Шестая Директива Комиссии 95/32/EC от 7 июля 1995 г., касающаяся методов анализа, необходимых для проверки состава косметических продуктов.

ДИРЕКТИВА ШЕСТОЙ КОМИССИИ 95/32/EC

от 7 июля 1995 г.

относящиеся к методам анализа, необходимым для проверки состава косметической продукции

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 76/768/EEC от 27 июля 1976 г. о сближении законов государств-членов, касающихся косметической продукции (1), с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 94/32/EC (2), и, в частности, Статья 8 (1) этого закона,

Принимая во внимание, что Директива 76/768/EEC предусматривает официальное тестирование косметической продукции с целью обеспечения соблюдения условий, установленных положениями Комиссии относительно состава косметической продукции;

Принимая во внимание, что все необходимые методы анализа должны быть разработаны как можно быстрее; тогда как определенные методы уже приняты в Директивах Комиссии 80/1335/EEC (3) с поправками, внесенными Директивой 87/143/EEC (4), 82/434/EEC (5) с поправками, внесенными Директивой 90/207/EEC (6), 83/514/ЕЕС (7), 85/490/ЕЕС (8) и 93/73/ЕЕС (9);

Принимая во внимание, что идентификация и определение бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, сорбиновой кислоты, салициловой кислоты и пропионовой кислоты в косметических продуктах, а также идентификация и определение гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, моноэтилового эфира гидрохинона и монобензилового эфира гидрохинона в косметических продуктах составляют шестой этап;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Комитета по адаптации Директивы 76/768/ЕЕС к техническому прогрессу,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны принять все необходимые меры для обеспечения того, чтобы во время официального тестирования косметической продукции:

- идентификация и определение бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, сорбиновой кислоты, салициловой кислоты и пропионовой кислоты,

- идентификация и определение гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, моноэтилового эфира гидрохинона и монобензилового эфира гидрохинона,

проводится в соответствии с методами, описанными в Приложении.

Статья 2

1. Государства-члены должны ввести в силу законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 30 сентября 1996 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки должен быть принят государствами-членами.

2. Государства-члены ЕС должны сообщить Комиссии положения национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 7 июля 1995 года.

Для Комиссии

Эмма БОНИНО

Член Комиссии

(1) ОЖ № L 262, 27.9.1976, с. 169.

(2) ОЖ № L 181, 15.7.1994, с. 31.

(3) ОЖ № L 383, 31.12.1980, с. 27.

(4) ОЖ № L 57, 27.2.1987, с. 56.

(5) ОЖ № L 185, 30.6.1982, с. 1.

(6) ОЖ № L 108, 28.4.1990, с. 92.

(7) ОЖ № L 291, 24.10.1983, с. 9.

(8) ОЖ № L 295, 7.11.1985, с. 30.

(9) ОЖ № L 231, 14.9.1993, с. 3. 4.

ПРИЛОЖЕНИЕ

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ, 4-ГИДРОКСИБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ, СОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ, САЛИЦИЛОВОЙ И ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ В КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

1. Область применения и применение.

Метод применим для идентификации и определения бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, сорбиновой кислоты, салициловой кислоты и пропионовой кислоты в косметических продуктах. Отдельные процедуры описывают идентификацию этих консервантов; определение пропионовой кислоты; и определение 4-гидроксибензойной кислоты, салициловой кислоты, сорбиновой кислоты и бензойной кислоты.

2. Определение

Количества бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, салициловой кислоты, сорбиновой кислоты и пропионовой кислоты, определенные этим методом, выражают в процентах по массе свободных кислот.

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Принцип

После кислотно-основной экстракции консервантов экстракт анализируют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием актуальной дериватизации. В зависимости от результатов идентификация подтверждается высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или, в случае пропионовой кислоты, газовой хроматографией (ГХ).

2. Реагенты

2.1. Общий

Все реагенты должны быть аналитической чистоты. Используемая вода должна быть дистиллированной водой или водой, по крайней мере, эквивалентной чистоты.

