Директива Комиссии 1999/76/EC от 23 июля 1999 г., устанавливающая метод Сообщества для определения лазалоцида натрия в кормах (текст имеет отношение к ЕЭЗ)

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 1999/76/EC

от 23 июля 1999 г.

создание метода анализа Сообщества для определения лазалоцида натрия в кормах

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов(1), с последними поправками, внесенными Актом о присоединении Австрии, Финляндии и Швеции, и в частности, статью 2 этого документа,

(1) Принимая во внимание, что Директива 70/373/EEC предусматривает, что официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с законами, постановлениями и административными положениями, регулирующими их качество и состав, должен осуществляться с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества. ;

(2) Принимая во внимание, что Директива Совета 70/524/EEC от 23 ноября 1970 г. о добавках в кормах(2) с последними поправками, внесенными Регламентом Комиссии (ЕС) № 866/1999 от 26 апреля 1999 г.(3), предусматривает, что содержание лазалоцида натрия должно быть указаны на маркировке, где эти вещества добавляются в премиксы и корма;

(3) Принимая во внимание, что для проверки этих веществ должны быть установлены методы анализа Сообщества;

(4) Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны обеспечить, чтобы анализы, проводимые с целью официального контроля содержания лазалоцида в кормах и премиксах, проводились с использованием метода, изложенного в Приложении к настоящему Соглашению.

Статья 2

Государства-члены должны ввести в силу не позднее 31 января 2000 г. законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения положений настоящей Директивы. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Они начнут применять эти меры с 1 февраля 2000 года.

Когда государства-члены ЕС принимают эти меры, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки должен быть принят государствами-членами.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 23 июля 1999 года.

Для Комиссии

Франц ФИШЛЕР

Член Комиссии

(1) OJ L 170, 3 августа 1970 г., с. 2.

(2) OJ L 270, 14.12.1970, с. 1.

(3) OJ L 108, 27 апреля 1999 г., с. 20.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛАЗАЛОКИДА НАТРИЯ

Натриевая соль полиэфира монокарбоновой кислоты, продуцируемая Streptomyces lasaliensis.

1. Цель и сфера применения

Метод предназначен для определения лазалоцида натрия в кормах и премиксах. Предел обнаружения 5 мг/кг, предел определения 30 мг/кг.

2. Принцип

Ласалоцид натрия экстрагируют из образца подкисленным метанолом и определяют обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием спектрофлуориметрического детектора.

3. Реагенты

3.1. Дигидрофосфат калия (KH2PO4)

3.2. Ортофосфорная кислота, w = 85 %

3.3. Раствор ортофосфорной кислоты, σ = 20 %

23,5 мл ортофосфорной кислоты (3.2) разбавьте водой до 100 мл.

3.4. 6-Метил-2-гептиламин (1,5-диметилгексиламин), w = 99 %

3.5. Метанол, сорт для ВЭЖХ

3.6. Соляная кислота, ρ20 1,19 г/мл

3.7. Фосфатный буферный раствор, c = 0,01 моль/л

1,36 г KH2PO4 (3.1) растворяют в 500 мл воды (3.11), добавляют 3,5 мл ортофосфорной кислоты (3.2) и 10,0 мл 6-метил-2-гептиламина (3.4). Доводят pH до 4,0 раствором ортофосфорной кислоты (3.3) и разбавляют водой (3.11) до 1000 мл.

3.8. Подкисленный метанол

5,0 мл соляной кислоты (3.6) переносят в градуированную колбу вместимостью 1000 мл, доводят до метки метанолом (3.5) и перемешивают. Этот раствор должен быть приготовлен свежеприготовленным перед применением.

3.9. Подвижная фаза ВЭЖХ, фосфатный буфер-метаноловый раствор 5+95 (V+V)

Смешайте 5 мл фосфатного буферного раствора (3.7) с 95 мл метанола (3.5).

