Директива Комиссии 98/73/EC от 18 сентября 1998 г. об адаптации к техническому прогрессу в 24-й раз. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (Текст с релевантностью для ЕЭЗ)

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 98/73/EC от 18 сентября 1998 г., в 24-й раз адаптирующаяся к техническому прогрессу. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (Текст с релевантностью для ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 67/548/EEC от 27 июня 1967 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (1), с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 97/69/ ЕС (2), и в частности его статья 28,

Принимая во внимание, что Приложение I к Директиве 67/548/EEC содержит список опасных веществ, а также подробные сведения о процедурах классификации и маркировки в отношении каждого вещества; поскольку современные научные и технические знания показывают, что список опасных веществ в этом Приложении следует адаптировать и дополнить;

Поскольку Приложение V к Директиве 67/548/ЕЕС устанавливает методы определения физико-химических свойств, токсичности и экотоксичности веществ и препаратов; поскольку необходимо адаптировать это Приложение к техническому прогрессу;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Комитета по адаптации к техническому прогрессу Директив по устранению технических барьеров в торговле опасными веществами и препаратами,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

В Директиву 67/548/EEC настоящим вносятся следующие поправки:

1. В Приложение I вносятся следующие изменения:

(a) записи в Приложении I к настоящей Директиве заменяют соответствующие записи в Приложении I к Директиве 67/548/EEC;

(b) записи в Приложении II к настоящей Директиве включены в Приложение I к Директиве 67/548/EEC.

2. В Приложение V вносятся следующие изменения:

(a) тексты Приложений III A, III B и III C к настоящей Директиве добавлены в Часть A Приложения V к Директиве 67/548/EEC;

(b) текст Приложения III D к настоящей Директиве добавлен в Часть C Приложения V к Директиве 67/548/EEC.

Статья 2

Государства-члены должны ввести в действие законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 31 октября 1999 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в ​​случае их официальной публикации. Государства-члены ЕС должны определить, как следует делать такую ​​ссылку.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 18 сентября 1998 года.

Для Комиссии

Ритт БЬЕРРЕГАРД

Член Комиссии

(1) OJ 196, 16. 8. 1967, с. 1.

(2) OJ L 343, 13.12.1997, с. 19.

ПРИЛОЖЕНИЕ I - БИЛАГ I - АНХАНГ I - РАДА I - ПРИЛОЖЕНИЕ I - ПРИЛОЖЕНИЕ I - АЛЛЕГАТО I - БИЛАГЕ I - ПРИЛОЖЕНИЕ I - ЛИИТЕ I - БИЛАГА I

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

ПРИЛОЖЕНИЕ II - БИЛАГ II - АНХАН II - РАНДА II - ПРИЛОЖЕНИЕ II - ПРИЛОЖЕНИЕ II - АЛЛЕГАТО II - БИЛАГЕ II - ПРИЛОЖЕНИЕ II - ЛИИТЕ II - БИЛАГА II

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

ПРИЛОЖЕНИЕ III А

А.18. СРЕДНЕЧИСЛЕННАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА И МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМЕРОВ

1. МЕТОД

Этот метод гель-проникающей хроматографии является копией OECD TG 118 (1996). Основные принципы и дополнительная техническая информация приведены в ссылке 1.

1.1. Введение

Поскольку свойства полимеров настолько разнообразны, невозможно описать один единственный метод, точно устанавливающий условия разделения и оценки, охватывающий все возможности и особенности, возникающие при разделении полимеров. В частности, сложные полимерные системы часто не поддаются гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Если ГПХ невозможна, молекулярную массу можно определить другими методами (см. Приложение). В таких случаях необходимо предоставить полную информацию и обоснование используемого метода.

Описываемый метод основан на стандарте DIN 55672 (1). Подробную информацию о том, как проводить эксперименты и как оценивать данные, можно найти в этом стандарте DIN. В случае необходимости изменения условий эксперимента эти изменения должны быть обоснованы. Могут использоваться и другие стандарты, если на них имеются полные ссылки. В описанном методе для калибровки используются образцы полистирола известной полидисперсности, и его, возможно, придется модифицировать, чтобы он подходил для определенных полимеров, например водорастворимые и длинноцепочечные разветвленные полимеры.

1.2. Определения и единицы измерения

Среднечисловую молекулярную массу Mn и средневесовую молекулярную массу Mw определяют с использованием следующих уравнений:

Mn = >NUM>Ói = lnHi

>ДЕН>Рвота = ln

>NUM>Привет/

>день>ср

Mw = >NUM>Oi = lnHixMi

>DEN>Рвота = lnHi

где,

Hi – уровень сигнала детектора от базовой линии для удерживаемого объема Vi.

Mi — молекулярная масса полимерной фракции при удерживаемом объеме Vi,

n — количество точек данных.

Ширина молекулярно-массового распределения, которая является мерой дисперсности системы, определяется соотношением Mw/Mn.

1.3. Эталонные вещества

Поскольку ГПХ является относительным методом, необходимо провести калибровку. Для этого обычно используют узкораспределенные, линейно построенные стандарты полистирола с известными средними молекулярными массами Mn и Mw и известным молекулярно-массовым распределением. Калибровочную кривую можно использовать при определении молекулярной массы неизвестной пробы только в том случае, если условия разделения пробы и стандартов выбраны идентичным образом.

Установленная связь между молекулярной массой и объемом элюирования действительна только при определенных условиях конкретного эксперимента. Условия включают, прежде всего, температуру, растворитель (или смесь растворителей), условия хроматографии и разделительную колонку или систему колонок.

Молекулярные массы образца, определенные таким образом, являются относительными величинами и описываются как «молекулярные массы, эквивалентные полистиролу». Это означает, что в зависимости от структурных и химических различий между образцом и стандартами молекулярные массы могут в большей или меньшей степени отклоняться от абсолютных значений. Если используются другие стандарты, например. полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиметилметакрилат, полиакриловая кислота, необходимо указать причину.

1.4. Принцип метода испытаний

Как молекулярно-массовое распределение образца, так и средние молекулярные массы (Mn, Mw) можно определить с помощью ГПХ. ГПХ – это особый вид жидкостной хроматографии, при котором образец разделяется по гидродинамическим объемам отдельных компонентов (2).

Разделение происходит при прохождении образца через колонку, заполненную пористым материалом, обычно органическим гелем. Маленькие молекулы могут проникать в поры, тогда как крупные молекулы исключаются. Таким образом, путь больших молекул короче, и они элюируются первыми. Молекулы среднего размера проникают в некоторые поры и позже элюируются. Мельчайшие молекулы со средним гидродинамическим радиусом меньшим, чем поры геля, могут проникать во все поры. Они элюируются последними.

В идеальной ситуации разделение полностью определяется размером молекулярных частиц, но на практике трудно избежать хотя бы некоторых мешающих эффектов поглощения. Неравномерная упаковка колонки и мертвые объемы могут ухудшить ситуацию (2).

Обнаружение осуществляется, например, по показателю преломления или поглощению УФ-излучения и дает простую кривую распределения. Однако, чтобы приписать кривой фактические значения молекулярной массы, необходимо откалибровать колонку, пропуская полимеры с известной молекулярной массой и, в идеале, с очень похожей структурой, например различные стандарты полистирола. Обычно получается кривая Гаусса, иногда искаженная небольшим хвостом в сторону низкой молекулярной массы, вертикальная ось указывает количество по массе элюируемых веществ с различной молекулярной массой, а горизонтальная ось - логарифм молекулярной массы.

1,5. Критерии качества

Повторяемость (относительное стандартное отклонение: RSD) объема элюирования должна быть лучше 0,3%. Требуемая повторяемость анализа должна быть обеспечена корректировкой по внутреннему стандарту, если хроматограмма оценивается в зависимости от времени и не соответствует вышеупомянутому критерию (1). Полидисперсность зависит от молекулярной массы стандартов. Для стандартов полистирола типичными значениями являются:

>ТАБЛИЦА>

1.6. Описание метода испытаний

1.6.1. Приготовление стандартных растворов полистирола

Стандарты полистирола растворяются путем тщательного перемешивания в выбранном элюенте. При приготовлении растворов необходимо учитывать рекомендации производителя.

Концентрации выбранных стандартов зависят от различных факторов, например: объем впрыска, вязкость раствора и чувствительность аналитического детектора. Максимальный объем впрыска должен быть адаптирован к длине колонки, чтобы избежать перегрузки. Типичные объемы ввода для аналитического разделения с использованием ГПХ с колонкой 30 см × 7,8 мм обычно составляют от 40 до 100 мкл. Возможны и большие объемы, но они не должны превышать 250 л. Оптимальное соотношение между объемом ввода и концентрацией должно быть определено до фактической калибровки колонки.

1.6.2. Приготовление раствора образца

В принципе, те же требования применяются и к приготовлению растворов проб. Образец растворяют в подходящем растворителе, например тетрагидрофуран (ТГФ), осторожно встряхивая. Ни при каких обстоятельствах его нельзя растворять с помощью ультразвуковой ванны. При необходимости раствор пробы очищается через мембранный фильтр с размером пор от 0,2 до 2 мкм.

Присутствие нерастворенных частиц должно быть зафиксировано в окончательном отчете, поскольку они могут быть связаны с частицами с высокой молекулярной массой. Для определения массового процента растворенных частиц следует использовать соответствующий метод. Растворы следует использовать в течение 24 часов.

1.6.3. Аппарат

- резервуар для растворителя,

- дегазатор (при необходимости),

- насос,

- гаситель импульсов (при необходимости),

- система впрыска,

- хроматографические колонки,

- детектор,

- расходомер (при необходимости),

- регистратор-процессор данных,

- мусорный бак.

Необходимо обеспечить инертность системы ГПХ по отношению к используемым растворителям (например, путем использования стальных капилляров для растворителя ТГФ).

1.6.4. Система впрыска и подачи растворителя

Определенный объем раствора образца загружается в колонку либо с помощью автоматического пробоотборника, либо вручную в четко определенной зоне. Слишком быстрое извлечение или нажатие поршня шприца, если оно производится вручную, может вызвать изменения в наблюдаемом молекулярно-массовом распределении. Система подачи растворителя должна, насколько это возможно, быть свободной от пульсаций, в идеале иметь демпфер импульсов. Скорость потока составляет порядка 1 мл/мин.

1.6.5. Столбец

В зависимости от образца для характеристики полимера используют либо простую колонку, либо несколько последовательно соединенных колонок. Ряд материалов пористых колонок с определенными свойствами (например, размером пор, пределами исключения) коммерчески доступен. Выбор разделительного геля или длины колонки зависит как от свойств пробы (гидродинамических объемов, молекулярно-массового распределения), так и от конкретных условий разделения, таких как растворитель, температура и скорость потока (1) (2) (3 ).

1.6.6. Теоретические пластины

Колонка или комбинация колонн, используемая для разделения, должна характеризоваться количеством теоретических тарелок. В случае использования ТГФ в качестве растворителя для элюирования это включает загрузку раствора этилбензола или другого подходящего неполярного растворенного вещества в колонку известной длины. Количество теоретических тарелок определяется следующим уравнением:

Н = 5,54 (

>ЧИСЛО>И

>THE>W½

)2 или N = 16 (

>ЧИСЛО>И

>НЕТ>Ой

)2

где,

N - количество теоретических тарелок

Ve — объем элюирования при максимуме пика.

W — ширина пика базовой линии

W½ — ширина пика на половине высоты.

