Директива Комиссии 2000/45/EC от 6 июля 2000 г., устанавливающая методы Сообщества для определения содержания витамина А, витамина Е и триптофана в кормах (текст имеет отношение к ЕЭЗ)

Директива Комиссии 2000/45/EC

от 6 июля 2000 г.

установление методов анализа Сообщества для определения витамина А, витамина Е и триптофана в кормах

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества по отбору проб и анализу для официального контроля кормов(1), с последними поправками, внесенными Актом о присоединении Австрии, Финляндии и Швеции(2 ), и в частности статью 2,

Тогда как:

(1) Директива 70/373/EEC предусматривает, что официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с законами, постановлениями и административными положениями, регулирующими их качество и состав, должен осуществляться с использованием методов Сообщества отбора проб и анализа.

(2) Директива Совета 70/524/EEC от 23 ноября 1970 г. о добавках в кормах(3), с последними поправками, внесенными Регламентом Комиссии (ЕС) № 2439/1999 от 17 ноября 1999 г.(4), предусматривает, что витамин А и витамин Е их содержание должно быть указано на этикетке, где эти вещества добавляются в премиксы и корма.

(3) Директива Совета 79/373/EEC от 2 апреля 1979 г. о сбыте комбикормов(5) с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 2000/16/EC(6) и Директивой Совета 93/74/EEC от 13 сентября 1993 г. корма, предназначенные для определенных пищевых целей(7), с последними поправками, внесенными Директивой 96/25/EC(8), предусматривают, что аминокислоты должны быть указаны на маркировке кормов.

(4) Для проверки этих веществ должны быть установлены методы анализа Сообщества.

(5) Меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны обеспечить, чтобы анализы, проводимые с целью официального контроля содержания витамина А, витамина Е и триптофана в кормах и премиксах, проводились с использованием метода, изложенного в Приложении к настоящему Соглашению.

Статья 2

Государства-члены должны ввести в действие не позднее 31 августа 2000 г. законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения положений настоящей Директивы. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Они начнут применять эти меры с 1 сентября 2000 года.

Когда государства-члены ЕС принимают эти меры, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки должен быть принят государствами-членами.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 6 июля 2000 года.

Для Комиссии

Дэвид Бирн

Член Комиссии

(1) OJ L 170, 3 августа 1970 г., с. 2.

(2) OJ C 241, 29 августа 1994 г., с. 1.

(3) OJ L 270, 14.12.1970, с. 1.

(4) OJ L 297, 18.11.1999, с. 8.

(5) OJ L 86, 6 апреля 1979 г., с. 30.

(6) OJ L 105, 3 мая 2000 г., с. 36.

(7) OJ L 237, 22 сентября 1993 г., с. 23.

(8) OJ L 125, 23 мая 1996 г., с. 35.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ЧАСТЬ А

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А

1. Цель и сфера применения

Этот метод предназначен для определения витамина А (ретинола) в кормах и премиксах. Витамин А включает полностью транс-ретиниловый спирт и его цис-изомеры, которые определяются этим методом. Содержание витамина А выражается в международных единицах (МЕ) на кг. Одна МЕ соответствует активности 0,300 мкг спирта полностью трансвитамина А или 0,344 мкг ацетата полностью трансвитамина А или 0,550 мкг пальмитата полностью трансвитамина А.

Предел определения — 2000 МЕ витамина А/кг.

2. Принцип

Пробу гидролизуют спиртовым раствором гидроксида калия и экстрагируют витамин А петролейным эфиром. Растворитель удаляют выпариванием, остаток растворяют в метаноле и при необходимости разбавляют до необходимой концентрации. Содержание витамина А определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) с использованием УФ- или флуоресцентного детектора. Хроматографические параметры выбираются так, чтобы не было разделения между полностью транс-спиртом витамина А и его цис-изомерами.

3. Реагенты

3.1. Этанол, σ = 96 %

3.2. Легкий петролейный газ, температура кипения от 40° до 60°C.

3.3. Метанол

3.4. Раствор гидроксида калия, β = 50 г/100 мл

3.5. Раствор аскорбата натрия, β = 10 г/100 мл (см. 7.7 наблюдения)

3.6. Сульфид натрия, Na2S · x H2O (x = 7-9)

3.6.1. Раствор сульфида натрия, с = 0,5 моль/л в глицерине, β = 120 г/л (для х = 9) (см. 7.8 наблюдений)

3.7. Раствор фенолфталеина, β = 2 г/100 мл в этаноле (3.1)

3.8. 2-Пропанол

3.9. Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь метанола (3.3) и воды, например 980+20 (в+в). Точное соотношение будет определяться характеристиками используемой колонки.

3.10. Азот, без кислорода

3.11. Полностью трансвитамина А ацетат, особо чистый, с сертифицированной активностью, напр. 2,80 х 106 МЕ/г

3.11.1. Исходный раствор полностью транс-витамина А ацетата: взвешивают с точностью до 0,1 мг, 50 мг ацетата витамина А (3.11) и помещают в градуированную колбу вместимостью 100 мл. Растворить в пропаноле-2 (3,8) и довести до метки тем же растворителем. Номинальная концентрация этого раствора составляет 1400 МЕ витамина А на мл. Точное содержание должно определяться в соответствии с 5.6.3.1.

3.12. Полностью трансвитамин А пальмитат, особо чистый, с сертифицированной активностью, напр. 1,80 х 106 МЕ/г

3.12.1. Исходный раствор полностью транс-пальмитата витамина А: взвесьте с точностью до 0,1 мг 80 мг пальмитата витамина А (3.12) и поместите в градуированную колбу емкостью 100 мл. Растворить в пропаноле-2 (3,8) и довести до метки тем же растворителем. Номинальная концентрация этого раствора составляет 1400 МЕ витамина А на мл. Точное содержание должно определяться в соответствии с 5.6.3.2.