3.10. Ласалоцид натрия стандартное вещество гарантированной чистоты, C34H53O8Na (натриевая соль полиэфира монокарбоновой кислоты, производимая Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1. Стандартный раствор лазалоцида натрия, 500 мкг/мл

Отвешивают с точностью до 0,1 мг, 50 мг лазалоцида натрия (3.10) в градуированную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в подкисленном метаноле (3.8), доводят до метки тем же растворителем и перемешивают. Этот раствор должен быть свежеприготовленным перед использованием.

3.10.2. Промежуточный стандартный раствор лазалоцида натрия, 50 мкг/мл

Вносят пипеткой 10,0 мл исходного стандартного раствора (3.10.1) в градуированную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подкисленным метанолом (3.8) и перемешивают. Этот раствор должен быть приготовлен свежеприготовленным перед применением.

3.10.3. Калибровочные решения

В серию градуированных колб вместимостью 50 мл переносят 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 мл промежуточного стандартного раствора (3.10.2). Доведите до метки подкисленным метанолом (3,8) и перемешайте. Эти растворы соответствуют 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 мкг лазалоцида натрия на мл соответственно. Эти растворы должны быть приготовлены свежими перед использованием.

3.11. Вода, степень ВЭЖХ

4. Аппарат

4.1. Ультразвуковая ванна (или встряхивающая водяная баня) с контролем температуры.

4.2. Мембранные фильтры, 0,45 мкм

4.3. Оборудование для ВЭЖХ с системой ввода, подходящее для введения объемов 20 мкл.4.3.1. Жидкостная хроматографическая колонка 125 мм x 4 мм, обращенно-фазовая C18, насадка 5 мкм или эквивалентная

4.3.2. Спектрофлуориметр с регулируемой длиной волны, регулировкой длин волн возбуждения и излучения.

5. Процедура

5.1. Общий

5.1.1. Пустой канал

Для проведения теста на восстановление (5.1.2) необходимо проанализировать чистый корм, чтобы убедиться в отсутствии лазалоцида натрия и мешающих веществ. Холостой корм должен быть аналогичен типу образца, и лазалоцид натрия или мешающие вещества не должны быть обнаружены.

5.1.2. Тест восстановления

Тест на восстановление следует проводить путем анализа контрольного корма, обогащенного добавлением количества лазалоцида натрия, аналогичного количеству, присутствующему в образце. Для обогащения на уровне 100 мг/кг переносят 10,0 мл исходного стандарта (3.10.1) в коническую колбу вместимостью 250 мл и выпаривают раствор примерно до 0,5 мл. Добавьте 50 г чистого корма, тщательно перемешайте и оставьте на 10 минут, еще раз несколько раз перемешав, прежде чем приступить к этапу экстракции (5.2).

Альтернативно, если нет холостого сырья, аналогичного типу образца (см. 5.1.1), можно провести испытание на восстановление с помощью стандартного метода добавления. В этом случае анализируемый образец обогащается количеством лазалоцида натрия, аналогичным тому, которое уже присутствует в образце. Этот образец анализируется вместе с необогащенным образцом, и выход рассчитывается путем вычитания.

5.2. Добыча

5.2.1. Корма

Взвешивают с точностью до 0,01 г от 5 до 10 г пробы в коническую колбу вместимостью 250 мл с пробкой. Добавляют пипеткой 100,0 мл подкисленного метанола (3.8). Свободно закройте пробку и покрутите, чтобы разогнать. Поместите колбу в ультразвуковую баню (4.1) при температуре примерно 40°С на 20 минут, затем выньте и охладите до комнатной температуры. Дать постоять около 1 часа, пока взвесь не осядет, затем отфильтровать аликвоту через мембранный фильтр 0,45 мкм (4.2) в подходящий сосуд. Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.2.2. Премиксы

Взвешивают с точностью до 0,001 г около 2 г неразмолотого премикса и помещают в градуированную колбу вместимостью 250 мл. Добавьте 100,0 мл подкисленного метанола (3.8) и перемешайте до диспергирования. Поместите колбу и ее содержимое в ультразвуковую баню (4.1) при температуре примерно 40°С на 20 минут, затем выньте и охладите до комнатной температуры. Разбавьте до метки подкисленным метанолом (3,8) и тщательно перемешайте. Дают постоять в течение одного часа до осаждения взвеси, затем фильтруют аликвоту через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (4.2). Разбавьте соответствующий объем прозрачного фильтрата подкисленным метанолом (3.8) для получения конечного тестируемого раствора, содержащего около 4 мкг/мл лазалоцида натрия. Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.3. Определение ВЭЖХ