1.6.7. Эффективность разделения

Помимо числа теоретических тарелок, которое является величиной, определяющей ширину полосы, определенную роль играет также эффективность разделения, определяемая крутизной калибровочной кривой. Эффективность разделения колонны получается из следующего соотношения:

>NUM>Ve,M - Ve,(10M

>DEN>площадь поперечного сечения колонны

&ге; 6,0 [

>ЧИСЛО>см3

>DEN>см2

]

где,

Ve,M – объем элюирования полистирола с молекулярной массой Mx

Ve,(10M — объем элюирования полистирола с молекулярной массой в 10 раз большей.

Разрешение системы обычно определяется следующим образом:

R1,2 = 2 × >ЧИСЛО>Ve1 - Ve2

>ДЕН>W1 + W2

× >ЧИСЛО>1

<Дебет>log10 (мА/м1)

где,

Ve1, Ve2 — объемы элюирования двух полистирольных стандартов при максимуме пика.

W1, W2 — ширина пика на базовой линии.

M1, M2 — молекулярные массы в максимуме пика (должны отличаться в 10 раз).

Значение R для колонной системы должно быть больше 1,7 (4).

1.6.8. Растворители

Все растворители должны быть высокой чистоты (для ТГФ используется чистота 99,5%). Резервуар с растворителем (при необходимости в атмосфере инертного газа) должен быть достаточно большим для калибровки колонки и нескольких анализов проб. Растворитель необходимо дегазировать перед его подачей в колонку насосом.

1.6.9. Контроль температуры

Температура важнейших внутренних компонентов (петли ввода, колонок, детектора и трубок) должна быть постоянной и соответствовать выбору растворителя.

1.6.10. Детектор

Целью детектора является количественная регистрация концентрации образца, элюированного из колонки. Чтобы избежать ненужного уширения пиков, объем кюветы детекторной ячейки должен быть как можно меньшим. Его объем не должен превышать 10 мкл, за исключением детекторов светорассеяния и вязкости. Для обнаружения обычно используется дифференциальная рефрактометрия. Однако, если этого требуют особые свойства образца или элюирующего растворителя, можно использовать другие типы детекторов, например УФ/ВИД, ИК, детекторы вязкости и т. д.

2. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

2.1. Данные

Стандарт DIN (1) следует использовать для получения подробных критериев оценки, а также требований, касающихся сбора и обработки данных.

Для каждого образца необходимо провести два независимых эксперимента. Их необходимо анализировать индивидуально.

Mn, Mw, Mw/Mn и Mp должны быть указаны для каждого измерения. Необходимо явно указать, что измеренные значения являются относительными значениями, эквивалентными молекулярным массам используемого стандарта.

После определения объемов удерживания или времени удерживания (возможно, скорректированного с использованием внутреннего стандарта) значения log Mp (Mp — это максимумы пика калибровочного стандарта) наносятся на график в зависимости от одной из этих величин. Для каждой декады молекулярной массы необходимы как минимум две точки калибровки, а для общей кривой, которая должна охватывать расчетную молекулярную массу образца, требуется не менее пяти точек измерения. Конечная точка низкомолекулярной калибровочной кривой определяется н-гексилбензолом или другим подходящим неполярным растворенным веществом. Среднечисловую и средневесовую молекулярные массы обычно определяют посредством электронной обработки данных на основе формул раздела 1.2. В случае использования ручной оцифровки можно обратиться к ASTM D 3536-91 (3).

Кривая распределения должна быть представлена ​​в виде таблицы или в виде рисунка (дифференциальная частота или сумма процентов по отношению к log M). В графическом представлении одна декада молекулярной массы обычно должна составлять около 4 см в ширину, а максимум пика должен составлять около 8 см в высоту. В случае интегральных кривых распределения разница по ординате между 0 и 100 % должна составлять около 10 см.

2.2. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

2.2.1. Тестируемое вещество

- доступная информация об испытуемом веществе (идентичность, добавки, примеси),

- описание обработки образца, наблюдений, проблем.

2.2.2. Инструментарий

- резервуар элюента, инертный газ, дегазация элюента, состав элюента, примеси,

- насос, демпфер импульсов, система впрыска,

- разделительные колонки (производитель, вся информация о характеристиках колонок, таких как размер пор, вид разделительного материала и т. д., количество, длина и порядок используемых колонок),

- количество теоретических тарелок колонны (или их комбинации), эффективность разделения (разрешающая способность системы),

- информация о симметрии вершин,

- температура колонки, вид контроля температуры,

- детектор (принцип измерения, тип, объем кюветы),

- расходомер, если он используется (производитель, принцип измерения),

- система записи и обработки данных (аппаратная и программная).

2.2.3. Калибровка системы

- подробное описание метода построения калибровочной кривой,

- информация о критериях качества данного метода (например, коэффициент корреляции, сумма квадратов ошибок и т. д.),

- информацию обо всех экстраполяциях, предположениях и аппроксимациях, сделанных в ходе экспериментальной процедуры, а также оценки и обработки данных,

- все измерения, используемые для построения калибровочной кривой, должны быть задокументированы в таблице, которая включает следующую информацию для каждой калибровочной точки:

- название образца,

- производитель образца,

- характеристические значения стандартов Mp, Mn, Mw и Mw/Mn, предоставленные изготовителем или полученные в результате последующих измерений, вместе с подробностями о методе определения,

- объем инъекции и концентрация инъекции,

- Значение Mp, используемое для калибровки,

- объем элюата или скорректированное время удерживания, измеренное в максимумах пиков,

- Мп рассчитано на пиковом максимуме,

- процентная погрешность рассчитанного Мп и калибровочного значения.

2.2.4. Оценка:

- оценка по времени: методы, используемые для обеспечения требуемой воспроизводимости (метод коррекции, внутренний стандарт и т. д.),

- информацию о том, проводилась ли оценка на основе объема элюата или времени удерживания,

- информация о пределах оценки, если пик не проанализирован полностью,

- описание методов сглаживания, если они используются,

- процедуры подготовки и предварительной обработки пробы,

- наличие нерастворенных частиц, если таковые имеются,

- объем инъекции (мл) и концентрация инъекции (мг/мл),

- наблюдения, указывающие на эффекты, которые приводят к отклонениям от идеального профиля ГПХ,

- подробное описание всех изменений в процедурах тестирования,

- подробные сведения о диапазонах ошибок,

- любая другая информация и наблюдения, имеющие значение для интерпретации результатов.

3. ССЫЛКИ

(1) DIN 55672 (1995). Гель-проникающая хроматография (ГПХ) с тетрагидрофураном (ТГФ) в качестве элюента, часть 1.

(2) Яу, В.В., Киркланд, Дж.Дж., и Блай, Д.Д., ред. (1979). Современная эксклюзионная жидкостная хроматография, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Стандартный метод определения средних молекулярных масс и молекулярно-массового распределения с помощью жидкостной эксклюзионной хроматографии (гель-проникающая хроматография-ГПХ). Американское общество испытаний и материалов, Филадельфия, Пенсильвания.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Стандартный метод определения средних молекулярных масс и молекулярно-массового распределения полистирола с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Американское общество испытаний и материалов, Филадельфия, Пенсильвания.

Приложение

Примеры других методов определения среднечисленной молекулярной массы (Mn) полимеров

Гель-проникающая хроматография (ГПХ) является предпочтительным методом определения Mn, особенно когда доступен набор стандартов, структура которых сопоставима со структурой полимера. Однако если существуют практические трудности с использованием ГПХ или уже ожидается, что вещество не будет соответствовать нормативному критерию Mn (и это требует подтверждения), доступны альтернативные методы, такие как:

1. Использование коллигативных свойств

1.1. Эбуллиоскопия/криоскопия: включает измерение повышения температуры кипения (эбуллиоскопия) или снижения температуры замерзания (криоскопия) растворителя при добавлении полимера. Метод основан на том факте, что влияние растворенного полимера на температуру кипения/замерзания жидкости зависит от молекулярной массы полимера (1) (2).

Применимость: Мн

ПРИЛОЖЕНИЕ III Б

А.19 НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПОЛИМЕРОВ

1. МЕТОД

Этот метод гель-проникающей хроматографии является копией OECD TG 119 (1996). Основные принципы и дополнительная техническая информация приведены в ссылках.

1.1. Введение

Поскольку свойства полимеров настолько разнообразны, невозможно описать один единственный метод, точно устанавливающий условия разделения и оценки, охватывающий все возможности и особенности, возникающие при разделении полимеров. В частности, сложные полимерные системы часто не поддаются гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Если ГПХ невозможна, молекулярную массу можно определить другими методами (см. Приложение). В таких случаях необходимо предоставить полную информацию и обоснование используемого метода.

Описываемый метод основан на стандарте DIN 55672 (1). Подробную информацию о том, как проводить эксперименты и как оценивать данные, можно найти в этом стандарте DIN. В случае необходимости изменения условий эксперимента эти изменения должны быть обоснованы. Могут использоваться и другие стандарты, если на них имеются полные ссылки. В описанном методе для калибровки используются образцы полистирола известной полидисперсности, и его, возможно, придется модифицировать, чтобы он подходил для определенных полимеров, например водорастворимые и длинноцепочечные разветвленные полимеры.

1.2. Определения и единицы измерения

Низкомолекулярная масса условно определяется как молекулярная масса ниже 1000 дальтон.

Среднечисловую молекулярную массу Mn и средневесовую молекулярную массу Mw определяют с использованием следующих уравнений:

Mn = >NUM>Оé = lnHi

>DEN>Oé = ln

>NUM>Привет/

>день>ср

Mw = >NUM>Оé = lnHixMi

>DEN>Oé = lnHi

где,

Hi – уровень сигнала детектора от базовой линии для удерживаемого объема Vi.

Mi — молекулярная масса полимерной фракции при удерживаемом объеме Vi,

n — количество точек данных.

Ширина молекулярно-массового распределения, которая является мерой дисперсности системы, определяется соотношением Mw/Mn.

1.3. Эталонные вещества

Поскольку ГПХ является относительным методом, необходимо провести калибровку. Для этого обычно используют узкораспределенные, линейно построенные стандарты полистирола с известными средними молекулярными массами Mn и Mw и известным молекулярно-массовым распределением. Калибровочную кривую можно использовать при определении молекулярной массы неизвестной пробы только в том случае, если условия разделения пробы и стандартов выбраны идентичным образом.

Установленная связь между молекулярной массой и объемом элюирования действительна только при определенных условиях конкретного эксперимента. Условия включают, прежде всего, температуру, растворитель (или смесь растворителей), условия хроматографии и разделительную колонку или систему колонок.

Молекулярные массы образца, определенные таким образом, являются относительными величинами и описываются как «молекулярные массы, эквивалентные полистиролу». Это означает, что в зависимости от структурных и химических различий между образцом и стандартами молекулярные массы могут в большей или меньшей степени отклоняться от абсолютных значений. Если используются другие стандарты, например. полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиметилметакрилат, полиакриловая кислота, необходимо указать причину.

1.4. Принцип метода испытаний

Как молекулярно-массовое распределение образца, так и средние молекулярные массы (Mn, Mw) можно определить с помощью ГПХ. ГПХ – это особый вид жидкостной хроматографии, при котором образец разделяется по гидродинамическим объемам отдельных компонентов (2).

Разделение происходит при прохождении образца через колонку, заполненную пористым материалом, обычно органическим гелем. Маленькие молекулы могут проникать в поры, тогда как крупные молекулы исключаются. Таким образом, путь больших молекул короче, и они элюируются первыми. Молекулы среднего размера проникают в некоторые поры и позже элюируются. Мельчайшие молекулы со средним гидродинамическим радиусом меньшим, чем поры геля, могут проникать во все поры. Они элюируются последними.

