидест)

6,2 мл

3.   10-кратный трис-ацетатный буфер с ЭДТА (ТАЕ), pH 8,0.

Трис буфер

48,4 г

Ледяная уксусная кислота

11,42 мл

ЭДТА (динатриевая соль)

3,72 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Разбавьте до 1x перед использованием.

Также имеется в продаже (например, Invitrogen или эквивалент).

(1) Методы были проверены с использованием Taq-полимеразы от Perkin Elmer (AmpliTaq или Gold) и Gibco BRL.

(2) Концентрация праймеров NS-7 F и NS-8-R была оптимизирована для экстракции сердцевины пяточного конца картофеля с использованием метода гомогенизации и очистки ДНК в соответствии с Пастриком (2000) (см. раздел 6.1.a) и 6.2). Если будет использоваться экстракция встряхиванием или другие методы выделения ДНК, потребуется повторная оптимизация концентраций реагентов.

Приложение 7

Валидированные реагенты для теста FISH

1.   Олигозонды

Специальный датчик Cms CMS-CY3-01:

5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'

Неспецифический эубактериальный зонд EUB-338-FITC:

5'- gct gcc tcc cgt agg agt -3'

2.   Фиксирующий раствор

[ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! ФИКСАТИВ СОДЕРЖИТ ТОКСИЧНЫЙ ПАРАФОРМАЛЬДЕГИД. НАДЕВАЙТЕ ПЕРЧАТКИ И НЕ ВДЫХАЙТЕ. РЕКОМЕНДУЕТСЯ РАБОТАТЬ В ВЫТЯЖНОМ ШКАФЕ]

(я)

Нагрейте девять мл воды молекулярного качества (например, сверхчистой воды (UPW)) примерно до 60 °C и добавьте 0,4 г параформальдегида. Параформальдегид растворяется после добавления пяти капель 1 н. NaOH и перемешивания магнитной мешалкой.

(ii)

Доведите pH до 7,0, добавив 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (PB; pH 7,0) и пяти капель 1 N HCl. Проверьте pH с помощью индикаторных полосок и при необходимости отрегулируйте его с помощью HCl или NaOH.

[ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ PH-МЕТР В РАСТВОРАХ С ПАРАФОРМАЛГИДОМ] (iii)

Отфильтруйте раствор через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и храните без пыли при температуре 4 °C до дальнейшего использования.

(iv)

Примечание:

Альтернативный фиксирующий раствор: 96 % этанол.

3.   3x Гибмикс

NaCl

2,7 М

Трис-HCl

60 мМ (рН 7,4)

ЭДТА (стерилизованная фильтрованием и автоклавированная)

15 мМ

Разбавьте до 1x по мере необходимости.

4.   Решение для гибридизации

1x Гибмикс

Додецилсульфат натрия (SDS)

0,01 %

зонд EUB 338

5 нг/мкл

зонд CMSCY301

5 нг/мкл

Приготовьте количество раствора для гибридизации согласно расчетам, приведенным в табл. Для каждого предметного стекла (содержащего два разных образца в двух экземплярах) требуется 90 мкл раствора для гибридизации.

Таблица:   Рекомендуемые количества для приготовления смеси для гибридизации.

2 слайда

8 слайдов

Стерильный УПВ

50,1

200,4

3x гибридикс

30,0

120,0

1 % паспорт безопасности

0,9

3,6

Зонд EUB 338 (100 нг/мкл)

4,5

18,0

Зонд CMSCY301 (100 нг/мкл)

4,5

18,0

Общий объем (мкл)

90,0

360,0

Примечание. Все растворы, содержащие светочувствительные олигозонды, храните в темноте при –20 °C. Защищайте от прямых солнечных лучей или электрического света во время использования.

5.   0,1М Фосфатный буфер, pH 7,0

Na2HPO4

8,52 г

Х2ПО4

5,44 г

Дистиллированная вода

1,00 л

Растворите ингредиенты, проверьте pH и стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.

Приложение 8

Баклажановая культура

Посейте семена баклажанов (Solanum melongena) в пастеризованный семенной компост. Пересадите саженцы с полностью разросшимися семядолями (от 10 до 14 дней) в пастеризованный горшечный компост.

Баклажаны следует выращивать в теплице при следующих условиях окружающей среды:

Продолжительность дня:

14 часов или естественная продолжительность дня, если больше;

Температура:

день:

от 21 до 24 °С,

ночь:

15 °С.