3.13. 2,6-Ди-трет-бутил-4-метилфенол (ВНТ) (см. наблюдения 7.5)

4. Аппарат

4.1. Вакуумный ротационный испаритель

4.2. Янтарная посуда

4.2.1. Колбы плоскодонные или конические, 500 мл, с притертой раструбной крышкой.

4.2.2. Колбы градуированные с притертыми пробками, узкогорлые, вместимостью 10, 25, 100 и 500 мл.

4.2.3. Воронки делительные, конические, 1000 мл, с притертыми пробками

4.2.4. Колбы грушевидной формы объемом 250 мл с притертыми пробками.

4.3. Конденсатор Аллина, длина рубашки 300 мм, с матовым соединением, с переходником для газоподводящей трубы

4.4. Гофрированная фильтровальная бумага для разделения фаз диаметром 185 мм (например, Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Оборудование для ВЭЖХ с системой инъекции

4.5.1. Жидкостная хроматографическая колонка, 250 мм x 4 мм, C18, насадка 5 или 10 мкм, или эквивалентная (критерий эффективности: только один пик для всех изомеров ретинола в условиях ВЭЖХ)

4.5.2. УФ- или флуоресцентный детектор с регулируемой длиной волны

4.6. Спектрофотометр с кварцевой кюветой 10 мм.

4.7. Водяная баня с магнитной мешалкой

4.8. Экстракционный аппарат (см. рисунок 1), состоящий из:

4.8.1. Стеклянный баллон емкостью 1 л с притертым стеклянным горлышком и пробкой.

4.8.2. Вставка из матового стекла с боковым кронштейном и регулируемой трубкой, проходящей через центр. Регулируемая трубка должна иметь нижний конец U-образной формы и жиклер на противоположном конце, чтобы верхний слой жидкости в цилиндре можно было переносить в делительную воронку.

5. Процедура

Примечание:

Витамин А чувствителен к (УФ) свету и окислению. Все операции следует проводить в условиях отсутствия света (используя темную посуду или посуду, защищенную алюминиевой фольгой) и кислорода (продувка азотом). Во время откачки воздух над жидкостью следует заменять азотом (избегайте избыточного давления, время от времени ослабляя пробку).

5.1. Подготовка образца

Измельчите образец так, чтобы он прошел через сито с размером ячеек 1 мм, стараясь избегать выделения тепла. Измельчение необходимо проводить непосредственно перед взвешиванием и омылением, в противном случае возможны потери витамина А.

5.2. Омыление

В зависимости от содержания витамина А взвешивают от 2 до 25 г пробы с точностью до 0,01 г в плоскодонную или коническую колбу вместимостью 500 мл (4.2.1). Добавляют последовательно, перемешивая, 130 мл этанола (3.1), примерно 100 мг BHT (3.13), 2 мл раствора аскорбата натрия (3.5) и 2 мл раствора сульфида натрия (3.6). Прикрепите к колбе конденсатор (4.3) и погрузите колбу на водяную баню с магнитной мешалкой (4.7). Нагрейте до кипения и дайте настояться с обратным холодильником в течение пяти минут. Затем через холодильник (4.3) добавляют 25 мл раствора гидроксида калия (3.4) и кипятят с обратным холодильником еще 25 мин при перемешивании под медленным током азота. Затем промойте конденсатор примерно 20 мл воды и охладите содержимое колбы до комнатной температуры.

5.3. Добыча

Омыляющий раствор количественно переносят путем промывки общим объемом 250 мл воды в делительную воронку вместимостью 1000 мл (4.2.3) или в экстракционный аппарат (4.8). Колбу для омыления ополаскивают последовательно 25 мл этанола (3.1) и 100 мл петролейного эфира (3.2) и переносят смывы в делительную воронку или в экстракционный аппарат. Соотношение воды и этанола в объединенных растворах должно составлять примерно 2:1. Энергично встряхивайте в течение двух минут и дайте отстояться в течение двух минут.

5.3.1. Экстракция с использованием делительной воронки (4.2.3)

Когда слои разделятся (см. наблюдение 7.3), перенесите слой легкой нефти в другую делительную воронку (4.2.3). Эту экстракцию повторяют дважды, используя 100 мл петролейного эфира (3.2) и дважды, используя 50 мл петролейного эфира (3.2).

Объединенные экстракты промывают в делительной воронке дважды, осторожно перемешивая (во избежание образования эмульсий) порциями воды по 100 мл, а затем повторным встряхиванием с последующими порциями воды по 100 мл до тех пор, пока вода не станет бесцветной при добавлении раствора фенолфталеина (3.7). (обычно достаточно четырехкратной стирки). Промытый экстракт фильтруют через сухой складчатый фильтр для разделения фаз (4.4) для удаления взвешенной воды в градуированную колбу вместимостью 500 мл (4.2.2). Промойте делительную воронку и фильтр 50 мл вазелина (3.2), доведите до метки вазелином (3.2) и хорошо перемешайте.

5.3.2. Экстракция с использованием экстракционного аппарата (4.8)

Когда слои разделятся (см. наблюдение 7.3), замените пробку стеклянного цилиндра (4.8.1) на вставку из матового стекла (4.8.2) и расположите U-образный нижний конец регулируемой трубки так, чтобы он находился чуть выше уровень интерфейса. Подав давление из линии азота на боковой патрубок, переносят верхний слой легкой нефти в делительную воронку емкостью 1000 мл (4.2.3). Добавьте 100 мл петролейного эфира (3.2) в стеклянный цилиндр, закройте пробкой и хорошо встряхните. Дайте слоям разделиться и перенесите верхний слой в делительную воронку, как и раньше. Повторите процедуру экстракции еще с 100 мл петролейного эфира (3.2), затем дважды порциями петролейного эфира по 50 мл (3.2) и добавьте слои петролейного эфира в делительную воронку.

Промойте объединенные экстракты легкой нефти, как описано в 5.3.1, и действуйте, как описано там.