В идеальной ситуации разделение полностью определяется размером молекулярных частиц, но на практике трудно избежать хотя бы некоторых мешающих эффектов поглощения. Неравномерная упаковка колонки и мертвые объемы могут ухудшить ситуацию (2).

Обнаружение осуществляется, например, показатель преломления или поглощение УФ-излучения и дает простую кривую распределения. Однако, чтобы приписать кривой фактические значения молекулярной массы, необходимо откалибровать колонку, пропуская полимеры с известной молекулярной массой и, в идеале, с очень похожей структурой, например различные стандарты полистирола. Обычно получается кривая Гаусса, иногда искаженная небольшим хвостом в сторону низкой молекулярной массы, вертикальная ось указывает количество по массе элюируемых веществ с различной молекулярной массой, а горизонтальная ось - логарифм молекулярной массы.

Содержание низкой молекулярной массы получено из этой кривой. Расчет может быть точным только в том случае, если низкомолекулярные соединения одинаково реагируют в пересчете на массу на полимер в целом.

1,5. Критерии качества

Повторяемость (относительное стандартное отклонение: RSD) объема элюирования должна быть лучше 0,3%. Требуемая повторяемость анализа должна быть обеспечена корректировкой по внутреннему стандарту, если хроматограмма оценивается в зависимости от времени и не соответствует вышеупомянутому критерию (1). Полидисперсность зависит от молекулярной массы стандартов. Для стандартов полистирола типичными значениями являются:

>ТАБЛИЦА>

1.6. Описание метода испытаний

1.6.1. Приготовление стандартных растворов полистирола

Стандарты полистирола растворяются путем тщательного перемешивания в выбранном элюенте. При приготовлении растворов необходимо учитывать рекомендации производителя.

Концентрации выбранных стандартов зависят от различных факторов, например: объем впрыска, вязкость раствора и чувствительность аналитического детектора. Максимальный объем впрыска должен быть адаптирован к длине колонки, чтобы избежать перегрузки. Типичные объемы ввода для аналитического разделения с использованием ГПХ с колонкой 30 см × 7,8 мм обычно составляют от 40 до 100 мкл. Возможны и большие объемы, но они не должны превышать 250 л. Оптимальное соотношение между объемом ввода и концентрацией должно быть определено до фактической калибровки колонки.

1.6.2. Приготовление раствора образца

В принципе, те же требования применяются и к приготовлению растворов проб. Образец растворяют в подходящем растворителе, например тетрагидрофуран (ТГФ), осторожно встряхивая. Ни при каких обстоятельствах его нельзя растворять с помощью ультразвуковой ванны. При необходимости раствор пробы очищается через мембранный фильтр с размером пор от 0,2 до 2 мкм.

Присутствие нерастворенных частиц должно быть зафиксировано в окончательном отчете, поскольку они могут быть связаны с частицами с высокой молекулярной массой. Для определения массового процента нерастворенных частиц следует использовать соответствующий метод. Растворы следует использовать в течение 24 часов.

1.6.3. Поправка на содержание примесей и добавок

Коррекция содержания видов M NUM>Ve

>THE>W½

)2 или N = 16 (

>ЧИСЛО>И

>НЕТ>Ой

)2

где

N - количество теоретических тарелок

Ve — объем элюирования при максимуме пика.

W — ширина пика базовой линии

W½ — ширина пика на половине высоты.

1.6.8. Эффективность разделения

Помимо числа теоретических тарелок, которое является величиной, определяющей ширину полосы, определенную роль играет также эффективность разделения, определяемая крутизной калибровочной кривой. Эффективность разделения колонны получается из следующего соотношения:

>NUM>Ve,M - Ve,(10M

>DEN>площадь поперечного сечения колонны

&ге; 6,0 [

>ЧИСЛО>см3

>DEN>см2

]

где

Ve,M – объем элюирования полистирола с молекулярной массой Mx

Ve,(10 M — объем элюирования полистирола с молекулярной массой в 10 раз большей.

Разрешение системы обычно определяется следующим образом:

R1,2 = 2 × >ЧИСЛО>Ve1 - Ve2

>ДЕН>W1 + W2

× >ЧИСЛО>1

<Дебет>log10 (мА/м1)

где

Ve1, Ve2 — объемы элюирования двух полистирольных стандартов при максимуме пика.

W1, W2 — ширина пика на базовой линии.

M1, M2 — молекулярные массы в максимуме пика (должны отличаться в 10 раз).

Значение R для колонной системы должно быть больше 1,7 (4).

1.6.9. Растворители

Все растворители должны быть высокой чистоты (для ТГФ используется чистота 99,5%). Резервуар с растворителем (при необходимости в атмосфере инертного газа) должен быть достаточно большим для калибровки колонки и нескольких анализов проб. Растворитель необходимо дегазировать перед его подачей в колонку насосом.

1.6.10. Контроль температуры

Температура важнейших внутренних компонентов (петли ввода, колонок, детектора и трубок) должна быть постоянной и соответствовать выбору растворителя.

1.6.11. Детектор

Назначение детектора – количественная регистрация концентрации пробы, элюированной из колонки. Чтобы избежать ненужного уширения пиков, объем кюветы детекторной ячейки должен быть как можно меньшим. Его объем не должен превышать 10 мкл, за исключением детекторов светорассеяния и вязкости. Для обнаружения обычно используется дифференциальная рефрактометрия. Однако, если этого требуют особые свойства образца или элюирующего растворителя, можно использовать другие типы детекторов, например УФ/ВИД, ИК, детекторы вязкости и т. д.

2. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

2.1. Данные

Стандарт DIN (1) следует использовать для получения подробных критериев оценки, а также требований, касающихся сбора и обработки данных.

Для каждого образца необходимо провести два независимых эксперимента. Их необходимо анализировать индивидуально. Во всех случаях важно также определить данные по бланкам, обработанным в тех же условиях, что и образец.

Необходимо явно указать, что измеренные значения являются относительными значениями, эквивалентными молекулярным массам используемого стандарта.

После определения объемов удерживания или времени удерживания (возможно, скорректированного с использованием внутреннего стандарта) значения log Mp (Mp — это максимумы пика калибровочного стандарта) наносятся на график в зависимости от одной из этих величин. Для каждой декады молекулярной массы необходимы как минимум две точки калибровки, а для общей кривой, которая должна охватывать расчетную молекулярную массу образца, требуется не менее пяти точек измерения. Конечная точка низкомолекулярной калибровочной кривой определяется н-гексилбензолом или другим подходящим неполярным растворенным веществом. Часть кривой, соответствующая молекулярной массе ниже 1000, определяют и при необходимости корректируют с учетом примесей и добавок. Кривые элюирования обычно оценивают посредством электронной обработки данных. В случае использования ручной оцифровки можно обратиться к ASTM D 3536-91 (3).

Если какой-либо нерастворимый полимер остается на колонке, его молекулярная масса, вероятно, будет выше, чем у растворимой фракции, и, если не учитывать это, это приведет к завышенной оценке содержания низкомолекулярной фракции. Руководство по корректировке низкомолекулярного содержания нерастворимого полимера представлено в Приложении.

Кривая распределения должна быть представлена ​​в виде таблицы или в виде рисунка (дифференциальная частота или сумма процентов по отношению к log M). В графическом представлении одна декада молекулярной массы обычно должна составлять около 4 см в ширину, а максимум пика должен составлять около 8 см в высоту. В случае интегральных кривых распределения разница по ординате между 0 и 100 % должна составлять около 10 см.

2.2. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

2.2.1. Тестируемое вещество

- доступная информация об испытуемом веществе (идентичность, добавки, примеси),

- описание обработки образца, наблюдений, проблем.

2.2.2. Инструментарий

- резервуар элюента, инертный газ, дегазация элюента, состав элюента, примеси,

- насос, демпфер импульсов, система впрыска,

- разделительные колонки (производитель, вся информация о характеристиках колонок, таких как размер пор, вид разделяющего материала и т.д., количество, длина и порядок используемых колонок),

- количество теоретических тарелок колонны (или их комбинации), эффективность разделения (разрешающая способность системы),

- информация о симметрии вершин,

- температура колонки, вид контроля температуры,

- детектор (принцип измерения, тип, объем кюветы),

- расходомер, если он используется (производитель, принцип измерения),

- система записи и обработки данных (аппаратная и программная).

2.2.3. Калибровка системы

- подробное описание метода построения калибровочной кривой,

- информация о критериях качества данного метода (например, коэффициент корреляции, сумма квадратов ошибок и т. д.),

- информацию обо всех экстраполяциях, предположениях и аппроксимациях, сделанных в ходе экспериментальной процедуры, а также оценки и обработки данных,

- все измерения, используемые для построения калибровочной кривой, должны быть задокументированы в таблице, которая включает следующую информацию для каждой калибровочной точки:

- название образца,

- производитель образца,

- характеристические значения стандартов Mp, Mn, Mw, Mw/Mn, предоставленные изготовителем или полученные в результате последующих измерений, вместе с подробностями о методе определения,

- объем инъекции и концентрация инъекции,

- Значение Mp, используемое для калибровки,

- объем элюата или скорректированное время удерживания, измеренное в максимумах пиков,

- Мп рассчитано на пиковом максимуме,

- процентная погрешность рассчитанного Мп и калибровочного значения.

2.2.4. Информация о содержании низкомолекулярного полимера

- описание методов, использованных при анализе, и способа проведения экспериментов,

- информацию о процентном содержании низкомолекулярных частиц (мас./мас.) по отношению к общему количеству пробы,

- сведения о примесях, добавках и других неполимерных частицах в массовых процентах по отношению к общей массе пробы.

2.2.5. Оценка

- оценка по времени: все методы, обеспечивающие требуемую воспроизводимость (метод коррекции, внутренний стандарт и т. д.),

- информацию о том, проводилась ли оценка на основе объема элюата или времени удерживания,

- информация о пределах оценки, если пик не проанализирован полностью,

- описание методов сглаживания, если они используются,

- процедуры подготовки и предварительной обработки пробы,

- наличие нерастворенных частиц, если таковые имеются,

- объем инъекции (мл) и концентрация инъекции (мг/мл),

- наблюдения, указывающие на эффекты, которые приводят к отклонениям от идеального профиля ГПХ,

- подробное описание всех изменений в процедурах тестирования,

- подробные сведения о диапазонах ошибок,

- любая другая информация и наблюдения, имеющие значение для интерпретации результатов.

3. ССЫЛКИ

(1) DIN 55672 (1995). Гель-проникающая хроматография (ГПХ) с тетрагидрофураном (ТГФ) в качестве элюента, часть 1.

(2) Яу, В.В., Киркланд, Дж.Дж., и Блай, Д.Д., ред. (1979). Современная эксклюзионная жидкостная хроматография, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Стандартный метод определения средних молекулярных масс и молекулярно-массового распределения с помощью жидкостной эксклюзионной хроматографии (гель-проникающая хроматография-ГПХ). Американское общество испытаний и материалов, Филадельфия, Пенсильвания.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Стандартный метод определения средних молекулярных масс и молекулярно-массового распределения полистирола с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Американское общество испытаний и материалов, Филадельфия, Пенсильвания.

Приложение

Руководство по корректировке низкомолекулярного содержания на наличие нерастворимого полимера

Если в образце присутствует нерастворимый полимер, это приводит к потере массы во время анализа ГПХ. Нерастворимый полимер необратимо удерживается на колонке или фильтре пробы, в то время как растворимая часть пробы проходит через колонку. В случае, когда можно оценить или измерить приращение показателя преломления (dn/dc) полимера, можно оценить потерю массы образца на колонке. В этом случае необходимо внести поправку, используя внешнюю калибровку стандартными материалами известной концентрации и dn/dc, чтобы откалибровать отклик рефрактометра. В приведенном ниже примере используется стандарт поли(метилметакрилата) (пММА).