Восприимчивые сорта баклажанов:

'Черная красота',

«Длинный Том»,

«Рима»,

'Голос'

Поставщик: см. веб-сайт http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Приложение 9

Процедура окраски по Граму (модификация Хакера) (Doetsch, 1981) (1)

Раствор кристаллического фиолетового

Растворите 2 г кристаллического фиолетового в 20 мл 95 % этанола.

0,8 г оксалата аммония растворяют в 80 мл дистиллированной воды.

Смешайте два раствора.

йод Люголя

Йод

1 г

Йодистый калий

2 г

Дистиллированная вода

300 мл

Твердые частицы измельчите пестиком и ступкой. Добавьте в воду и перемешайте до растворения в закрытой посуде.

Раствор для окрашивания сафранина

Основной раствор:

Сафранин О

2,5 г

95 % этанол

100 мл

Перемешать и хранить.

Разбавьте: 1:10 для получения рабочего раствора.

Процедура окрашивания

1.

Приготовьте мазки, высушите на воздухе и зафиксируйте нагреванием.

2.

Залейте предметное стекло раствором кристаллического фиолетового на одну минуту.

3.

Ненадолго промойте водопроводной водой.

4.

Залить йодом Люголя на одну минуту.

5.

Промойте водопроводной водой и промокните насухо.

6.

Обесцветьте 95 % этанолом, добавляемым по каплям до тех пор, пока цвет не перестанет исчезать, или погрузите при осторожном перемешивании на 30 секунд.

7.

Промойте в водопроводной воде и промокните насухо.

8.

Залейте раствором сафранина в течение 10 секунд.

9.

Промойте водопроводной водой и промокните насухо.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий цвет; Грамотрицательные бактерии окрашиваются в розово-красный цвет.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.

Аноним, 1987. Схема обнаружения и диагностики бактерии кольцевой гнили Corynebacterium sepedonicum в партиях клубней картофеля. Комиссия Европейских Сообществ, Люксембург. Публикация EUR 11288 EN, 21 стр.

2.

Брэдбери, Дж. Ф., 1970. Выделение и предварительное изучение бактерий из растений. Преподобный пл. Путь., 49, 213-218.

3.

Динесен И.Г., 1984. Выделение и диагностика Corynebacterium sepedonicum из больных клубней картофеля. Бюллетень ЕОКЗР. 14 (2), 147–152.

4.

Доетч Р. Н., 1981. Детерминирующие методы световой микроскопии. В: Руководство по методам общей бактериологии, Американское общество микробиологии, Вашингтон, 21–23.

5.

Хью Р. и Лейфсон Ф., 1953. Таксономическое значение ферментативного и окислительного метаболизма углеводов различными грамотрицательными бактериями. Ж. Бакт., 66, 24-26.

6.

Янсе, Дж. Д., 1991. Инфра- и внутривидовая классификация штаммов Pseudomonas solanacearum с использованием анализа жирных кислот цельных клеток. Систематическая и прикладная микробиология 14; 335-345.

7.

Янс, Дж. Д. и Дж. Ван Веренберг. Интерпретация метода ЕС для выявления скрытой кольцевой гнили (Corynebacterium sepedonicum) картофеля. Бюллетень ЕОКЗР, № 17, 1987 г., стр. 1–10.

8.

Янсинг, Х. и К. Рудольф, 1998. Физиологические возможности Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus и разработка полуселективной среды. Журнал болезней и защиты растений, 105, 590–601.

9.

Ковач Н., 1956. Идентификация Pseudomonas pyocyanea с помощью оксидазной реакции. Природа, Лондон, 178, 703.

10.

Клемент З.; Рудольф, К. и Д.С. Сэндс, 1990. Методы фитобактериологии. Академическое издательство, Будапешт, 568 стр.

11.

Леллиотт Р.А., 1966. Коринеформные бактерии, патогенные для растений. Дж. прил. Бакт., 29, 114-118.

12.

Леллиотт, Р.А., Э. Биллинг и А.К. Хейворд, 1966. Определяющая схема для флуоресцентных патогенных псевдомонад растений J. appl. Бакт., 29, 470–489.

13.