2.2. Ацетон

2.3. Диэтиловый эфир

2.4. Ацетонитрил

2.5. Толуол

2.6. н-гексан

2.7. Парафин жидкий

2.8. Соляная кислота, 4 М

2.9. Гидроксид калия, водный, 4 М

2.10. Хлорид кальция, CaCl2.2H2O

2.11. Карбонат лития, Li2CO3

2.12. 2-Бром-2-ацетонафтон

2.13. 4-гидроксибензойная кислота

2.14. Салициловая кислота

2.15. Бензойная кислота

2.16. Сорбиновая кислота

2.17. Пропионовая кислота

2.18. Эталонные решения

Приготовьте 0,1% (масс./об.) растворы (100 мг/100 мл) каждого из пяти консервантов (2,13–2,17) в диэтиловом эфире.

2.19. Реагент для дериватизации

0,5% (масс./об.) раствор 2-бром-2&-ацетонафтона (2.12) в ацетонитриле (2.4) (50 мг/10 мл). Этот раствор следует готовить еженедельно и хранить в холодильнике.

2.20. Каталитический раствор

0,3% (масс./об.) раствор карбоната лития (2.11) в воде (300 мг/100 мл). Этот раствор должен быть свежеприготовленным.

2.21. Проявочный растворитель

Толуол (2,5)/Ацетон (2,2) (20:0,5, по объему)

2.22. Жидкий парафин (2,7)/н-гексан (2,6) (1:2, по объему)

3. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование

3.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60 °C.

3.2. Развивающийся танк

3.3. Источник ультрафиолетового света, 254 и 366 нм

3.4. Пластинки тонкослойные, Кизельгель 60, без индикатора флуоресценции, 20×20 см, толщина слоя 0,25 мм с зоной концентрирования 2,5×20 см (Merck 11845 или эквивалент)

3.5. Микрошприц, 10 мкл

3.6. Микрошприц, 25 мкл

3.7. Духовка, способная поддерживать температуру до 105 °C.

3.8. Стеклянные пробирки объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой.

3.9. Фильтровальная бумага диаметром 90 мм, Schleicher & Schull, Weissband No 5892, или эквивалент.

3.10. Универсальная индикаторная бумага pH, pH 1–11.

3.11. Стеклянные флаконы для проб объемом 5 мл

3.12. Вращающийся пленочный испаритель (Rotavapor или аналогичный)

3.13. Горячая тарелка

4. Процедура

4.1. Базовые приготовления

Взвешивают примерно 1 г образца в стеклянную пробирку вместимостью 50 мл с завинчивающейся крышкой (3.8). Добавьте четыре капли соляной кислоты 4 М (2,8) и 40 мл ацетона (2,2). Для сильноосновных продуктов, таких как туалетное мыло, следует добавить 20 капель 4 М соляной кислоты (2,8). С помощью индикаторной бумаги (3.10) проверьте, что pH равен примерно двум. Закройте пробирку и энергично встряхивайте в течение одной минуты.

Если необходимо облегчить экстракцию консервантов в фазу ацетона, осторожно нагрейте смесь примерно до 60 °C, чтобы расплавить жидкую фазу.

Охладите раствор до комнатной температуры и профильтруйте через фильтровальную бумагу (3.9) в коническую колбу.

20 мл фильтрата переносят в коническую колбу вместимостью 200 мл, добавляют 20 мл воды и перемешивают. Доведите pH смеси примерно до 10 с помощью 4 М гидроксида калия (2,9), используя индикаторную бумагу (3.10) для измерения pH.

Добавьте 1 г хлорида кальция (2.10) и энергично встряхните. Фильтруют через фильтровальную бумагу (3.9) в делительную воронку емкостью 250 мл, содержащую 75 мл диэтилового эфира (2.3), и энергично встряхивают в течение одной минуты. Дать отделиться и слить водный слой в коническую колбу емкостью 250 мл. Удалите слой эфира. С помощью индикаторной бумаги (3.10) доводят pH водного раствора примерно до двух с помощью 4 М соляной кислоты (2,8). Добавляют 10 мл диэтилового эфира (2.3), закрывают колбу пробкой и энергично встряхивают в течение одной минуты. позволяют отделить и перенести эфирный слой во вращающийся пленочный испаритель (3.12). Отбросьте водный слой.