5.4. Приготовление раствора образца для ВЭЖХ

Пипеткой вносят аликвоту легкого петролейного раствора (из 5.3.1 или 5.3.2) в грушевидную колбу вместимостью 250 мл (4.2.4). Растворитель выпаривают практически досуха на роторном испарителе (4.1) при пониженном давлении при температуре бани не более 40 °С. Восстановите атмосферное давление, впустив азот (3.10), и снимите колбу с ротационного испарителя. Оставшийся растворитель удаляют струей азота (3.10) и остаток немедленно растворяют в известном объеме (10-100 мл) метанола (3.3) (концентрация витамина А должна быть в пределах от 5 МЕ/мл до 30 МЕ/мл).

5.5. Определение методом ВЭЖХ

Витамин А отделяют на колонке с обращенной фазой C18 (4.5.1) и концентрацию измеряют с помощью УФ-детектора (325 нм) или флуоресцентного детектора (возбуждение: 325 нм, испускание: 475 нм) (4.5.2). .

Вводят аликвоту (например, 20 мкл) метанольного раствора, полученного в 5.4, и элюируют подвижной фазой (3.9). Рассчитайте среднюю высоту пика (площадь) нескольких введений одного и того же раствора пробы и среднюю высоту пика (площадь) нескольких введений калибровочных растворов (5.6.2).

Условия ВЭЖХ

В качестве ориентира предлагаются следующие условия; могут быть использованы и другие условия при условии, что они дают эквивалентные результаты.

>ТАБЛИЦА>

5.6. Калибровка

5.6.1. Приготовление рабочих стандартных растворов

Внесите пипеткой 20 мл исходного раствора ацетата витамина А (3.11.1) или 20 мл исходного раствора пальмитата витамина А (3.12.1) в плоскодонную или коническую колбу вместимостью 500 мл (4.2.1) и гидролизуйте, как описано в разделе 5.2. , но без добавления BHT. Затем экстрагируют петролейным эфиром (3.2) по 5.3 и доводят объем петролейным эфиром (3.2) до 500 мл. 100 мл этого экстракта упаривают на роторном испарителе (см. 5.4) почти досуха, остаток растворителя удаляют током азота (3.10) и остаток перерастворяют в 10,0 мл метанола (3.3). Номинальная концентрация этого раствора составляет 560 МЕ витамина А на мл. Точное содержание должно определяться в соответствии с 5.6.3.3. Рабочий стандартный раствор должен быть свежеприготовленным перед использованием.

Внесите пипеткой 2,0 мл этого рабочего стандартного раствора в градуированную колбу вместимостью 20 мл, доведите до метки метанолом (3.3) и перемешайте. Номинальная концентрация этого разбавленного рабочего стандартного раствора составляет 56 МЕ витамина А на мл.

5.6.2. Приготовление калибровочных растворов и калибровочного графика

1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 мл разбавленного рабочего стандартного раствора переносят в ряд градуированных колб вместимостью 20 мл, доводят до метки метанолом (3.3) и перемешивают. Номинальные концентрации этих растворов составляют 2,8, 5,6, 14,0 и 28,0 МЕ витамина А на мл.

Введите по 20 мкл каждого калибровочного раствора несколько раз и определите среднюю высоту пика (площадь). Используя средние высоты пиков (площади), постройте калибровочный график с учетом результатов УФ-контроля (5.6.3.3).

5.6.3. УФ-стандартизация стандартных растворов

5.6.3.1. Маточный раствор ацетата витамина А

Пипеткой вносят 2,0 мл исходного раствора ацетата витамина А (3.11.1) в градуированную колбу вместимостью 50 мл (4.2.2) и доводят до метки 2-пропанолом (3.8). Номинальная концентрация этого раствора составляет 56 МЕ витамина А на мл. Отнесите пипеткой 3,0 мл этого разбавленного раствора ацетата витамина А в градуированную колбу вместимостью 25 мл и доведите до метки 2-пропанолом (3,8). Номинальная концентрация этого раствора составляет 6,72 МЕ витамина А на мл. Измерьте УФ-спектр этого раствора относительно 2-пропанола (3.8) в спектрофотометре (4.6) в диапазоне 300–400 нм. Максимум экстинкции должен находиться в диапазоне от 325 до 327 нм.

Расчет содержания витамина А:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.003601.EPS">

5.6.3.2. Маточный раствор пальмитата витамина А

Отнесите пипеткой 2,0 мл исходного раствора пальмитата витамина А (3.12.1) в градуированную колбу вместимостью 50 мл (4.2.2) и доведите до метки 2-пропанолом (3.8). Номинальная концентрация этого раствора составляет 56 МЕ витамина А на мл. Отнесите пипеткой 3,0 мл этого разбавленного раствора пальмитата витамина А в градуированную колбу емкостью 25 мл и доведите до метки 2-пропанолом (3,8). Номинальная концентрация этого раствора составляет 6,72 МЕ витамина А на мл. Измерьте УФ-спектр этого раствора относительно 2-пропанола (3.8) в спектрофотометре (4.6) в диапазоне 300–400 нм. Максимум экстинкции должен находиться в диапазоне от 325 до 327 нм.

Расчет содержания витамина А:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.003602.EPS">

5.6.3.3. Рабочий стандартный раствор витамина А

Вносят пипеткой 3,0 мл неразбавленного рабочего стандартного раствора витамина А, приготовленного по 5.6.1, в градуированную колбу вместимостью 50 мл (4.2.2) и доводят до метки 2-пропанолом (3.8). Отнесите пипеткой 5,0 мл этого раствора в градуированную колбу вместимостью 25 мл и доведите до метки 2-пропанолом (3,8). Номинальная концентрация этого раствора составляет 6,72 МЕ витамина А на мл. Измерьте УФ-спектр этого раствора относительно 2-пропанола (3.8) в спектрофотометре (4.6) в диапазоне 300–400 нм. Максимум экстинкции должен находиться в диапазоне от 325 до 327 нм.

Расчет содержания витамина А:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.003603.EPS">

6. Подсчет результатов

По средней высоте (площади) пиков витамина А в растворе пробы определяют концентрацию раствора пробы в МЕ/мл, сверяясь с калибровочным графиком (5.6.2).