Леллиотт, Р.А. и П.В., Селлар, 1976. Обнаружение скрытой кольцевой гнили (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) в подвоях картофеля. Бюллетень ЕОКЗР, 6(2).

14.

Ли, X. и С.Х. de Boer, 1995. Отбор праймеров полимеразной цепной реакции из межгенной спейсерной области РНК для специфического обнаружения Clavibacter michiganensis ssp. сепедоник. Фитопатология, 85, 837–842.

15.

Миллс Д., Рассел Б., В. и Дж. В. Ханус, 1997. Специфическое обнаружение Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus путем амплификации трех уникальных последовательностей ДНК, выделенных методом субтракционной гибридизации. Фитопатология, 87, 8, 853-861.

16.

Пастрик, К.-Х. и Р.А. Рейни. 1999. Идентификация и дифференциация подвидов Clavibacter michiganensis с помощью методов полимеразной цепной реакции. Дж. Фитопатология 147; 687-693.

17.

Пастрик, К.-Х., 2000. Обнаружение Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в клубнях картофеля методом мультиплексной ПЦР с коамплификацией ДНК хозяина. Европейский журнал патологии растений, 106, 155–165.

18.

Рамамурти, К.С., 1959. Сравнительные исследования некоторых грамположительных фитопатогенных бактерий и их связи с коринебактериями. Память Корнеллский сельскохозяйственный завод. Эксп. Ст., 366, 52 с.

19.

Шаад В., Бертье-Шаад Ю., Сехлер А. и Кнорр Д. (1999) Обнаружение Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus в клубнях картофеля с помощью БИО-ПЦР и автоматизированной системы флуоресцентного обнаружения в реальном времени. Болезни растений 83; 1095–1100.

20.

Шаад, В. 2001. Лабораторное руководство по идентификации фитопатогенных бактерий. Урон [Часов]. — 3. изд.; Сент-Пол, Миннесота:, 373 стр.

21.

Скерман В.Б.Д., 1967. Руководство по определению родов бактерий. 2-е изд., Компания Уильяма и Уилкинса, Балтимор.

22.

Смит, Северная Каролина; Хеннеси, Дж; Stead, DE, 2001. ПЦР-профилирование на основе повторяющихся последовательностей с использованием праймера BOX-A1Ralstonia solanacearum для быстрой идентификации патогена растений Clavibacter michiganensis ssp. сепедоник. Европейский журнал патологии растений, 107 (7), 739-748.

23.

Снит, П.Х.А. и В.Г. Коллинз, 1974. Исследование воспроизводимости тестов между лабораториями: отчет рабочей группы Pseudomonas. Антони ван Левенгук, 40 лет, 481–527.

24.

Стед, Д.Э. 1992. Группировка фитопатогенов и некоторых других видов Pseudomonas. с использованием клеточных профилей жирных кислот. Международный журнал систематической бактериологии 42; 281-295.

25.

Вуллингс, бакалавр искусств; ван Бенинген, AR; Янсе, Дж. Д. и А. Д. Л. Аккерманс, 1998. Обнаружение Ralstonia solanacearum, вызывающего коричневую гниль картофеля, путем флуоресцентной гибридизации in situ с зондами, нацеленными на 23s рРНК. Прил. Окружающая среда. Микробиол. 64, 4546–4554.

(1)  Также можно использовать имеющиеся в продаже растворы и наборы для окрашивания.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

1.

Для каждого подозрительного события, для которого положительный результат в скрининговом тесте(ах) был идентифицирован в соответствии с методами, изложенными в Приложении I, и ожидается подтверждение или опровержение путем выполнения указанных методов, необходимо обеспечить сохранение и соответствующее сохранение. из:

—

взяты пробы со всех клубней и, по возможности, со всех растений,

—

любой оставшийся экстракт и дополнительно подготовленный материал для скринингового теста(ов), например слайды иммунофлуоресценции,

и

—

всю соответствующую документацию,

до завершения указанных методов.

Сохранение клубней позволит при необходимости провести сортоиспытание.

2.

В случае положительного подтверждения наличия организма следует обеспечить сохранение и соответствующую консервацию:

—

материал, указанный в пункте 1,

и

—

образец зараженного материала баклажана, инокулированного клубневым или растительным экстрактом,

и

—

изолированная культура организма,

в течение как минимум одного месяца после процедуры уведомления в соответствии со статьей 5(2).

ПРИЛОЖЕНИЕ III

1.