При внешней калибровке для анализа акриловых полимеров стандарт рММА известной концентрации в тетрагидрофуране анализируется методом ГПХ и полученные данные используются для нахождения константы рефрактометра по уравнению:

К = >ЧИСЛО>Р/

>THEN>(C × V × >NUM>dn/

>THE>DC

)

где

K — константа рефрактометра (в микровольтсекундах/мл).

R — отклик стандарта pMMA (в микровольтсекундах).

C — концентрация стандарта пММА (в мг/мл).

V – объем инъекции (в мл) и

dn/dc – приращение показателя преломления пММА в тетрагидрофуране (мл/мг).

Следующие данные типичны для стандарта пММА:

Р = 2 937 891

С = 1,07 мг/мл

В = 0,1 мл

дн/дк = 9 × 10-5 мл/мг.

Полученное значение K, 3,05 × 1011, затем используется для расчета теоретического отклика детектора, если 100 % введенного полимера элюируется через детектор.

ПРИЛОЖЕНИЕ III С

А.20. ПОВЕДЕНИЕ РАСТВОРЕНИЯ/ЭКСТРАКЦИИ ПОЛИМЕРОВ В ВОДЕ

1. МЕТОД

Описанный метод является копией пересмотренной версии OECD TG 120 (1997). Дополнительная техническая информация приведена в ссылке (1).

1.1. Введение

Для некоторых полимеров, таких как эмульсионные полимеры, может потребоваться первоначальная подготовительная работа, прежде чем можно будет использовать метод, изложенный ниже. Метод неприменим к жидким полимерам и полимерам, реагирующим с водой в условиях испытания.

Когда метод непрактичен или невозможен, поведение раствора/экстракции можно исследовать с помощью других методов. В таких случаях необходимо предоставить полную информацию и обоснование используемого метода.

1.2. Эталонные вещества

Никто.

1.3. Принцип метода испытаний

Поведение полимеров при растворении/экстракции в водной среде определяют с использованием метода в колбе (см. А.6 «Растворимость в воде, метод в колбе») с модификациями, описанными ниже.

1.4. Критерии качества

Никто.

1,5. Описание метода испытаний

1.5.1. Оборудование

Для метода необходимо следующее оборудование:

- дробильное устройство, напр. измельчитель для производства частиц известного размера,

- аппарат для встряхивания с возможностью регулирования температуры,

- мембранная фильтрационная система,

- соответствующее аналитическое оборудование,

- стандартизированные сита.

1.5.2. Базовые приготовления

Репрезентативную пробу сначала необходимо измельчить до размера частиц от 0,125 до 0,25 мм с использованием соответствующих сит. Охлаждение может потребоваться для стабильности образца или для процесса измельчения. Материалы эластичной природы можно измельчать при температуре жидкого азота (1).

Если требуемая фракция размера частиц недостижима, следует принять меры по максимальному уменьшению размера частиц и сообщить о результате. В протоколе необходимо указать способ хранения измельченной пробы до проведения испытаний.

1.5.3. Процедура

В каждый из трех сосудов, снабженных стеклянными пробками, взвешивают три образца по 10 г испытуемого вещества и в каждый сосуд добавляют по 1000 мл воды. Если обработка количества полимера в 10 г оказывается невозможным, следует использовать следующее по величине количество, которое можно использовать, и соответствующим образом отрегулировать объем воды.

Сосуды плотно закупоривают и затем встряхивают при 20°С. Следует использовать устройство для встряхивания или перемешивания, способное работать при постоянной температуре. По истечении 24 часов содержимое каждого сосуда центрифугируют или фильтруют и концентрацию полимера в прозрачной водной фазе определяют подходящим аналитическим методом. Если подходящие аналитические методы для водной фазы недоступны, общую растворимость/экстрагируемость можно оценить по сухому весу остатка на фильтре или центрифугированного осадка.

Обычно необходимо количественно различать примеси и добавки, с одной стороны, и низкомолекулярные соединения, с другой стороны. В случае гравиметрического определения также важно выполнить холостой анализ без использования тестируемого вещества, чтобы учесть остатки, возникающие в результате экспериментальной процедуры.

Поведение растворения/экстракции полимеров в воде при 37°С при рН 2 и рН 9 можно определить таким же способом, как описано для проведения эксперимента при 20°С. Значения pH могут быть достигнуты путем добавления либо подходящих буферов, либо соответствующих кислот или оснований, таких как соляная кислота, уксусная кислота, гидроксид натрия или калия аналитической степени чистоты или NH3.

В зависимости от используемого метода анализа следует провести один или два теста. Когда доступны достаточно специфические методы для прямого анализа водной фазы полимерного компонента, одного теста, как описано выше, должно быть достаточно. Однако, когда такие методы недоступны и определение поведения полимера при растворении/экстракции ограничивается непрямым анализом путем определения только общего содержания органического углерода (ТОС) в водном экстракте, следует провести дополнительное испытание. Это дополнительное испытание также следует провести в трех экземплярах, используя образцы полимера в 10 раз меньшего размера и такое же количество воды, как и в первом испытании.

1.5.4. Анализ

1.5.4.1. Тест проводился с одним размером выборки

Могут быть доступны методы прямого анализа полимерных компонентов в водной фазе. В качестве альтернативы можно также рассмотреть непрямой анализ растворенных/экстрагированных полимерных компонентов путем определения общего содержания растворимых частей и внесения поправок на неспецифичные для полимера компоненты.

Анализ водной фазы на общее количество полимерных частиц возможен:

либо достаточно чувствительным методом, например

- TOC с использованием персульфатного или дихроматного расщепления с получением CO2 с последующей оценкой с помощью ИК или химического анализа,

- атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС) или ее эмиссионный эквивалент с индуктивно-связанной плазмой (ИСП) для кремний- или металлосодержащих полимеров,

- УФ-поглощение или спектрофлуориметрия арильных полимеров,

- LC-MS для образцов с низкой молекулярной массой,

или путем вакуумного выпаривания досуха водного экстракта и спектроскопического (ИК, УФ и т.д.) или ААС/ИСП анализа остатка.

Если анализ водной фазы как таковой невозможен, водный экстракт следует экстрагировать несмешивающимся с водой органическим растворителем, например хлорированный углеводород. Затем растворитель выпаривают и остаток анализируют, как указано выше, на содержание заявленного полимера. Любые компоненты в этом остатке, которые идентифицированы как примеси или добавки, должны быть вычтены с целью определения степени растворения/экстракции самого полимера.

Когда присутствуют относительно большие количества таких материалов, может оказаться необходимым подвергнуть остаток, например, анализу ВЭЖХ или ГХ, чтобы отличить примеси от присутствующих мономеров и производных от мономеров, чтобы можно было определить истинное содержание последних. определенный.

В некоторых случаях может оказаться достаточным простое выпаривание органического растворителя досуха и взвешивание сухого остатка.

1.5.4.2. Тест проводился с выборками двух разных размеров.

Все водные экстракты анализируются на ТОС.

Гравиметрическое определение проводят на нерастворенной/неэкстрагированной части пробы. Если после центрифугирования или фильтрации содержимого каждого сосуда остатки полимера остаются прикрепленными к стенке сосуда, сосуд следует промывать фильтратом до тех пор, пока сосуд не очистится от всех видимых остатков. После этого фильтрат снова центрифугируют или фильтруют. Остатки, оставшиеся на фильтре или в центрифужной пробирке, сушат при 40°С в вакууме и взвешивают. Сушку продолжают до достижения постоянного веса.

2. ДАННЫЕ

2.1. Тест проводился с одним размером выборки

Отдельные результаты для каждой из трех колб и средние значения должны быть указаны и выражены в единицах массы на объем раствора (обычно мг/л) или массы на массу образца полимера (обычно мг/г). Кроме того, следует также указать потерю веса образца (рассчитываемую как вес растворенного вещества, разделенный на вес исходного образца). Следует рассчитать относительные стандартные отклонения (RSD). Отдельные цифры следует приводить для всего вещества (полимер + необходимые добавки и т. д.) и только для полимера (т. е. после вычета вклада таких добавок).

2.2. Тест проводился с выборками двух разных размеров.

Отдельные значения TOC водных экстрактов двух трехкратных экспериментов и среднее значение для каждого эксперимента должны быть выражены в единицах массы на объем раствора (обычно мгС/л), а также в единицах массы на массу раствора. исходный образец (обычно мгС/г).

Если нет разницы между результатами при высоком и низком соотношениях образец/вода, это может указывать на то, что все экстрагируемые компоненты действительно были экстрагированы. В таком случае прямой анализ обычно не требуется.

Должны быть указаны отдельные массы остатков, выраженные в процентах от первоначальной массы образцов. Средние значения следует рассчитывать для каждого эксперимента. Разница между 100 и найденными процентами представляет собой процентное содержание растворимого и экстрагируемого материала в исходном образце.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

3.1.1. Тестируемое вещество

- доступная информация об испытуемом веществе (наименование, добавки, примеси, содержание низкомолекулярных частиц).

3.1.2. Условия эксперимента

- описание использованных методик и условий эксперимента,

- описание методов анализа и обнаружения.

3.1.3. Полученные результаты

- результаты растворимости/экстрактивности в мг/л; индивидуальные и средние значения для тестов экстракции в различных растворах с разбивкой по содержанию полимеров и примесей, добавок и т. д.,

- результаты растворимости/экстрагируемости в мг/г полимера,

- Значения TOC водных экстрактов, масса растворенного вещества и рассчитанные проценты, если они измерены,

- pH каждого образца,

- информация о пустых значениях,

- при необходимости ссылки на химическую нестабильность испытуемого вещества как в процессе тестирования, так и в ходе аналитического процесса,

- вся информация, важная для интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

(1) DIN 53733 (1976) Измельчение пластмассовых изделий в целях испытаний.

ПРИЛОЖЕНИЕ III D

C.13 БИОКОНЦЕНТРАЦИЯ: ПРОХОДНОЙ ТЕСТ С РЫБАМИ

1. МЕТОД

Этот метод биоконцентрации является копией OECD TG 305 (1996).

1.1. Введение

Этот метод описывает процедуру характеристики потенциала биоконцентрации веществ в рыбе в проточных условиях. Хотя проточные режимы испытаний являются более предпочтительными, полустатические режимы допустимы при условии, что критерии достоверности удовлетворяются.

Метод дает достаточную информацию для проведения испытания, в то же время предоставляя достаточную свободу для адаптации плана эксперимента к условиям конкретной лаборатории и к изменяющимся характеристикам тестируемых веществ. Его наиболее эффективно применять к стабильным органическим химическим веществам со значениями log Pow от 1,5 до 6,0 (1), но все же можно применять и к суперлипофильным веществам (имеющим log Pow > 6,0). Предварительная оценка коэффициента биоконцентрации (BCF), иногда обозначаемая как KB, для таких суперлипофильных веществ, предположительно, будет выше, чем значение стационарного коэффициента биоконцентрации (BCFSS), которое, как ожидается, будет получено в результате лабораторных экспериментов. Предварительные оценки коэффициента биоконцентрации органических химикатов со значениями log Pow примерно до 9,0 можно получить с помощью уравнения Бинтейна и др. (2). Параметры, которые характеризуют потенциал биоконцентрации, включают константу скорости поглощения (k1), константу скорости очищения (k2) и BCFSS.