Эфирный слой упаривают почти досуха и остаток растворяют в 1 мл диэтилового эфира (2.3). Перенесите раствор в пробирку для пробы (3.11).

4.2. Тонкослойная хроматография

На каждый из эталонов и образцы, подлежащие хроматографии, наносят примерно 3 мкл раствора карбоната лития (2.20) и с помощью шприца (3.5) на равных расстояниях от линии старта в зоне концентрирования пластинки для ТСХ (3.4) и высушивают в поток холодного воздуха.

Перенесите пластинку ТСХ на горячую плитку (3.13), нагретую до 40 °С, чтобы пятна были как можно меньшими. С помощью микрошприца (3.5) наносят по 10 мкл каждого из эталонных растворов (2.18) и раствора образца (4.1) к линии старта планшета, точно в те места, где был нанесен раствор карбоната лития.

Наконец, нанесите примерно 15 мкл реагента для дериватизации (2.19) (раствор 2-бром-2-ацетонафтона), снова точно на те места, где были нанесены растворы сравнения/образца и раствор карбоната лития.

Нагревайте пластинку для ТСХ в печи (3.7) при температуре 80°С в течение 45 минут. После охлаждения проявите пластинку в резервуаре (3.2), находящемся в равновесии в течение 15 минут (без использования фильтровальной бумаги), используя растворитель для проявки 2.21 (толуол/ацетон), пока фронт растворителя не достигнет расстояния 15 см. (это может занять около 80 минут).

Пластинку просушивают в потоке холодного воздуха и рассматривают полученные пятна в УФ-свете (3.3). Для усиления флуоресценции слабых пятен пластинку ТСХ можно окунуть в жидкий парафин/н-гексан (2.22).

5. Идентификация

Рассчитайте Rf для каждого пятна.

Сравните Rf и поведение под воздействием УФ-излучения, полученные для образца, с полученными для эталонных растворов.

Сделайте предварительный вывод о наличии и идентичности присутствующих консервантов. Выполните ВЭЖХ, описанную в Разделе B, или, если окажется, что пропионовая кислота присутствует, ГХ, описанную в Разделе C. Сравните полученные времена удерживания со значениями для эталонных растворов.

Объедините результаты ТСХ и ВЭЖХ или ГХ и основывайте окончательную идентификацию консервантов, присутствующих в образце, на объединенных результатах.

Б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ, 4-ГИДРОКСИБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ, СОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Принцип

После подкисления пробу экстрагируют смесью этанола и воды. После фильтрации консерванты определяются методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. Реагенты

2.1. Все реагенты должны иметь аналитическую чистоту и при необходимости подходить для ВЭЖХ. Используемая вода должна быть дистиллированной водой или водой, по крайней мере, эквивалентной чистоты.

2.2. Этанол, абсолютный

2.3. 4-гидроксибензойная кислота

2.4. Салициловая кислота

2.5. Бензойная кислота

2.6. Сорбиновая кислота

2.7. Ацетат натрия, (CH3COONa.3H2O)

2.8. Уксусная кислота, (á)²04= 1,05 г/мл

2.9. Ацетонитрил

2.10. Серная кислота, 2 М

2.11. Гидроксид калия, водный, 0,2 М

2.12. 2-Метоксибензойная кислота

2.13. Смесь этанола и воды

Смешайте девять объемов этанола (2,2) и один объем воды (2:1).

2.14. Внутреннее стандартное решение

Приготавливают раствор, содержащий примерно 1 г 2-метоксибензойной кислоты (2.12) в 500 мл смеси этанола и воды (2.13).

2.15. Подвижная фаза для ВЭЖХ

2.15.1. Ацетатный буфер: к 1 л воды добавляют 6,35 г ацетата натрия (2,7) и 20,0 мл уксусной кислоты (2,8) и перемешивают.