Элементы, которые следует учитывать при определении степени вероятного загрязнения в соответствии со статьей 5(1)(b), включают:

—

клубни или растения, выращенные в месте производства, обозначенном как загрязненное в соответствии со статьей 5(1)(a),

—

место(а) производства, имеющее некоторую производственную связь с клубнями или растениями, обозначенными как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(a), включая те, которые совместно используют производственное оборудование и помещения напрямую или через общего подрядчика,

—

клубни или растения, произведенные в месте(ах) производства, указанном в предыдущем абзаце, или присутствующие в таком месте(ах) производства в течение периода, когда клубни или растения, обозначенные как загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(а), были присутствует на месте производства, указанном в первом абзаце,

—

помещения по обращению с картофелем из мест производства, указанных в вышеуказанных абзацах,

—

любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или его части, а также любые другие предметы, включая упаковочный материал, которые могли вступить в контакт с клубнями или растениями, обозначенными как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(a),

—

любые клубни или растения, хранящиеся в любых конструкциях или объектах, перечисленных в предыдущем абзаце, или находящиеся в контакте с ними, до очистки и дезинфекции таких конструкций и объектов,

—

в результате тестирования в соответствии со статьей 6 те клубни или растения, имеющие сестринское или родительское клональное родство с клубнями или растениями, признанными загрязненными в соответствии со статьей 5(1)(а) и в отношении которых, хотя они и могли иметь отрицательный результат теста на организма, представляется, что заражение возможно через клональную связь. Сортовое тестирование может быть проведено для проверки идентичности загрязненных и клонально родственных клубней или растений,

и

—

место(а) производства клубней или растений, упомянутых в предыдущем абзаце.

2.

Элементы, которые следует учитывать при определении возможного распространения в соответствии со статьей 5(1)(c), должны включать:

—

близость других мест производства картофеля или других растений-хозяев,

—

общее производство и использование запасов семенного картофеля.

3.

Уведомление, упомянутое в первом подпункте статьи 5(2), должно быть предоставлено следующим образом:

—

сразу после того, как присутствие организма было подтверждено лабораторным исследованием с использованием методов, изложенных в Приложении I, по крайней мере:

—

название сорта картофеля,

—

тип (продуктовый, семенной и т. д.) и, если применимо, категория семян картофеля,

—

когда существует риск заражения картофеля из других государств-членов или в другие государства-члены, государство-член, в котором происшествие было подтверждено, должно немедленно уведомить соответствующее государство(-а) о информации, необходимой для соблюдения статьи 5(3) , такой как:

—

название сорта картофеля,

—

имя и адрес отправителя и грузополучателя,

—

дата поставки партии картофеля,

—

размер поставляемой партии картофеля,

—

копия паспорта растения или, по крайней мере, номер паспорта растения, где это применимо, или, если применимо, регистрационный номер производителя или продавца и копия уведомления о доставке.

Комиссия должна быть немедленно уведомлена о предоставлении такой информации.

—

После завершения всех расследований по каждому делу:

—

дата подтверждения загрязнения,

—

краткое описание расследования, проведенного для определения источника и возможного распространения загрязнения, включая уровень взятого отбора проб,

—

информация об выявленных или предполагаемых источниках загрязнения,

—

сведения о степени обозначенного загрязнения, включая количество мест производства и количество партий с указанием сорта, а в случае семенного картофеля - категории,

—

сведения о разграничении зон, в том числе количество мест производства, не признанных загрязненными, но включенных в зону,

—

такую ​​другую информацию, относящуюся к подтвержденной вспышке(ям), которую может потребовать Комиссия.

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

1.

Официально контролируемыми мерами, указанными в статье 7(1), являются:

—

использовать в качестве корма для животных после термической обработки, чтобы исключить риск выживания организма,

или

—

утилизация на официально одобренном специально отведенном полигоне для утилизации отходов, на котором нет идентифицируемого риска утечки патогена в окружающую среду, например через просачивание на сельскохозяйственные угодья,

или

—

сжигание,

или

—

промышленная обработка путем прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с официально утвержденными объектами утилизации отходов, для которых установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма, и с системой очистки и дезинфекции, по крайней мере, отъезжающих транспортных средств,

или

—

другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры и их обоснование должны быть доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.