Содержание витамина А w в МЕ/кг пробы определяется по следующей формуле:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.003701.EPS">

в котором:

β = концентрация витамина А в растворе пробы (5.4) в МЕ/мл.

V1= объем раствора пробы (5.4) в мл.

V2= объем взятой аликвоты 5,4 мл.

m = масса исследуемой навески в г

7. Наблюдения

7.1. Для образцов с низкой концентрацией витамина А может оказаться полезным объединить легкие нефтяные экстракты двух загрузок для омыления (весовое количество: 25 г) в один раствор образца для определения ВЭЖХ.

7.2. Масса взятой на анализ пробы не должна содержать более 2 г жира.

7.3. Если разделения фаз не происходит, добавьте примерно 10 мл этанола (3.1), чтобы разрушить эмульсию.

7.4. При использовании рыбьего жира и других чистых жиров время омыления следует увеличить до 45-60 минут.

7.5. Вместо BHT можно использовать гидрохинон.

7.6. С использованием нормальной фазовой колонки возможно разделение изомеров ретинола.

7.7. Вместо раствора аскорбата натрия можно использовать примерно 150 мг аскорбиновой кислоты.

7.8. Вместо раствора сульфида натрия можно использовать примерно 50 мг ЭДТА.

8. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 15 % относительно более высокого результата.

9. Результаты совместного исследования(1)

>ТАБЛИЦА>

Рисунок 1: Экстракционный аппарат (4.8)

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.003801.EPS">

ЧАСТЬ Б

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е

1. Цель и сфера применения

Этот метод предназначен для определения витамина Е в кормах и премиксах. Содержание витамина Е выражается в мг ацетата DL-α-токоферола на кг. 1 мг DL-α-токоферола ацетата соответствует 0,91 мг DL-α-токоферола (витамина Е).

Предел определения — 2 мг витамина Е/кг.

2. Принцип

Пробу гидролизуют спиртовым раствором гидроксида калия и экстрагируют витамин Е петролейным эфиром. Растворитель удаляют выпариванием, остаток растворяют в метаноле и при необходимости разбавляют до необходимой концентрации. Содержание витамина Е определяют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием флуоресцентного или УФ-детектора.

3. Реагенты

3.1. Этанол, σ = 96 %

3.2. Легкий петролейный газ, диапазон кипения 40–60 °C.

3.3. Метанол

3.4. Раствор гидроксида калия, β = 50 г/100 мл

3.5. Раствор аскорбата натрия, β = 10 г/100 мл (см. 7.7 наблюдения)

3.6. Сульфид натрия, Na2S · x H2O (x = 7-9)

3.6.1. Раствор сульфида натрия, с = 0,5 моль/л в глицерине, β = 120 г/л (для х = 9) (см. 7.8 наблюдений)

3.7. Раствор фенолфталеина, β = 2 г/100 мл в этаноле (3.1)

3.8. Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь метанола (3.3) и воды, например 980+20 (в+в). Точное соотношение будет определяться характеристиками используемой колонки.

3.9. Азот, без кислорода

3.10. DL-α-токоферола ацетат, особо чистый, сертифицированной активности

3.10.1. Исходный раствор ацетата DL-α-токоферола: взвешивают с точностью до 0,1 мг 100 мг ацетата DL-α-токоферола (3.10) в градуированную колбу вместимостью 100 мл. Растворяют в этаноле (3.1) и доводят до метки тем же растворителем. В 1 мл этого раствора содержится 1 мг ацетата DL-α-токоферола. (УФ-контроль см. 5.6.1.3; стабилизация см. 7.4 наблюдения).

3.11. DL-α-токоферол, особо чистый, сертифицированной активности

3.11.1. Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 100 мг DL-α-токоферола (3.10) в градуированную колбу вместимостью 100 мл. Растворяют в этаноле (3.1) и доводят до метки тем же растворителем. В 1 мл этого раствора содержится 1 мг DL-α-токоферола. (УФ-контроль см. 5.6.2.3; стабилизация см. 7.4 наблюдения).

3.12. 2,6-Ди-трет-бутил-4-метилфенол (ВНТ) (см. наблюдения 7.5)

4. Аппарат

4.1. Вакуумный ротационный испаритель

4.2. Янтарная посуда

4.2.1. Колбы плоскодонные или конические, 500 мл, с притертой раструбной крышкой.

4.2.2. Колбы градуированные с притертыми пробками, узкогорлые, вместимостью 10, 25, 100 и 500 мл.

4.2.3. Воронки делительные, конические, 1000 мл, с притертыми пробками

4.2.4. Колбы грушевидной формы объемом 250 мл с притертыми пробками.

4.3. Конденсатор Аллина, длина рубашки 300 мм, с матовым соединением, с переходником для газоподводящей трубы

4.4. Гофрированная фильтровальная бумага для разделения фаз диаметром 185 мм (например, Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Оборудование для ВЭЖХ с системой инъекции

4.5.1. Жидкостная хроматографическая колонка, 250 мм х 4 мм, C18, насадка 5 или 10 мкм, или эквивалентная

4.5.2. Флуоресцентный или УФ-детектор с регулируемой длиной волны

4.6. Спектрофотометр с кварцевой кюветой 10 мм.

4.7. Водяная баня с магнитной мешалкой

4.8. Экстракционный аппарат (см. рисунок 1), состоящий из:

4.8.1. Стеклянный баллон емкостью 1 л с притертым стеклянным горлышком и пробкой.

4.8.2. Вставка из матового стекла с боковым кронштейном и регулируемой трубкой, проходящей через центр. Регулируемая трубка должна иметь нижний конец U-образной формы и жиклер на противоположном конце, чтобы верхний слой жидкости в цилиндре можно было переносить в делительную воронку.

5. Процедура

Примечание:

Витамин Е чувствителен к (УФ) свету и окислению. Все операции следует проводить в условиях отсутствия света (используя темную посуду или посуду, защищенную алюминиевой фольгой) и кислорода (продувка азотом). Во время откачки воздух над жидкостью следует заменять азотом (избегайте избыточного давления, время от времени ослабляя пробку).