Радиомеченные тестовые вещества могут облегчить анализ проб воды и рыбы и могут использоваться для определения необходимости идентификации и количественного определения разлагающихся веществ. Если измеряется общее количество радиоактивных остатков (например, путем сгорания или растворения тканей), КБК рассчитывается на основе исходного соединения, любых оставшихся метаболитов, а также ассимилированного углерода. Таким образом, КБК, рассчитанный на основе общего количества радиоактивных остатков, не может быть напрямую сопоставим с КБК, полученным путем специфического химического анализа только исходного соединения.

В исследованиях с радиоактивной меткой можно использовать процедуры очистки для определения КБК на основе исходного соединения, а основные метаболиты можно охарактеризовать, если это будет сочтено необходимым. Также возможно совместить исследование метаболизма рыб с исследованием биоконцентрации путем анализа и идентификации остатков в тканях.

1.2. Определения и единицы измерения

Биоконцентрация/биоаккумуляция представляет собой увеличение концентрации испытуемого вещества в организме или на нем (определенных его тканях) по сравнению с концентрацией испытуемого вещества в окружающей среде.

Коэффициент биоконцентрации (BCF или KB) в любой момент фазы поглощения этого теста накопления представляет собой концентрацию тестируемого вещества в/на рыбе или определенных ее тканях (Cf как мкг/г (ppm)), деленную на концентрацию химическое вещество в окружающей среде (Cw в мкг/мл (ppm)).

Фактор стационарной биоконцентрации (BCFSS или KB) существенно не меняется в течение длительного периода времени, при этом концентрация испытуемого вещества в окружающей среде в течение этого периода времени остается постоянной.

Плато или устойчивое состояние достигается на графике зависимости тестируемого вещества в рыбе (Cf) от времени, когда кривая становится параллельной оси времени и три последовательных анализа Cf, выполненных на образцах, взятых с интервалом не менее двух дней, находятся в пределах ± 20 % друг от друга, и между тремя периодами выборки нет существенных различий. При анализе объединенных проб требуется как минимум четыре последовательных анализа. Для тестируемых веществ, которые усваиваются медленно, более подходящими интервалами были бы семь дней.

Коэффициенты биоконцентрации, рассчитанные непосредственно из кинетических констант скорости (k1/k2), называются коэффициентом кинетической концентрации BCFk.

Коэффициент распределения октанол-вода (Pow) представляет собой отношение растворимости химического вещества в н-октаноле и воде в равновесном состоянии (метод А.8), также выражаемый как Kow. Логарифм Pow используется как показатель способности химического вещества к биоконцентрации водными организмами.

Фаза воздействия или поглощения – это время, в течение которого рыба подвергается воздействию тестируемого химического вещества.

Константа скорости поглощения (k1) представляет собой числовое значение, определяющее скорость увеличения концентрации тестируемого вещества в/на подопытной рыбе (или в определенных ее тканях), когда рыба подвергается воздействию этого химического вещества (k1 выражается в день-1). .

Фаза после воздействия или очистки (потери) — это время после перевода исследуемой рыбы из среды, содержащей тестируемое вещество, в среду, не содержащую этого вещества, в течение которой происходит очистка (или чистая потеря) вещества из исследуют подопытную рыбу (или определенную ее ткань).

Константа скорости очищения (потери) (k2) представляет собой числовое значение, определяющее скорость снижения концентрации тестируемого вещества в тестируемой рыбе (или определенных ее тканях) после перевода тестируемой рыбы из среды, содержащей тестируемое вещество. на среду, не содержащую этого вещества (k2 выражается в день-1).

1.3. Принцип метода испытаний

Тест состоит из двух фаз: фазы воздействия (поглощения) и фазы после воздействия (очистки). На этапе поглощения отдельные группы рыб одного вида подвергаются воздействию не менее двух концентраций тестируемого вещества. Затем их переносят в среду, не содержащую тестируемого вещества, для фазы очистки. Фаза очистки всегда необходима, за исключением случаев, когда поглощение вещества во время фазы поглощения было незначительным (например, КБК меньше 10). Концентрацию тестируемого вещества в/на рыбе (или в определенной ее ткани) отслеживают на обеих фазах теста. В дополнение к двум тестируемым концентрациям контрольная группа рыб содержится в идентичных условиях, за исключением отсутствия тестируемого вещества, чтобы связать возможные побочные эффекты, наблюдаемые в тесте на биоконцентрацию, с соответствующей контрольной группой и получить фоновые концентрации тестируемого вещества. .

Фаза поглощения длится 28 дней, если не будет продемонстрировано, что равновесие было достигнуто ранее. Прогноз продолжительности фазы поглощения и времени достижения устойчивого состояния можно сделать на основе уравнения, приведенного в Приложении 3. Затем период очищения начинается путем помещения рыбы в ту же среду, но без тестируемого вещества, в другой чистый сосуд. Там, где это возможно, коэффициент биоконцентрации предпочтительно рассчитывают как соотношение (BCFSS) концентрации рыбы (Cf) и в воде (Cw) в кажущемся установившемся состоянии, так и как кинетический коэффициент биоконцентрации (BCFk) как отношение скорости константы поглощения (k1) и очистки (k2) в предположении кинетики первого порядка. Если кинетика первого порядка явно не соблюдается, следует использовать более сложные модели (Приложение 5).

Если устойчивое состояние не достигается в течение 28 дней, фазу приема следует продлить до достижения устойчивого состояния или до 60 дней, в зависимости от того, что наступит раньше; затем начинается фаза очистки.

Константа скорости поглощения, константа скорости очищения (потери) (или константы, если используются более сложные модели), коэффициент биоконцентрации и, где возможно, доверительные пределы каждого из этих параметров рассчитываются на основе модели, которая лучше всего описывает измеренные значения. концентрации тестируемого вещества в рыбе и воде.

КБК выражается как функция общего сырого веса рыбы. Однако для специальных целей могут использоваться определенные ткани или органы (например, мышцы, печень), если рыба достаточно крупная или рыба может быть разделена на съедобную (филе) и несъедобную (внутренности) фракции. Поскольку для многих органических веществ существует четкая связь между потенциалом биоконцентрации и липофильностью, существует также соответствующая связь между содержанием липидов в подопытной рыбе и наблюдаемой биоконцентрацией таких веществ. Таким образом, чтобы уменьшить этот источник изменчивости результатов испытаний для веществ с высокой липофильностью (т.е. с log Pow > 3), биоконцентрацию следует выражать по отношению к содержанию липидов в дополнение к массе всего тела.

Содержание липидов следует определять на том же биологическом материале, который используется для определения концентрации испытуемого вещества, если это возможно.

1.4. Информация об испытуемом веществе

Перед проведением теста на биоконцентрацию необходимо знать следующую информацию об испытуемом веществе:

(а) растворимость в воде;

(b) коэффициент распределения октанол-вода Pow (обозначенный также как Kow, определенный методом ВЭЖХ в А.8);

(в) гидролиз;

(d) фототрансформация в воде, определенная при солнечном или искусственном солнечном облучении и в условиях облучения теста на биоконцентрацию (3);

(e) поверхностное натяжение (т.е. для веществ, для которых невозможно определить log Pow);

(f) давление пара;

(g) высокая биоразлагаемость (где применимо).

Другая необходимая информация — это токсичность для видов рыб, которые будут использоваться в тесте, предпочтительно асимптотическая LC50 (т. е. не зависящая от времени). Должен быть доступен соответствующий аналитический метод с известной точностью, прецизионностью и чувствительностью для количественного определения испытуемого вещества в тестируемых растворах и биологическом материале, а также подробные сведения о подготовке и хранении проб. Также должен быть известен аналитический предел обнаружения тестируемого вещества как в воде, так и в тканях рыбы. При использовании тестируемого вещества, меченного 14С, необходимо знать процент радиоактивности, связанной с примесями.

1,5. Валидность теста

Для того чтобы тест был действительным, должны соблюдаться следующие условия:

- изменение температуры составляет менее ± 2 °C,

- концентрация растворенного кислорода не опускается ниже 60 % насыщения,

- концентрация испытуемого вещества в камерах поддерживается в пределах ± 20 % от среднего значения измеренных значений во время фазы поглощения,

- смертность или другие побочные эффекты/заболевания как у контрольной, так и у обработанной рыбы составляют менее 10 % в конце испытания; если испытание продлевается на несколько недель или месяцев, гибель или другие неблагоприятные последствия в обеих партиях рыб должны составлять менее 5 % в месяц и не превышать 30 % в целом.

1.6. Эталонные соединения

Использование эталонных соединений с известным потенциалом биоконцентрации было бы полезно при проверке экспериментальной процедуры, когда это необходимо. Однако конкретные вещества пока не могут быть рекомендованы.

1.7 Описание метода испытаний

1.7.1. Аппарат

Следует проявлять осторожность, чтобы избежать использования для всех частей оборудования материалов, которые могут растворяться, сорбироваться или выщелачиваться и оказывать неблагоприятное воздействие на рыбу. Могут использоваться стандартные прямоугольные или цилиндрические резервуары, изготовленные из химически инертного материала и подходящей вместимости в соответствии с нормой загрузки. Использование мягких пластиковых трубок следует свести к минимуму. Предпочтительно использовать трубки из тефлона (R), нержавеющей стали и/или стекла. Опыт показал, что для веществ с высокими коэффициентами поглощения, таких как синтетические пиретроиды, может потребоваться силанизированное стекло. В таких ситуациях оборудование придется выбросить после использования.

1.7.2. Вода

В тесте обычно используется природная вода, которую следует получать из незагрязненного источника однородного качества. Вода для разбавления должна быть такого качества, чтобы обеспечить выживание выбранных видов рыб в течение периодов акклиматизации и испытаний без проявления каких-либо аномальных внешнего вида или поведения. В идеале должно быть продемонстрировано, что тестируемые виды могут выживать, расти и размножаться в разбавленной воде (например, в лабораторных культурах или при тестировании на токсичность в течение жизненного цикла). Вода должна характеризоваться как минимум уровнем pH, жесткостью, общим содержанием твердых веществ, общим содержанием органического углерода и, предпочтительно, также аммонием, нитритом и щелочностью, а для морских видов - соленостью. Параметры, важные для оптимального благополучия рыб, полностью известны, но в Приложении 1 приведены рекомендуемые максимальные концентрации ряда параметров для пресной и морской испытательной воды.

Вода должна быть постоянного качества в течение всего периода испытания. Значение pH должно находиться в диапазоне от 6,0 до 8,5, но во время данного испытания оно должно находиться в диапазоне ± 0,5 единиц pH. Чтобы гарантировать, что вода для разбавления не окажет чрезмерного влияния на результат теста (например, за счет комплексообразования испытуемого вещества) или отрицательно повлияет на продуктивность рыбного поголовья, следует периодически отбирать пробы для анализа. Определение тяжелых металлов (например, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основных анионов и катионов (например, Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), пестицидов (например, общего фосфорорганического и общего хлорорганического пестицидов), общего количества органический углерод и взвешенные твердые вещества следует вносить, например, каждые три месяца, если известно, что вода для разбавления имеет относительно постоянное качество. Если было доказано, что качество воды остается постоянным в течение как минимум одного года, определения можно проводить реже и увеличивать интервалы (например, каждые шесть месяцев).

Содержание природных частиц, а также общее количество органического углерода (ТОС) в воде для разбавления должно быть как можно более низким, чтобы избежать абсорбции испытуемого вещества органическими веществами, что может снизить его биодоступность (4). Максимально допустимое значение составляет 5 мг/л для твердых частиц (сухое вещество, не прошедшее фильтр 0,45 мкм) и 2 мг/л для общего органического углерода (см. Приложение 1). При необходимости воду перед употреблением следует профильтровать. Вклад в содержание органического углерода в воде от подопытных рыб (экскременты) и остатков пищи должен быть как можно более низким. На протяжении всего испытания концентрация органического углерода в испытательном сосуде не должна превышать концентрацию органического углерода, происходящего из испытуемого вещества и, если он используется, солюбилизирующего агента более чем на 10 мг/л (± 20 %).