Любые оставшиеся отходы, связанные с вышеизложенным и возникающие в результате этого, должны быть утилизированы официально утвержденными методами в соответствии с Приложением V к настоящей Директиве.

2.

Надлежащее использование или утилизация клубней или растений, определенных как вероятно загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(b) и упомянутых в статье 7(2), под контролем ответственных официальных органов заинтересованных государств-членов, при соответствующем обмене информацией между ответственные официальные органы, обеспечивающие постоянный такой контроль и одобрение ответственными официальными органами государства-члена, в котором картофель должен быть упакован или переработан в отношении объектов по удалению отходов, упомянутых в первом и втором абзацах, должны быть:

—

использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для употребления в пищу, упакованного для непосредственной доставки и использования без переупаковки, на площадке, имеющей соответствующие сооружения для утилизации отходов. Картофель, предназначенный для посадки, можно обрабатывать только на одном и том же участке, если это делается отдельно или после очистки и дезинфекции.

или

—

использование в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для промышленной переработки и предназначенного для прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с соответствующими объектами по утилизации отходов и системой очистки и дезинфекции, по крайней мере, отъезжающих транспортных средств,

или

—

какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма и подлежит одобрению указанными ответственными официальными органами.

3.

Соответствующими методами очистки и дезинфекции объектов, указанных в статье 7(3), должны быть те, для которых установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма, и они должны применяться под надзором ответственных официальных органов государства-члены.

4.

Ряд мер, которые должны быть реализованы государствами-членами в пределах демаркированной зоны, установленной в соответствии со статьей 5(1)(c) и указанной в статье 7(4), должны включать:

4.1.

в местах производства, обозначенных как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(a):

(а)

на поле, обозначенном как загрязненное в соответствии со статьей 5 (1)(а), либо

(я)

—

в течение как минимум трех вегетационных лет, следующих за годом указанного загрязнения,

—

должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других естественных растений-хозяев организма,

и

—

клубни картофеля, растения или настоящие семена или другие растения-хозяева данного организма, встречающиеся в природе, или культуры, для которых существует выявленный риск распространения организма, не должны высаживаться,

—

в первый сезон выращивания картофеля, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, и при условии, что в ходе официальных проверок в течение как минимум двух последовательных лет выращивания было обнаружено, что поле свободно от самостоятельных растений картофеля и других естественных растений-хозяев организма. перед посадкой допускается производство только продовольственного картофеля, а собранные клубни должны быть проверены в соответствии с процедурой, подробно описанной в Приложении I;

—

в сезоне сбора урожая картофеля, следующем за сезоном, указанным в предыдущем абзаце, и после соответствующего цикла севооборота, который должен составлять не менее двух лет, если планируется выращивать семенной картофель, картофель можно сажать либо для производства семян, либо для производства продовольственных товаров, а также для официального обследования как подробно описано в статье 2(1), должно быть проведено;

или

(ii)

—

в течение четырех лет выращивания, следующих за годом указанного загрязнения,

—

должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других естественных растений-хозяев организма,

и

—

поле должно быть заложено и содержаться либо под голым паром, либо на постоянном пастбище с частыми скошенными стрижками или интенсивным выпасом,

—

в первый сезон выращивания картофеля, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, и при условии, что в ходе официальных проверок в течение как минимум двух последовательных лет выращивания было обнаружено, что поле свободно от самостоятельных растений картофеля и других естественных растений-хозяев организма. перед посадкой должно быть разрешено производство семенного или продовольственного картофеля, а собранные клубни должны быть проверены в соответствии с процедурой, подробно описанной в Приложении I;

(б)

на всех других полях загрязненного места производства и при условии, что ответственные официальные органы удостоверятся в том, что риск, связанный с растениями-добровольцами картофеля и другими естественными растениями-хозяевами организма, устранен:

—

в год вегетации, следующий за годом указанного заражения, не следует высаживать клубни картофеля, растения или настоящие семена или другие встречающиеся в природе растения-хозяева данного организма, или

—

сертифицированный семенной картофель можно сажать только для производства посуды,

—

на второй год выращивания, следующий за годом установленного заражения, только сертифицированные семена или семенной картофель, официально проверенные на отсутствие кольцевой гнили и выращенные под официальным контролем на местах производства, отличных от тех, которые указаны в 4.1, должны быть высажены на семена или на продовольственные товары. производство,