5.1. Подготовка образца

Измельчите образец так, чтобы он прошел через сито с размером ячеек 1 мм, стараясь избегать выделения тепла. Измельчение необходимо проводить непосредственно перед взвешиванием и омылением, в противном случае возможны потери витамина Е.

5.2. Омыление

В зависимости от содержания витамина Е взвешивают от 2 до 25 г пробы с точностью до 0,01 г в плоскодонную или коническую колбу вместимостью 500 мл (4.2.1). Добавляют последовательно, перемешивая, 130 мл этанола (3.1), примерно 100 мг БНТ (3.12), 2 мл раствора аскорбата натрия (3.5) и 2 мл раствора сульфида натрия (3.6). Прикрепите к колбе конденсатор (4.3) и погрузите колбу в водяную баню с магнитной мешалкой (4.7). Нагрейте до кипения и дайте настояться с обратным холодильником в течение пяти минут. Затем через холодильник (4.3) добавляют 25 мл раствора гидроксида калия (3.4) и кипятят с обратным холодильником еще 25 мин при перемешивании под медленным током азота. Затем промойте конденсатор примерно 20 мл воды и охладите содержимое колбы до комнатной температуры.

5.3. Добыча

Омыляющий раствор количественно переносят путем промывки общим объемом 250 мл воды в делительную воронку вместимостью 1000 мл (4.2.3) или в экстракционный аппарат (4.8). Колбу для омыления ополаскивают последовательно 25 мл этанола (3.1) и 100 мл петролейного эфира (3.2) и переносят смывы в делительную воронку или в экстракционный аппарат. Соотношение воды и этанола в объединенных растворах должно составлять примерно 2:1. Энергично встряхивайте в течение двух минут и дайте отстояться в течение двух минут.

5.3.1. Экстракция с использованием делительной воронки (4.2.3)

Когда слои разделятся (см. наблюдение 7.3), перенесите слой легкой нефти в другую делительную воронку (4.2.3). Эту экстракцию повторяют дважды, используя 100 мл петролейного эфира (3.2) и дважды, используя 50 мл петролейного эфира (3.2).

Объединенные экстракты промывают в делительной воронке дважды, осторожно перемешивая (во избежание образования эмульсий) порциями воды по 100 мл, а затем повторным встряхиванием с последующими порциями воды по 100 мл до тех пор, пока вода не станет бесцветной при добавлении раствора фенолфталеина (3.7). (обычно достаточно четырехкратной стирки). Промытый экстракт фильтруют через сухой складчатый фильтр для разделения фаз (4.4) для удаления взвешенной воды в градуированную колбу вместимостью 500 мл (4.2.2). Промойте делительную воронку и фильтр 50 мл вазелина (3.2), доведите до метки вазелином (3.2) и хорошо перемешайте.

5.3.2. Экстракция с использованием экстракционного аппарата (4.8)

Когда слои разделятся (см. наблюдение 7.3), замените пробку стеклянного цилиндра (4.8.1) на вставку из матового стекла (4.8.2) и расположите U-образный нижний конец регулируемой трубки так, чтобы он находился чуть выше уровень интерфейса. Подав давление из линии азота на боковой патрубок, переносят верхний слой легкой нефти в делительную воронку емкостью 1000 мл (4.2.3). Добавьте 100 мл петролейного эфира (3.2) в стеклянный цилиндр, закройте пробкой и хорошо встряхните. Дайте слоям разделиться и перенесите верхний слой в делительную воронку, как и раньше. Повторите процедуру экстракции еще с 100 мл петролейного эфира (3.2), затем дважды порциями петролейного эфира по 50 мл (3.2) и добавьте слои петролейного эфира в делительную воронку.

Промойте объединенные экстракты легкой нефти, как описано в 5.3.1, и действуйте, как описано там.

5.4. Приготовление раствора образца для ВЭЖХ

Пипеткой вносят аликвоту легкого петролейного раствора (из 5.3.1 или 5.3.2) в грушевидную колбу вместимостью 250 мл (4.2.4). Растворитель выпаривают практически досуха на роторном испарителе (4.1) при пониженном давлении при температуре бани не более 40 °С. Восстановите атмосферное давление, впустив азот (3.9), и снимите колбу с ротационного испарителя. Оставшийся растворитель удаляют током азота (3.9) и остаток растворяют немедленно в известном объеме (10-100 мл) метанола (3.3) (концентрация DL-α-токоферола должна быть в пределах 5 мкг/мл). до 30 мкг/мл).

5.5. Определение методом ВЭЖХ

Витамин Е отделяют на колонке с обращенной фазой C18 (4.5.1) и концентрацию измеряют с помощью детектора флуоресценции (возбуждение: 295 нм, эмиссия: 330 нм) или УФ-детектора (292 нм) (4.5.2).

Вводят аликвоту (например, 20 мкл) метанольного раствора, полученного в 5.4, и элюируют подвижной фазой (3.8). Рассчитайте среднюю высоту пика (площадь) нескольких введений одного и того же раствора пробы и среднюю высоту пика (площадь) нескольких введений калибровочных растворов (5.6.2).

Условия ВЭЖХ

В качестве ориентира предлагаются следующие условия; могут быть использованы и другие условия при условии, что они дают эквивалентные результаты.

>ТАБЛИЦА>

5.6. Калибровка (ацетат DL-α-токоферола или DL-α-токоферол)

5.6.1. Стандарт ацетата DL-α-токоферола

5.6.1.1. Приготовление рабочего стандартного раствора

Переносят пипеткой 25 мл исходного раствора ацетата DL-α-токоферола (3.10.1) в плоскодонную или коническую колбу вместимостью 500 мл (4.2.1) и гидролизуют, как описано в разделе 5.2. Затем экстрагируют петролейным эфиром (3.2) по 5.3 и доводят объем петролейным эфиром до 500 мл. 25 мл этого экстракта упаривают на роторном испарителе (см. 5.4) почти досуха, остаток растворителя удаляют током азота (3.9) и остаток перерастворяют в 25,0 мл метанола (3.3). Номинальная концентрация этого раствора составляет 45,5 мкг DL-α-токоферола на мл, что эквивалентно 50 мкг ацетата DL-α-токоферола на мл. Рабочий стандартный раствор должен быть свежеприготовленным перед использованием.