1.7.3. Тестовые решения

Готовят исходный раствор испытуемого вещества в подходящей концентрации. Маточный раствор предпочтительно готовить путем простого смешивания или перемешивания испытуемого вещества в воде для разбавления. Использование растворителей или диспергаторов (солюбилизирующих агентов) не рекомендуется; однако в некоторых случаях это может произойти для получения исходного раствора подходящей концентрации. Растворителями, которые могут быть использованы, являются этанол, метанол, монометиловый эфир этиленгликоля, диметиловый эфир этиленгликоля, диметилформамид и триэтиленгликоль. Можно использовать диспергаторы Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% метилцеллюлозы и HCO-40. Следует соблюдать осторожность при использовании легко биоразлагаемых агентов, поскольку они могут вызвать проблемы с ростом бактерий в проточных тестах. Испытуемое вещество может быть мечено радиоактивным изотопом и должно иметь наивысшую чистоту (например, предпочтительно > 98 %).

Для проточных испытаний необходима система, которая непрерывно дозирует и разбавляет исходный раствор испытуемого вещества (например, насос-дозатор, пропорциональный разбавитель, система сатуратора) для подачи тестовых концентраций в испытательные камеры. Предпочтительно допускается не менее пяти замен объема через каждую испытательную камеру в день. Предпочтителен проточный режим, но там, где это невозможно (например, при неблагоприятном воздействии на тест-организмы), можно использовать полустатический метод при условии, что критерии достоверности удовлетворены. Скорость потока исходных растворов и воды для разбавления следует проверять как за 48 часов до исследования, так и затем, по крайней мере, ежедневно во время исследования. В эту проверку включено определение расхода через каждую испытательную камеру и гарантируется, что он не различается более чем на 20 % ни внутри, ни между камерами.

1.7.4. Выбор вида

Важными критериями при выборе видов являются их легкодоступность, возможность получения удобных размеров и возможность удовлетворительного содержания в лаборатории. Другие критерии выбора видов рыб включают рекреационную, коммерческую, экологическую значимость, а также сопоставимую чувствительность, успешное использование в прошлом и т. д.

Рекомендуемые виды для испытаний приведены в Приложении 2. Могут использоваться и другие виды, но процедуру испытаний, возможно, придется адаптировать для обеспечения подходящих условий испытаний. В этом случае следует указать обоснование выбора вида и метода эксперимента.

1.7.5. Удержание рыбы

Акклиматизируйте популяцию рыбы в течение как минимум двух недель в воде при температуре испытания и кормите ее достаточным количеством корма того же типа, который будет использоваться во время испытания.

После 48-часового периода адаптации регистрируются случаи смертности и применяются следующие критерии:

- смертность более 10 % населения за семь дней: отбраковать всю партию,

- смертность от 5 до 10 % населения за семь дней: акклиматизация в течение семи дополнительных дней,

- смертность менее 5 % населения в течение семи дней: принять партию; - если смертность более 5 % в течение вторых семи дней отклонить всю партию.

Убедитесь, что рыба, используемая в испытаниях, не имеет видимых заболеваний и отклонений. Выбросьте всю больную рыбу. Рыбы не должны получать лечение от болезней в течение двух недель, предшествующих тесту, или во время теста.

1.8. Производительность теста

1.8.1. Предварительный тест

Может быть полезно провести предварительный эксперимент, чтобы оптимизировать условия окончательного испытания, например. выбор концентрации(й) тестируемого вещества, продолжительности фаз поглощения и очистки.

1.8.2. Условия воздействия

1.8.2.1. Продолжительность фазы освоения

Прогноз продолжительности фазы поглощения можно получить на основе практического опыта (например, на основе предыдущего исследования или химического вещества, связанного с накоплением) или на основе определенных эмпирических соотношений, использующих знание либо растворимости в воде, либо коэффициента распределения октанол/вода испытуемого вещества. (см. Приложение 3).

Фазу поглощения следует продолжать в течение 28 дней, если не будет продемонстрировано, что равновесие было достигнуто раньше. Если устойчивое состояние не было достигнуто в течение 28 дней, фазу поглощения следует продлить, проводя дальнейшие измерения, до достижения устойчивого состояния или до 60 дней, в зависимости от того, что короче.

1.8.2.2. Продолжительность фазы очищения

Периода, составляющего половину продолжительности фазы поглощения, обычно достаточно для соответствующего (например, 95 %) снижения нагрузки на организм вещества (пояснение оценки см. в Приложении 3). Если время, необходимое для достижения потери 95 %, непрактично велико и превышает, например, в два раза нормальную продолжительность фазы поглощения (т. е. более 56 дней), можно использовать более короткий период (т. е. до тех пор, пока концентрация испытуемого вещества не станет менее 10 %). стационарной концентрации). Однако для веществ, имеющих более сложные закономерности поглощения и очистки, чем представлены в однокамерной модели рыбы, дающей кинетику первого порядка, допускайте более длинные фазы очистки для определения констант скорости потерь. Однако этот период может определяться периодом, в течение которого концентрация тестируемого вещества в рыбе остается выше аналитического предела обнаружения.

1.8.2.3. Количество тестовых рыб

Выбирайте количество рыб на одну тестовую концентрацию таким образом, чтобы в каждой пробе было минимум четыре рыбы на пробу. Если требуется большая статистическая мощность, потребуется больше рыб на выборку.

Если используются взрослые рыбы, укажите, используются ли в эксперименте самцы или самки, или оба. Если используются оба пола, различия в содержании липидов между полами должны быть документально подтверждены как незначительные до начала воздействия; может потребоваться объединение всех самцов и всех самок рыб.

В любом испытании отбирают рыбу одинакового веса, причем наименьшая весит не менее двух третей массы наибольшей. Все они должны быть одного класса и происходить из одного источника. Поскольку вес и возраст рыбы иногда оказывают существенное влияние на значения КБК (1), эти детали регистрируются точно. Перед испытанием рекомендуется взвесить часть выборки рыбного запаса, чтобы оценить средний вес.

1.8.2.4. Загрузка

Высокие соотношения воды и рыбы используются для того, чтобы свести к минимуму снижение Cw, вызванное добавлением рыбы в начале теста, а также во избежание снижения концентрации растворенного кислорода. Важно, чтобы скорость загрузки соответствовала используемому тестируемому виду. В любом случае обычно рекомендуется норма загрузки от 0,1 до 1,0 г рыбы (влажный вес) на литр воды в день. Высокие скорости загрузки можно использовать, если показано, что требуемая концентрация испытуемого вещества может поддерживаться в пределах ± 20 % и что концентрация растворенного кислорода не падает ниже 60 % насыщения.

При выборе соответствующих режимов загрузки учитываются условия нормальной среды обитания видов рыб. Например, донным рыбам может потребоваться большая площадь дна аквариума при том же объеме воды, чем пелагическим видам рыб.

1.8.2.5. Кормление

В периоды акклиматизации и испытаний рыб кормят соответствующим рационом с известным содержанием липидов и общего белка в количестве, достаточном для поддержания их здорового состояния и массы тела. Рыб кормят ежедневно в течение периода акклиматизации и испытаний в количестве примерно от 1 до 2% от массы тела в день; это поддерживает концентрацию липидов у большинства видов рыб на относительно постоянном уровне во время теста. Количество корма следует пересчитывать, например, один раз в неделю, чтобы поддерживать постоянную массу тела и содержание липидов. Для этого расчета вес рыбы в каждой испытательной камере можно оценить по весу рыбы, отобранной последней в этой камере. Не взвешивайте рыбу, оставшуюся в камере.

Несъеденная пища и фекалии ежедневно откачиваются из испытательных камер вскоре после кормления (от 30 минут до одного часа). На протяжении всего испытания камеры поддерживаются как можно более чистыми, чтобы концентрация органических веществ поддерживалась как можно ниже, поскольку присутствие органического углерода может ограничить биодоступность испытуемого вещества (1).

Поскольку многие корма производятся из рыбной муки, корм следует анализировать на наличие тестируемого вещества. Также желательно провести анализ корма на пестициды и тяжелые металлы.

1.8.2.6. Свет и температура

Световой период обычно составляет 12–16 часов, а температура (± 2 °C) должна соответствовать исследуемому виду (см. Приложение 2). Необходимо знать тип и характеристики освещения. Следует соблюдать осторожность в отношении возможной фототрансформации испытуемого вещества в условиях облучения исследования. Следует использовать соответствующее освещение, избегая воздействия на рыбу неестественных фотопродуктов. В некоторых случаях может оказаться целесообразным использовать фильтр для защиты от УФ-излучения с длиной волны ниже 290 нм.

1.8.2.7. Тестовые концентрации

Рыбу подвергают в проточных условиях воздействию по меньшей мере двух концентраций испытуемого вещества в воде. Обычно выбирается более высокая (или самая высокая) концентрация испытуемого вещества, составляющая около 1 % от его острой асимптотической LC50 и по меньшей мере в десять раз превышающая его предел обнаружения в воде с помощью используемого аналитического метода.

Наивысшую тестируемую концентрацию можно также определить путем деления LC50 за 96 часов на соответствующее соотношение острой/хронической реакции (подходящие соотношения для некоторых химических веществ могут составлять от трех до 100). Если возможно, выберите другую концентрацию(и) так, чтобы она отличалась от указанной выше в 10 раз. Если это невозможно из-за критерия 1 % от ЛК50 и аналитического предела, можно использовать коэффициент ниже 10. или следует рассмотреть возможность использования тестируемого вещества, меченного 14 C. Никакая используемая концентрация не должна превышать растворимость испытуемого вещества.

Если используется солюбилизирующий агент, его концентрация не должна превышать 0,1 мл/л и быть одинаковой во всех испытательных сосудах. Должен быть известен его вклад вместе с испытуемым веществом в общее содержание органического углерода в испытуемой воде. Однако следует приложить все усилия, чтобы избежать использования таких материалов.

1.8.2.8. Элементы управления

В дополнение к серии испытаний следует провести один контрольный раствор воды для разбавления или, если необходимо, один контрольный образец, содержащий солюбилизирующий агент, при условии, что установлено, что агент не оказывает воздействия на рыбу. В противном случае необходимо настроить оба элемента управления.

1.8.3. Частота измерений качества воды

Во время теста во всех сосудах следует измерять растворенный кислород, TOC, pH и температуру. Общую жесткость и соленость, если это необходимо, следует измерять в контрольных образцах и одном сосуде при более высокой (или самой высокой) концентрации. Как минимум, растворенный кислород и соленость, если это необходимо, следует измерять три раза – в начале, примерно в середине и в конце периода поглощения – и один раз в неделю в период очищения. TOC следует измерять в начале теста (за 24 часа и 48 часов до начала теста, фазы поглощения) перед добавлением рыбы и не реже одного раза в неделю, как во время фазы поглощения, так и на стадии очищения. Температуру следует измерять ежедневно, pH – в начале и конце каждого периода, а твердость – один раз в каждом испытании. Желательно, чтобы температура постоянно контролировалась хотя бы в одном сосуде.

1.8.4. Отбор проб и анализ рыбы и воды

1.8.4.1. График отбора проб рыбы и воды

Пробы воды из испытательных камер для определения концентрации тестируемого вещества отбираются перед добавлением рыбы, а также во время фаз поглощения и очистки. Как минимум, пробы воды отбираются одновременно с рыбой и перед кормлением. На этапе потребления определяются концентрации тестируемого вещества, чтобы проверить соответствие критериям достоверности.