—

в течение как минимум третьего года выращивания после указанного загрязнения для производства семян или продовольственных товаров следует высаживать только сертифицированный семенной картофель или семенной картофель, выращенный под официальным контролем из сертифицированного семенного картофеля,

—

в каждый год выращивания, указанный в предыдущих абзацах, должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других естественно встречающихся растений-хозяев организма, если таковые имеются, и на каждом картофельном поле должно проводиться официальное тестирование собранного картофеля в соответствии с процедура, подробно описанная в Приложении I,

(с)

Сразу после определения загрязнения в соответствии со статьей 5 (1) (а) и после первого последующего года выращивания все оборудование и складские помещения на месте производства, используемые в производстве картофеля, должны быть очищены и продезинфицированы соответствующим образом с использованием соответствующих методов, как указанный в 3;

(г)

в отделении защищенного растениеводства, где возможна полная замена питательной среды,

—

клубни, растения или настоящие семена нельзя высаживать, если на производственном объекте не были приняты официально контролируемые меры по уничтожению организма и удалению всего растительного материала-хозяина, включая, по крайней мере, полную замену питательной среды, а также очистку и дезинфекцию производственное подразделение и все оборудование, а также впоследствии получило разрешение на производство картофеля от ответственных официальных органов,

и

—

производство картофеля должно производиться из сертифицированного семенного картофеля или из мини-клубней или микрорастений, полученных из проверенных источников;

4.2.

в пределах демаркированной зоны, без ущерба для мер, подробно описанных в пункте 4.1, государства-члены должны:

(а)

сразу же после указанного загрязнения обеспечить, чтобы все оборудование и складские помещения в таких помещениях, связанные с производством картофеля, были очищены и продезинфицированы, при необходимости, с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3;

(б)

немедленно и в течение не менее трех вегетационных периодов после указанного загрязнения:

—

обеспечивать надзор со стороны своих ответственных должностных лиц за помещениями по выращиванию, хранению или обращению с клубнями картофеля, а также за помещениями, в которых эксплуатируется картофельная техника по договору,

—

требовать посадки только сертифицированных семян или семян, выращенных под официальным контролем для всех культур картофеля в этой зоне, и проведения испытаний после сбора урожая семенного картофеля, выращенного в местах производства, обозначенных как вероятно загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(b),

—

требовать раздельной обработки запасов собранного семенного картофеля и продовольственных запасов во всех помещениях зоны или проведения системы очистки и дезинфекции между обработками запасов семян и продовольственных запасов,

—

провести официальный опрос, как подробно описано в статье 2(1);

(с)

разработать программу, где это возможно, для замены всех запасов семенного картофеля в течение соответствующего периода времени.

ПРИЛОЖЕНИЕ V

Официально утвержденные методы удаления отходов, упомянутые в параграфе 1 Приложения IV, должны соответствовать следующим положениям, чтобы исключить любой идентифицируемый риск распространения организма:

(я)

Картофельные отходы (включая бракованный картофель и очистки) и любые другие твердые отходы, связанные с картофелем (включая почву, камни и другой мусор), должны удаляться либо:

—

утилизация на официально одобренном специальном полигоне для утилизации отходов, на котором не существует идентифицируемого риска утечки организма в окружающую среду, например через просачивание на сельскохозяйственные угодья. Отходы должны доставляться непосредственно на площадку в условиях локализации, исключающих риск потери отходов.

или

—

сжигание,

или

—

другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры должны быть доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.

(ii)

жидкие отходы: перед утилизацией жидкие отходы, содержащие взвешенные твердые вещества, должны быть подвергнуты процессам фильтрации или отстаивания для удаления таких твердых веществ. Эти твердые вещества подлежат удалению, как указано в подпункте (i).

В таком случае жидкие отходы должны быть либо:

—

нагреты минимум до 60 °C по всему объему в течение как минимум 30 минут перед утилизацией,

или

—

иным образом утилизируются при условии официального разрешения и под официальным контролем таким образом, чтобы не было идентифицируемого риска того, что отходы могут вступить в контакт с сельскохозяйственными угодьями. Подробности об этом должны быть доведены до сведения других государств-членов ЕС и Комиссии.

Варианты, описанные в настоящем Приложении, также применимы к отходам, связанным с обращением, удалением и переработкой загрязненных партий.

Вершина