5.6.1.2. Приготовление калибровочных растворов и калибровочного графика

1,0, 2,0, 4,0 и 10,0 мл рабочего стандартного раствора переносят в ряд градуированных колб вместимостью 20 мл, доводят до метки метанолом (3.3) и перемешивают. Номинальные концентрации этих растворов составляют 2,5, 5,0, 10,0 и 25,0 мкг/мл ацетата DL-α-токоферола, т.е. е. 2,28, 4,55, 9,10 мкг/мл и 22,8 мкг/мл DL-α-токоферола.

Введите по 20 мкл каждого калибровочного раствора несколько раз и определите среднюю высоту пика (площадь). Используя средние высоты пиков (площади), постройте калибровочный график.

5.6.1.3. УФ-стандартизация исходного раствора ацетата DL-α-токоферола (3.10.1)

Разбавьте 5,0 мл исходного раствора ацетата DL-α-токоферола (3.10.1) до 25,0 мл этанолом и измерьте УФ-спектр этого раствора относительно этанола (3.1) в спектрофотометре (4.6) между 250 нм и 320 нм.

Максимум поглощения должен находиться при 284 нм:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.004201.EPS">

При таком разведении должно быть получено значение экстинкции от 0,84 до 0,88.

5.6.2. Стандарт DL-α-токоферола

5.6.2.1. Приготовление рабочего стандартного раствора

2,0 мл исходного раствора DL-α-токоферола (3.11.1) переносят пипеткой в ​​градуированную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в метаноле (3.3) и доводят до метки метанолом. Номинальная концентрация этого раствора составляет 40 мкг DL-α-токоферола на мл, что эквивалентно 44,0 мкг ацетата DL-α-токоферола на мл. Рабочий стандартный раствор должен быть свежеприготовленным перед использованием.

5.6.2.2. Приготовление калибровочных растворов и калибровочного графика

1,0, 2,0, 4,0 и 10,0 мл рабочего стандартного раствора переносят в ряд градуированных колб вместимостью 20 мл, доводят до метки метанолом (3.3) и перемешивают. Номинальные концентрации этих растворов составляют 2,0, 4,0, 8,0 и 20,0 мкг/мл DL-α-токоферола, т.е. е. 2,20, 4,40, 8,79 мкг/мл и 22,0 мкг/мл ацетат DL-α-токоферола.

Введите по 20 мкл каждого калибровочного раствора несколько раз и определите среднюю высоту пика (площадь). Используя средние высоты пиков (площади), постройте калибровочный график.

5.6.2.3. УФ-стандартизация исходного раствора DL-α-токоферола (3.11.1)

Разбавьте 2,0 мл исходного раствора DL-α-токоферола (3.11.1) до 25,0 мл этанолом и измерьте УФ-спектр этого раствора относительно этанола (3.1) в спектрофотометре (4.6) между 250 и 320 нм. нм. Максимум поглощения должен находиться при 292 нм:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.004202.EPS">

При таком разведении должно быть получено значение экстинкции 0,6.

6. Подсчет результатов

По средней высоте (площади) пиков витамина Е в растворе пробы определяют концентрацию раствора пробы в мкг/мл (рассчитанную как ацетат α-токоферола) по калибровочному графику (5.6.1.2 или 5.6.2.2). .

Содержание витамина Е w в мг/кг образца определяется по следующей формуле:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.004203.EPS">

в котором:

β = концентрация витамина Е в растворе пробы (5.4), мкг/мл.

V1= объем раствора пробы (5.4) в мл.

V2= объем взятой аликвоты 5,4 мл.

m = масса исследуемой навески в г

7. Наблюдения

7.1. Для образцов с низкой концентрацией витамина Е может оказаться полезным объединить легкие нефтяные экстракты двух загрузок омыления (вес: 25 г) в один раствор образца для определения ВЭЖХ.

7.2. Масса взятой на анализ пробы не должна содержать более 2 г жира.

7.3. Если разделения фаз не происходит, добавьте примерно 10 мл этанола (3.1), чтобы разрушить эмульсию.

7.4. После спектрофотометрического измерения ацетата DL-α-токоферола или раствора DL-α-токоферола в соответствии с 5.6.1.3 или 5.6.2.3 соответственно добавляют к раствору (3.10.1 или 3.10.2) приблизительно 10 мг BHT (3.12) и Храните раствор в холодильнике (срок хранения не более четырех недель).

7.5. Вместо BHT можно использовать гидрохинон.

7.6. С использованием нормальной фазовой колонки возможно разделение α-, β-, χ- и δ-токоферолов.

7.7. Вместо раствора аскорбата натрия можно использовать примерно 150 мг аскорбиновой кислоты.

7.8. Вместо раствора сульфида натрия можно использовать примерно 50 мг ЭДТА.

8. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 15 % относительно более высокого результата.

9. Результаты совместного исследования(2)

>ТАБЛИЦА>

Рисунок 1: Экстракционный аппарат (4.8)

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.004401.EPS">

ЧАСТЬ С

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА

1. Цель и сфера применения

Метод предназначен для определения общего и свободного триптофана в кормах. Он не различает D- и L-формы.

2. Принцип

Для определения общего триптофана пробу гидролизуют в щелочных условиях насыщенным раствором гидроксида бария и нагревают до 110°С в течение 20 часов. После гидролиза добавляют внутренний стандарт.

Для определения свободного триптофана пробу экстрагируют в умеренно кислой среде в присутствии внутреннего стандарта.

Триптофан и внутренний стандарт в гидролизате или экстракте определяют методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией.