Пробы рыбы отбираются не менее пяти раз на этапе потребления и не менее четырех раз на этапе очистки. Поскольку в некоторых случаях будет сложно вычислить достаточно точную оценку значения BCF на основе этого количества проб, особенно когда указана другая кинетика очистки, кроме простой кинетики очистки первого порядка, может быть целесообразно отбирать пробы с более высокой частотой в оба периода (см. Приложение 4). Дополнительные образцы сохраняются и анализируются только в том случае, если результаты первого раунда анализов оказываются недостаточными для расчета КБК с желаемой точностью.

Пример приемлемого графика отбора проб приведен в Приложении 4. Другие графики можно легко рассчитать, используя другие предполагаемые значения Pow для расчета времени воздействия при поглощении 95 %.

Отбор проб продолжают во время фазы поглощения до установления устойчивого состояния или в течение 28 дней, в зависимости от того, что короче. Если устойчивое состояние не было достигнуто в течение 28 дней, отбор проб продолжается до достижения устойчивого состояния или в течение 60 дней, в зависимости от того, что короче. Перед началом этапа очистки рыбу перемещают в чистые резервуары.

1.8.4.2. Отбор проб и подготовка проб

Пробы воды для анализа получают, например, путем перекачивания через инертную трубку из центральной точки испытательной камеры. Поскольку ни фильтрация, ни центрифугирование не всегда позволяют отделить небиодоступную фракцию испытуемого вещества от биодоступной (особенно для суперлипофильных химических веществ, т.е. тех химических веществ, у которых log Pow > 5) (1) (5), образцы могут не подвергаться такому лечению.

Вместо этого следует принять меры для поддержания чистоты резервуаров, а также контролировать содержание общего органического углерода как на этапе поглощения, так и на этапе очистки.

Соответствующее количество рыб (обычно не менее четырех) удаляется из испытательных камер при каждом отборе проб. Отобранную рыбу быстро промывают водой, промокают досуха, мгновенно убивают наиболее подходящим и гуманным методом, а затем взвешивают.

Предпочтительно анализировать рыбу и воду сразу после отбора проб, чтобы предотвратить разложение или другие потери и рассчитать приблизительные скорости поглощения и очистки по ходу исследования. Немедленный анализ также позволяет избежать задержки в определении момента достижения плато.

При невозможности немедленного анализа образцы сохраняются соответствующим методом. Перед началом исследования получают информацию о правильном методе хранения конкретного тестируемого вещества - например, глубокая заморозка, выдержка при температуре 4 °С, продолжительность хранения, экстракция и т. д.

1.8.4.3. Качество аналитического метода

Поскольку вся процедура в основном определяется точностью, прецизионностью и чувствительностью аналитического метода, используемого для испытуемого вещества, экспериментально проверьте, что прецизионность и воспроизводимость химического анализа, а также извлечение испытуемого вещества как из воды, так и из рыбы, соответствуют требованиям. удовлетворительно для конкретного метода. Также убедитесь, что тестируемое вещество не обнаруживается в используемой воде для разбавления.

При необходимости значения Cw и Cf, полученные в результате теста, корректируются с учетом значений восстановления и фоновых значений контролей. С пробами рыбы и воды обращаются таким образом, чтобы свести к минимуму загрязнение и потери (например, в результате адсорбции устройством для отбора проб).

1.8.4.4. Анализ пробы рыбы

Если в тесте используются радиоактивно меченные материалы, можно проанализировать общее количество радиоактивных меток (т. е. исходное вещество и метаболиты) или образцы можно очистить, чтобы можно было проанализировать исходное соединение отдельно. Кроме того, основные метаболиты могут быть охарактеризованы в равновесном состоянии или в конце фазы поглощения, в зависимости от того, что наступит раньше. Если КБК в пересчете на общее количество радиоактивно меченных остатков составляет ≥ 1 000 %, может оказаться целесообразным, а для некоторых категорий химикатов, таких как пестициды, настоятельно рекомендуется идентифицировать и количественно оценить продукты разложения, представляющие ≥ 10 % от общего количества остатков в тканях рыбы в устойчивом состоянии. Если ухудшается представление ≥ Выявляют и количественно определяют 10 % всех радиоактивно меченных остатков в тканях рыбы, затем рекомендуется также идентифицировать и количественно определять продукты разложения в исследуемой воде.

Концентрацию тестируемого вещества обычно следует определять для каждой взвешенной отдельной рыбы. Если это невозможно, можно выполнить объединение выборок при каждом отборе проб, но объединение ограничивает статистические процедуры, которые можно применять к данным. Если важны конкретная статистическая процедура и мощность, то в тест (6) (7) должно быть включено достаточное количество рыб, соответствующее желаемой процедуре объединения и мощности.

КБК следует выражать как функцию общей сырой массы, а для веществ с высоким содержанием липофилов – как функцию содержания липидов. Содержание липидов в рыбе по возможности определяют при каждом отборе проб. Для определения содержания липидов следует использовать подходящие методы (ссылки 8 и 2 Приложения 3). В качестве стандартного метода можно рекомендовать экстракцию хлороформом/метанолом (9). Различные методы не дают одинаковых значений (10), поэтому важно подробно описать используемый метод. Когда это возможно, анализ на липиды следует проводить на том же экстракте, который был получен для анализа тестируемого вещества, поскольку липиды часто приходится удалять из экстракта, прежде чем его можно будет проанализировать хроматографически. Содержание липидов в рыбе (в мг/кг сырой массы) в конце эксперимента не должно отличаться от такового в начале более чем на ± 25 %. Также необходимо указать процентное содержание твердых веществ в тканях, чтобы можно было перевести концентрацию липидов из влажного состояния в сухое.

2. ДАННЫЕ

2.1. Обработка результатов

Кривую поглощения тестируемого вещества получают путем построения графика его концентрации в/в рыбе (или определенных тканях) в фазе поглощения в зависимости от времени на арифметических шкалах. Если кривая достигла плато, то есть становится приблизительно асимптотической относительно оси времени, установившийся BCFSS рассчитывается по формуле:

>NUM>Cf как установившееся состояние (среднее)

>DEN>Cw как установившееся состояние (среднее)

Когда устойчивое состояние не достигается, возможно рассчитать BCFSS с достаточной точностью для оценки опасности из «стационарного состояния» при 80 % (1,6/k2) или 95 % (3,0/k2) от равновесие.

Также определяется коэффициент концентрации (BCFk) как отношение k1/k2, двух кинетических констант первого порядка. Константу скорости очистки (k2) обычно определяют по кривой очистки (т.е. графику снижения концентрации тестируемого вещества в рыбе с течением времени). Константа скорости поглощения (k1) затем рассчитывается с учетом k2 и значения Cf, полученного из кривой поглощения (см. также Приложение 5). Предпочтительным методом получения BCFk и констант скорости k1 и k2 является использование методов нелинейной оценки параметров на компьютере (11). В противном случае для расчета k1 и k2 можно использовать графические методы. Если кривая очистки явно не первого порядка, то следует использовать более сложные модели (см. ссылки в Приложении 3) и обратиться за советом к специалисту по биостатистике.

2.2. Интерпретация результатов

Результаты следует интерпретировать с осторожностью, если измеренные концентрации тест-растворов находятся на уровнях, близких к пределу обнаружения аналитического метода.

Четко определенные кривые поглощения и потерь являются показателем хорошего качества данных о биоконцентрации. Разница в константах поглощения/очистки между двумя исследуемыми концентрациями должна составлять менее 20 %. Наблюдаемые значительные различия в скорости поглощения/очистки между двумя применяемыми тестируемыми концентрациями должны быть зарегистрированы и даны возможные объяснения. Обычно доверительный предел КБК, полученный в хорошо спланированных исследованиях, приближается к ± 20 %.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

3.1. Тестируемое вещество

- физическая природа и, при необходимости, физико-химические свойства,

- данные химической идентификации (включая содержание органического углерода, если необходимо),

- если радиоактивно помечено, точное положение меченого атома(ов) и процент радиоактивности, связанной с примесями.

3.2. Тестовые виды

- научное название, штамм, источник, предварительная обработка, акклиматизация, возраст, размерный ряд и т. д.

3.3. Условия испытаний

- используемая процедура испытания (например, проточная или полустатическая),

- тип и характеристики используемого освещения и фотопериод(ы),

- план испытаний (например, количество и размер испытательных камер, скорость замещения объема воды, количество повторов, количество рыб на повтор, количество тестовых концентраций, продолжительность фаз поглощения и очищения, частота отбора проб рыбы и воды),

- метод приготовления исходных растворов и частота обновления (при использовании необходимо указать растворяющий агент, его концентрацию и его вклад в содержание органического углерода в испытательной воде),

- номинальные тестовые концентрации, средние значения измеренных значений и их стандартные отклонения в испытательных сосудах, а также метод, с помощью которого они были достигнуты,

- источник воды для разбавления, описание предварительной обработки, результаты любой демонстрации способности подопытных рыб жить в воде, а также характеристики воды: pH, жесткость, температура, концентрация растворенного кислорода, уровни остаточного хлора (если измерены). ), общий органический углерод, взвешенные вещества, соленость испытательной среды (если применимо) и любые другие проведенные измерения,

- качество воды в испытательных сосудах, pH, жесткость, TOC, температура и концентрация растворенного кислорода,

- подробная информация о кормлении (например, тип пищи, источник, состав - по крайней мере, содержание липидов и белков, если возможно, количество и частота приема),

- информацию об обработке проб рыбы и воды, включая подробности подготовки, хранения, экстракции и аналитических процедур (и точности) испытуемого вещества и содержания липидов (если они измерены).

3.4. Полученные результаты

- результаты любого проведенного предварительного исследования,

- смертность контрольной рыбы и рыбы в каждой камере воздействия и любое наблюдаемое аномальное поведение,

- содержание липидов в рыбе (если определение проводится во время тестирования),

- кривые (включая все измеренные данные), показывающие поглощение и выведение испытуемого химического вещества рыбой, время достижения устойчивого состояния,

- Cf и Cw (со стандартным отклонением и диапазоном, если применимо) для всех периодов отбора проб (Cf выражается в мкг/г сырой массы (ppm) всего тела или определенных его тканей, например липидов, и Cw в мкг/мл (ppm) Значения Cw для контрольной серии (также следует указать фон),

- коэффициент стационарной биоконцентрации (BCFSS) и/или коэффициент кинетической концентрации (BCFk) и, если применимо, 95% доверительные пределы для констант скорости поглощения и выведения (потери) (все выражены по отношению ко всему организму и общему количеству липидов). содержание животного или определенных его тканей, если оно измерено), доверительные пределы и стандартное отклонение (при наличии), а также методы расчета/анализа данных для каждой концентрации используемого тестируемого вещества,

- при использовании радиоактивно меченных веществ и при необходимости может наблюдаться накопление любых обнаруженных метаболитов,

- все необычное в тесте, любые отклонения от этих процедур и любую другую соответствующую информацию.

Сведите к минимуму результаты как «не обнаруженные на пределе обнаружения» путем разработки метода предварительного тестирования и планирования эксперимента, поскольку такие результаты не могут быть использованы для расчета констант скорости.

4. ССЫЛКИ

(1) Коннелл Д.В. (1988). Поведение биоаккумуляции стойких химических веществ в водных организмах. Преподобный Окружающий. Контам. Токсикол. 102, стр. 117-156.

(2) Бинтейн С., Девиллерс Дж. и Керхер В. (1993). Нелинейная зависимость биоконцентрации рыбы от коэффициента распределения н-октанол/вода. SAR и QSAR в исследованиях окружающей среды, 1, стр. 29–390.