5.3.1. Параметры

В качестве ориентира предлагаются следующие условия; другие условия могут быть использованы при условии, что они дают эквивалентные результаты:

>ТАБЛИЦА>

Проверяют стабильность хроматографической системы, несколько раз вводя калибровочный раствор (3.10.3), содержащий 4,0 мкг/мл, до достижения постоянной высоты пика (или площади) и времени удерживания.

5.3.2. Калибровочный график

Вводят каждый калибровочный раствор (3.10.3) несколько раз и определяют среднюю высоту пика (площадь) для каждой концентрации. Постройте калибровочный график, используя среднюю высоту пика (площадь) по оси ординат и соответствующие концентрации в мкг/мл по оси абсцисс.

5.3.3. Пример решения

Вводят экстракты проб, полученные в 5.2.1 или 5.2.2, несколько раз, используя тот же объем, что и для калибровочного раствора, и определяют средние высоты (площади) пиков лазалоцида натрия.

6. Подсчет результатов

По средней высоте (площади) пика, полученному при впрыскивании раствора пробы (5.3.3), определяют концентрацию лазалоцида натрия (мкг/мл), сверяясь с калибровочным графиком.

6.1. Корма

Содержание лазалоцида натрия, w (мг/кг) в образце определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

где:

ß = концентрация лазалоцида натрия в растворе пробы (5.2.1), мкг/мл.

V1 = объем экстракта пробы согласно 5.2.1 в мл (т.е. 100)

m = масса исследуемой навески в г

6.2. Премиксы

Содержание лазалоцида натрия, w (мг/кг) в образце определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

где:

ß = концентрация лазалоцида натрия в растворе пробы (5.2.2), мкг/мл.

V2= объем экстракта пробы согласно 5.2.2 в мл (т.е. 250)

f = коэффициент разбавления согласно 5.2.2.

m = масса исследуемой навески в г

7. Проверка результатов

7.1. Личность

Методы, основанные на спектрофлуориметрии, менее подвержены помехам, чем те, в которых используется УФ-детектирование. Идентичность аналита можно подтвердить с помощью совместной хроматографии.

7.1.1. Кохроматография

Экстракт образца (5.2.1 или 5.2.2) обогащают добавлением соответствующего количества калибровочного раствора (3.10.3). Количество добавленного лазалоцида натрия должно быть аналогично количеству лазалоцида натрия, обнаруженного в экстракте образца. Только высоту пика лазалоцида натрия следует увеличивать в зависимости от количества добавленного лазалоцида натрия и разведения экстракта. Ширина пика на половине высоты должна находиться в пределах ± 10 % от исходной ширины пика, полученного необогащенным экстрактом образца.

7.2. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

- 15 % относительно высшего значения для содержания лазалоцида натрия от 30 мг/кг до 100 мг/кг;

- 15 мг/кг при содержании лазалоцида натрия от 100 мг/кг до 200 мг/кг;

- 7,5 % относительно более высокого значения при содержании лазалоцида натрия более 200 мг/кг.

7.3. Восстановление

Для обогащенного (холостого) образца корма извлечение должно составлять не менее 80 %. Для образцов обогащенных премиксов степень извлечения должна составлять не менее 90 %.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование(1), в ходе которого 12 лабораторий проанализировали 2 премикса (образцы 1 и 2) и 5 ​​кормов (образцы 3-7). Для каждого образца были проведены повторные анализы. Результаты приведены в следующей таблице:

>ТАБЛИЦА>

L= количество лабораторий

n = количество отдельных результатов

Sr= стандартное отклонение повторяемости

SR = стандартное отклонение воспроизводимости

CVr= коэффициент вариации повторяемости, %

CVR= коэффициент вариации воспроизводимости, %

(1) Аналитик, 1995, 120, 2175-2180.