3. Реагенты

3.1. Необходимо использовать дважды дистиллированную воду или воду эквивалентного качества (проводимость < 10 мкСм/см).

3.2. Стандартное вещество: триптофан (чистота/содержание >= 99 %), высушенный в вакууме над пятиокисью фосфора.

3.3. Внутренний стандарт: α-метилтриптофан (чистота/содержание >= 99 %), высушенный в вакууме над пентоксидом фосфора.

3.4. Окта-гидрат гидроксида бария (необходимо соблюдать осторожность, чтобы не подвергать Ba(OH)2 ·8 H2O чрезмерному воздействию воздуха во избежание образования BaCO3, которое может нарушить определение) (см. наблюдение 9.3).

3.5. Гидроксид натрия

3.6. Ортофосфорная кислота, w = 85 %

3.7. Соляная кислота, ρ20 = 1,19 г/мл

3.8. Метанол, сорт для ВЭЖХ

3.9. Легкий петролейный газ, температура кипения 40-60°С.

3.10. Раствор гидроксида натрия, с = 1 моль/л:

40,0 г NaOH (3.5) растворяют в воде и доводят до 1 л водой (3.1).

3.11. Соляная кислота, с = 6 моль/л:

Возьмите 492 мл HCl (3,7) и доведите водой до 1 л.

3.12. Соляная кислота, с = 1 моль/л:

Возьмите 82 мл HCl (3,7) и доведите до 1 л воды.

3.13. Соляная кислота, с = 0,1 моль/л:

Возьмите 8,2 мл HCl (3,7) и доведите до 1 л воды.

3.14. Ортофосфорная кислота, c = 0,5 моль/л:

Возьмите 34 мл ортофосфорной кислоты (3.6) и доведите до 1 л водой (3.1).

3.15. Концентрированный раствор триптофана (3.2), с = 2,50 мкмоль/мл:

В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 0,2553 г триптофана (3.2) в соляной кислоте (3.13) и доводят до метки соляной кислотой (3.13). Хранить при температуре -18°C не более четырех недель.

3.16. Концентрированный раствор внутреннего стандарта, c = 2,50 мкмоль/мл:

В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 0,2728 г α-метилтриптофана (3.3) в соляной кислоте (3.13) и доводят до метки соляной кислотой (3.13). Хранить при температуре -18°C не более четырех недель.

3.17. Калибровочный стандартный раствор триптофана и внутренний стандарт:

Берут 2,00 мл концентрированного раствора триптофана (3.15) и 2,00 мл концентрированного раствора внутреннего стандарта (α-метилтриптофана) (3.16). Разбавляют водой (3,1) и метанолом (3,8) примерно до того же объема и примерно той же концентрации метанола (10-30 %), что и готовый гидролизат.

Этот раствор должен быть приготовлен свежеприготовленным перед применением.

Во время приготовления беречь от прямых солнечных лучей.

3.18. Уксусная кислота

3.19. 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанол

3.20. Этаноламин > 98 %

3.21. Раствор 1 г 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанола (3.19) в 100 мл метанола (3.8)

3.22. Подвижная фаза для ВЭЖХ: 3,00 г уксусной кислоты (3.18) + 900 мл воды (3.1) + 50,0 мл раствора (3.21) 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанола (3.19) в метанол (3,8) (1 г/100 мл). Доведите pH до 5,00, используя этаноламин (3,20). Довести до 1000 мл водой (3.1)

4. Аппарат

4.1. Оборудование для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором

4.2. Жидкостная хроматографическая колонка, 125 x 4 мм, C18, насадка 3 мкм или эквивалентная

4.3. pH-метр

4.4. Полипропиленовая колба вместимостью 125 мл, с широким горлышком и завинчивающейся крышкой.

4.5. Мембранный фильтр, 0,45 мкм

4.6. Автоклав, 110 (+- 2)оС, 1,4 (+- 0,1) бар

4.7. Механический шейкер или магнитная мешалка

4.8. Вихревой смеситель

5. Процедура

5.1. Подготовка образцов

Образец измельчают, пропуская через сито 0,5 мм. Перед измельчением образцы с высоким содержанием влаги должны быть либо высушены на воздухе при температуре не выше 50°C, либо сублимированы. Образцы с высоким содержанием жира перед измельчением следует экстрагировать петролейным эфиром (3.9).

5.2. Определение свободного триптофана (экстракт)

Отвешивают с точностью до 1 мг соответствующее количество (1–5 г) подготовленной пробы (5.1) и помещают в коническую колбу. Добавляют 100,0 мл соляной кислоты, с = 0,1 моль/л (3.13) и 5,00 мл концентрированного раствора внутреннего стандарта (3.16). Встряхивайте или перемешивайте в течение 60 мин. с помощью механического шейкера или магнитной мешалки (4.7). Дайте осадку отстояться и перелейте пипеткой 10,0 мл надосадочного раствора в химический стакан. Добавьте 5 мл ортофосфорной кислоты, с = 0,5 моль/л (3,14). Доведите pH до 3,0, используя гидроксид натрия, c = 1,0 моль/л (3,10). Добавьте достаточное количество метанола (3.8), чтобы получить концентрацию метанола от 10 до 30 % в конечном объеме. Переносят в мерную колбу соответствующего объема и разбавляют водой до объема, необходимого для хроматографии (приблизительно такого же объема, как калибровочный стандартный раствор (3.17)).

Перед введением в колонку ВЭЖХ профильтруйте несколько мл раствора через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (4.5). Переходят к этапу хроматографии согласно пункту 5.4.

Защищайте стандартный раствор и экстракты от прямых солнечных лучей. Если невозможно проанализировать экстракты в тот же день, экстракты можно хранить при температуре 5°C максимум три дня.

5.3. Определение общего триптофана (гидролизата).