(3) ОЭСР, Париж (1996 г.). Прямая фототрансформация химических веществ в воде. Серия руководящих документов по охране окружающей среды и безопасности по испытаниям и оценке химических веществ. № 3.

(4) Кристенсен П. (1991). Биоконцентрация в рыбе: сравнение коэффициентов биоконцентрации, полученных с помощью методов тестирования ОЭСР и ASTM; влияние твердых частиц органического вещества на биодоступность химических веществ. Институт качества воды, Дания.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Инициатива по качеству воды Великого озера. Документ технической поддержки процедуры определения факторов биоаккумуляции. Июль 1994 года.

(6) Редакция FDA США (Управление по контролю за продуктами и лекарствами). Руководство по анализу пестицидов, 1, 5600 Fisher's Lane, Роквилл, Мэриленд, 20852, июль 1975 г.

(7) Агентство по охране окружающей среды США (1974 г.). Раздел 5, А(1). Анализ жировой ткани человека или животного, «Анализ остатков пестицидов в образцах человека и окружающей среды», Томпсон Дж. Ф. (редактор), Research Triangle Park, NC 27711.

(8) Компаан Х. (1980) в «Определении возможного воздействия химикатов и отходов на водную среду: деградация, токсичность, биоаккумуляция», гл. 2.3, часть II. Государственное издательство, Гаага, Нидерланды.

(9) Гарднер и др. (1995). Лимн. и океаногр. 30, с. 1099-1

(10) Рэндалл Р.К., Ли Х., Озретич Р.Дж., Лейк Дж.Л. и Пруэлл Р.Дж. (1991). Оценка избранных липидных методов нормализации биоаккумуляции загрязняющих веществ. Окружающая среда. Токсикол. хим. 10, стр. 1431–1436.

(11) CEC, Биоконцентрация химических веществ в рыбе: проточный метод – Программа кольцевых испытаний, 1984–1985 гг. Итоговый отчет, март 1987 г. Авторы: П. Кристенсен и Н. Нихолм.

(12) ASTM E-1022-84 (повторно утвержден в 1988 г.). Стандартная практика проведения тестов на биоконцентрацию рыб и морских двустворчатых моллюсков.

Приложение 1

>ТАБЛИЦА>

Приложение 2

>ТАБЛИЦА>

В разных странах использовались различные устьевые и морские виды, например:

>ТАБЛИЦА>

Коллекция

Перечисленные в таблице пресноводные рыбы легко выращиваются и/или широко доступны в течение всего года, тогда как наличие морских и эстуарных видов частично ограничено соответствующими странами. Их можно разводить и выращивать либо на рыбных фермах, либо в лаборатории в условиях контроля над болезнями и паразитами, так что подопытное животное будет здоровым и известного происхождения. Эти рыбы доступны во многих частях мира.

Приложение 3

Прогнозирование продолжительности фаз поглощения и очищения.

1. Прогнозирование продолжительности фазы поглощения

Перед проведением испытания оценку k2 и, следовательно, некоторый процент времени, необходимого для достижения устойчивого состояния, можно получить из эмпирических соотношений между k2 и коэффициентом распределения н-октанол/вода (Pow) или k2 и растворимостью в воде (s ).

Оценку k2 (день-1) можно получить, например, из следующего эмпирического соотношения (1):

log10k2 = -0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95)

(уравнение 1)

Другие отношения см. в ссылке 2.

Если коэффициент распределения (Pow) неизвестен, оценку можно сделать (3) на основе знания растворимости(ов) вещества в воде, используя:

log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994)

(уравнение 2)

где s = растворимость (моль/л): (n = 36).

Эти соотношения применимы только к химическим веществам со значениями log Pow от 2 до 6,5 (4).

Время достижения некоторого процента установившегося состояния можно получить, применив оценку k2, из общего кинетического уравнения, описывающего поглощение и очистку (кинетика первого порядка):

>NUM>dCf

>ДЕН>дт

= k1.Cw - k2.Cf

или если Cw постоянно:

Ср = >ЧИСЛО>k1

>ДЕН>k2

. Cw (1 - e-k) (уравнение 3)

При приближении к установившемуся состоянию (t . ∞) уравнение 3 можно свести (5) (6) к:

Ср = >ЧИСЛО>k1

>ДЕН>k2

. Cw или Cf/Cw = k1/k2 = BCF

Тогда k1/k2 .Cw представляет собой приближение к концентрации в рыбе в «стационарном состоянии» (Cf,s).

Уравнение 3 можно записать так:

Cf = Cf,s (1 - e-k) или >NUM>Cf

>DEN>Cfs

= 1 - e-k (уравнение 4)

Применяя уравнение 4, можно спрогнозировать время достижения некоторого процента установившегося состояния, если k2 предварительно оценивается с использованием уравнения 1 или 2.

В качестве ориентира статистически оптимальная продолжительность фазы поглощения для получения статистически приемлемых данных (BCFk) представляет собой тот период, который необходим для того, чтобы кривая логарифма концентрации тестируемого вещества в рыбе, построенная в зависимости от линейного времени, достигла своего значения. средняя точка, или 1,6/к2, или 80 % установившегося, но не более 3,0/к2 или 95 % установившегося (7).

Время достижения 80 % установившегося состояния равно (уравнение 4):

0,80 = 1 - e-k или t80 = >ЧИСЛО>1,6

>ДЕН>k2

(уравнение 5)

Аналогично, 95 % установившегося состояния это:

t95 = >ЧИСЛО>3,0

>ДЕН>k2

(уравнение 6)

Например, продолжительность фазы поглощения (up) для тестируемого вещества с log Pow = 4 будет (с использованием уравнений 1, 5 и 6):

log10k2 = -0,414 . (4) + 1,47

k2 = 0,652 сут-1

вверх (80 %) = 1,6/0,652, т.е. 2,45 дня (59 часов)

orup (95 %) = 3,0/0,652, т.е. 4,60 суток (110 часов)

Аналогично, для испытуемого вещества с s = 10-5 моль/л (log(s) = 5,0) продолжительность подъема будет (с использованием уравнений 1, 2, 5 и 6):

log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02

log10k2 = -0,414 (5,02) + 1,47

k2 = 0,246 дней-1

вверх (80 %) = 1,6/0,246, т.е. 6,5 суток (156 часов)

orup (95 %) = 3,0/0,246, т.е. 12,2 дня (293 часа)

Альтернативно выражение:

teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55,31 (часы)

может использоваться для расчета времени достижения эффективного установившегося состояния (4).

2. Прогноз продолжительности фазы очищения.

Прогноз времени, необходимого для снижения нагрузки на организм до некоторого процента от начальной концентрации, также можно получить из общего уравнения, описывающего поглощение и выведение (кинетика первого порядка) (1) (8).

Для фазы очистки Cw предполагается равным нулю. Уравнение можно свести к:

>NUM>dCf

>ДЕН>дт

= -k2Cf или Cf = Cf,o .e-k, где Cf,o — концентрация в начале периода очистки. Тогда в момент времени (t50) будет достигнута очистка 50 %:

>ЧИСЛО> См.

>НЕТ>Миссис

= >ЧИСЛО>1

>ТО>2

= e-k или t50 = >ЧИСЛО>0,693

>ДЕН>k2

Аналогично очистка 95 % будет достигнута при:

t95 = >ЧИСЛО>3,0

>ДЕН>k2

Если поглощение 80 % используется в течение первого периода (1,6/к2) и потеря 95 % в фазе очищения (3,0/к2), то фаза очищения примерно в два раза превышает продолжительность фазы поглощения.

Однако важно отметить, что оценки основаны на предположении, что закономерности поглощения и очищения будут следовать кинетике первого порядка. Если кинетика первого порядка явно не соблюдается, следует использовать более сложные модели (например, ссылка (1)).

Литература (приложения 3)

(1) Спейси А. и Хэмелинк Дж. Л. (1982). Альтернативные модели описания биоконцентрации органики в рыбах. Окружающая среда. Токсикол. и хим. 1, стр. 309-320.

(2) Кристенсен П. (1991). Биоконцентрация в рыбе: сравнение КБК, полученных с помощью методов тестирования ОЭСР и ASTM; Влияние твердых частиц на биодоступность химических веществ. Датский институт качества воды.

(3) Чиу К.Т. и Шмеддинг Д.В. (1982). Распределение органических соединений в системах октанол-вода. Окружающая среда. наук. Технол. 16 (1), стр. 4-10.

(4) Хоукер Д.В. и Коннелл Д.В. (1988). Влияние коэффициента распределения липофильных соединений на кинетику биоконцентрации в рыбе. Wat. Рез. 22 (6), стр. 701-707.

(5) Брэнсон Д.Р., Блау Г.Э., Александр Х.К. и Нили В.Б. (1975). Труды Американского общества рыболовства, 104 (4), стр. 785–792.

(6) Эрнст В. (1985). Накопление в водных организмах. В: Оценка тестов по прогнозированию поведения химических веществ в окружающей среде. Эд. Шиман П., Корте Ф., Кляйн В. и Бурдо П.Х. Часть 4.4, стр. 243–255. ОБЪЕМ, 1985, John Wiley & Sons Ltd, Нью-Йорк.

(7) Рейли П.М., Байрамович Р., Блау Г.Е., Брэнсон Д.Р. и Зауэрхофф М.В. (1977). Рекомендации по оптимальному планированию экспериментов по оценке параметров кинетических моделей первого порядка, Can. Дж. Хим. англ. 55, стр. 614-622.

(8) Кенеманн Х. и Ван Леувен К. (1980). Токсикокинетика рыб: накопление и выведение шести хлорбензолов гуппи. Хемосфера, 9, стр. 3-19.

Приложение 4

>ТАБЛИЦА>

Приложение 5

Модель дискриминации

Предполагалось, что большинство данных о биоконцентрации «достаточно» хорошо описываются простой двухкамерной/двухпараметрической моделью, о чем свидетельствует прямолинейная кривая, которая приближается к точкам для концентраций в рыбе во время фазы очищения, когда они наносятся на график. на полубревенчатой ​​бумаге. (Там, где эти точки не могут быть описаны прямолинейной кривой, следует использовать более сложные модели, см., например, Спейси и Хэмлинк, ссылка 1 в Приложении 3).

Графический метод определения константы скорости очистки (потерь) k2

Нанесите на полулогарифмическую бумагу график зависимости концентрации тестируемого вещества, обнаруженного в каждой пробе рыбы, от времени отбора проб. Наклон этой линии равен k2.

k2 = >ЧИСЛО>ln (Cf1 / Cf2)

>THE>t2 - t1

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Обратите внимание, что отклонения от прямой линии могут указывать на более сложную картину очистки, чем кинетика первого порядка. Графический метод может быть применен для определения типов очистки, отклоняющихся от кинетики первого порядка.

Графический метод определения константы скорости поглощения k1

Учитывая k2, вычислите k1 следующим образом:

k1 = >ЧИСЛО>Cfk2

>ТОгда>Cw x(1-e-k)

(уравнение 1)

Значение Cf считывается из средней точки плавной кривой поглощения, полученной на основе данных, когда логарифм концентрации отображается в зависимости от времени (в арифметической шкале).

Компьютерный метод расчета констант скорости поглощения и очистки (потери)

Предпочтительным способом получения коэффициента биоконцентрации и констант скорости k1 и k2 является использование методов нелинейной оценки параметров на компьютере. Эти программы находят значения для k1 и k2, учитывая набор последовательных данных о концентрации во времени и модель:

Сф = Св.

>NUM>k1

>ДЕН>k2

x (1 - e-k) 0 NUM>k1

>ДЕН>k2

х (е-к - е-к) т