В полипропиленовую колбу (4.4) отвешивают с точностью до 0,2 мг от 0,1 до 1 г подготовленной пробы (5.1). Навеска пробы должна иметь содержание азота около 10 мг. Добавьте 8,4 г октагидрата гидроксида бария (3.4) и 10 мл воды. Смешайте вихревой мешалкой (4.8) или магнитной мешалкой (4.7). Оставьте в смеси магнит с тефлоновым покрытием. Промойте стенки сосуда 4 мл воды. Наденьте завинчивающуюся крышку и неплотно закройте колбу. Переносят в автоклав (4.6) с кипящей водой и паром в течение 30-60 мин. Закройте автоклав и автоклавируйте при температуре 110 (+-2)°С в течение 20 часов.

Перед открытием автоклава уменьшите температуру чуть ниже 100°C. Чтобы избежать кристаллизации Ba(OH)2 ·8H2O, к теплой смеси добавьте 30 мл воды комнатной температуры. Аккуратно встряхните или перемешайте. Добавьте 2,00 мл концентрированного раствора внутреннего стандарта (α-метилтриптофана) (3.16). Охладите сосуды на водяной/ледяной бане в течение 15 минут.

Затем добавляют 5 мл ортофосфорной кислоты, с = 0,5 моль/л (3.14). Поместите сосуд в охлаждающую баню и нейтрализуйте HCl, с = 6 моль/л (3.11), при перемешивании и доведите pH до 3,0 с помощью HCl, с = 1 моль/л (3.12). Добавьте достаточное количество метанола, чтобы получить концентрацию метанола от 10 до 30 % в конечном объеме. Переносят в мерную колбу соответствующего объема и разбавляют водой до определенного объема, необходимого для хроматографии (например, 100 мл). Добавление метанола не должно вызывать выпадения осадка.

Перед введением в колонку ВЭЖХ профильтруйте несколько мл раствора через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (4.5). Переходят к этапу хроматографии согласно пункту 5.4.

Защищайте стандартный раствор и гидролизаты от прямых солнечных лучей. Если невозможно проанализировать гидролизаты в тот же день, их можно хранить при температуре 5°C максимум три дня.

5.4. Определение ВЭЖХ

В качестве руководства предлагаются следующие условия изократического элюирования; могут быть использованы и другие условия при условии, что они дают эквивалентные результаты (см. также замечания 9.1 и 9.2):

>ТАБЛИЦА>

6. Подсчет результатов

>ФАЙЛ PIC= "L_2000174EN.004701.EPS">

A = площадь пика внутреннего стандарта, раствор калибровочного стандарта (3.17)

B = площадь пика триптофана, экстракта (5.2) или гидролизата (5.3).

C = объем в мл (2 мл) концентрированного раствора триптофана (3.15), добавленного к калибровочному раствору (3.17).

D = концентрация в мкмоль/мл (= 2,50) концентрированного раствора триптофана (3.15), добавленного к калибровочному раствору (3.17).

E = объем в мл концентрированного раствора внутреннего стандарта (3.16), добавленного при экстракции (5.2) (= 5,00 мл) или к гидролизату (5.3) (= 2,00 мл).

F = площадь пика внутреннего стандарта, экстракта (5.2) или гидролизата (5.3).

G = площадь пика триптофана, калибровочный стандартный раствор (3.17)

H = объем в мл (= 2,00 мл) концентрированного раствора внутреннего стандарта (3.16), добавленного к раствору калибровочного стандарта (3.17).

W = вес образца в г (с поправкой на исходный вес, если он высушен и/или обезжирен)

MW= молекулярная масса триптофана (= 204,23)

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % относительно наивысшего результата.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование сообщества (четвертое взаимное сравнение), в ходе которого три образца были проанализированы 12 лабораториями для сертификации метода гидролиза. Повторные (5) анализы проводили для каждого образца. Результаты приведены в следующей таблице:

>ТАБЛИЦА>

Было организовано еще одно совместное исследование Сообщества (третье взаимное сравнение), в ходе которого два образца были проанализированы 13 лабораториями для сертификации метода экстракции свободного триптофана. Повторные (5) анализы проводили для каждого образца. Результаты приведены в следующей таблице:

>ТАБЛИЦА>

Было организовано еще одно сравнительное исследование Сообщества, в ходе которого четыре образца были проанализированы в семи лабораториях с целью сертификации триптофана на гидролиз. Результаты приведены ниже. Для каждого образца было проведено пять повторных анализов.

>ТАБЛИЦА>

9. Наблюдения

9.1. Соблюдение особых хроматографических условий может обеспечить лучшее разделение триптофана и α-метилтриптофана.

>ТАБЛИЦА>

9.2. Хроматография будет варьироваться в зависимости от типа ВЭЖХ и используемого материала насадки колонки. Выбранная система должна обеспечивать базовое разделение триптофана и внутреннего стандарта. Кроме того, важно, чтобы продукты разложения были хорошо отделены от триптофана и внутреннего стандарта. Гидролизаты без внутреннего стандарта следует анализировать для проверки базовой линии по внутреннему стандарту на наличие примесей. Важно, чтобы время анализа было достаточно продолжительным для элюирования всех продуктов разложения, в противном случае поздно элюирующиеся пики могут помешать последующим хроматографическим анализам.

В рабочем диапазоне хроматографическая система должна давать линейный отклик. Линейный ответ следует измерять при постоянной (нормальной) концентрации внутреннего стандарта и изменяющихся концентрациях триптофана. Важно, чтобы размеры пиков триптофана и внутреннего стандарта находились в пределах линейного диапазона системы ВЭЖХ/флуоресценции. Если пик(ы) триптофана и/или внутреннего стандарта слишком малы или слишком высоки, анализ следует повторить с другим размером образца и/или с измененным конечным объемом.

9.3. Гидроксид бария

С возрастом гидроксид бария растворяется все труднее. Это приводит к неясному решению для определения ВЭЖХ, что может привести к заниженным результатам для триптофана.

(1) Проведено рабочей группой по кормам Ассоциации немецких сельскохозяйственных научно-исследовательских институтов (VDLUFA).

(2) Проведено рабочей группой по кормам Ассоциации немецких сельскохозяйственных научно-исследовательских институтов (VDLUFA).