2.15.2. Подготовьте подвижную фазу, смешав девять объемов ацетатного буфера (2.15.1) и один объем ацетонитрила (2.9).

2.16. Консервирующий исходный раствор

Точно взвесьте примерно 0,05 г 4-гидроксибензойной кислоты (2,3), 0,2 г салициловой кислоты (2,4), 0,2 г бензойной кислоты (2,5) и 0,05 г сорбиновой кислоты (2,6) в мерной бочке емкостью 50 мл. колбу и доводят объем смесью этанола с водой (2.13). Храните этот раствор в холодильнике. Раствор стабилен в течение одной недели.

2.17. Стандартные консервирующие растворы

Переносят соответственно 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 и 0,50 мл исходного раствора (2.16) в ряд мерных колб вместимостью 20 мл. В каждую колбу добавляют по 10,00 мл раствора внутреннего стандарта (2.14) и 0,5 мл 2 М серной кислоты (2.10). Доведите объем смесью этанола с водой (2.13). Эти растворы должны быть свежеприготовленными.

3. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование, не указанное иное, и:

3.1. Водяная баня с температурой 60 °C.

3.2. Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором с переменной длиной волны и инжекционной петлей объемом 10 мкл.

3.3. Аналитическая колонка

Нержавеющая сталь, длина от 12,5 до 25 см, внутренний диаметр 4,6 мм, упакована Nucleosil 5C18 или эквивалентом.

3.4. Фильтровальная бумага, диаметр: 90 мм, Schleicher and Schull, Weissband No 5892, или эквивалент.

3.5. Стеклянные пробирки объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой.

3.6. Стеклянные флаконы для проб объемом 5 мл

3.7. Щепка карборундовая размером от 2 до 4 мм или эквивалент.

4. Процедура

4.1. Базовые приготовления

4.1.1. Подготовка проб без добавления внутреннего стандарта

Взвешивают 1 г образца в стеклянной пробирке емкостью 50 мл с завинчивающейся крышкой (3.5). Внесите пипеткой в ​​пробирку 1,00 мл 2 М серной кислоты (2.10) и 40,0 мл смеси этанола с водой (2.13). Добавьте примерно 1 г кипящей стружки (3.7), закройте пробирку и энергично встряхивайте не менее одной минуты до получения однородной суспензии. Чтобы облегчить экстракцию консервантов в этанольную фазу, поместите пробирку ровно на пять минут в водяную баню (3.1), поддерживаемую при температуре 60 °C.

Немедленно охладите пробирку в струе холодной воды и храните экстракт при температуре 5 °C в течение одного часа.

Фильтруют экстракт через фильтровальную бумагу (3.4). Перенесите примерно 2 мл экстракта во флакон для пробы (3.6). Храните экстракт при температуре 5 °C и проводите определение ВЭЖХ в течение 24 часов после приготовления.

4.1.2. Подготовка проб, включая добавление внутреннего стандарта

Взвешивают с точностью до трех десятичных знаков 1 ± 0,1 г (грамм) образца в стеклянной пробирке вместимостью 50 мл с завинчивающейся крышкой (3.5). Добавляют пипеткой 1,00 мл 2 М серной кислоты (2.10) и 30,0 мл смеси этанола и воды (2.13). Добавляют примерно 1 г кипящей стружки (3.7) и 10,00 мл раствора внутреннего стандарта (2.14). Закройте пробирку и энергично встряхивайте не менее одной минуты до получения однородной суспензии. Для облегчения экстракции консервантов в фазу этанола поместите пробирку ровно на пять минут в водяную баню (3.1), поддерживаемую при температуре 60 °С.

Немедленно охладите пробирку в струе холодной воды и храните экстракт при температуре 5 °C в течение одного часа.

Фильтруют экстракт через фильтровальную бумагу (3.4). Перенесите примерно 2 мл фильтрата в пробирку для пробы (3.6). Храните фильтрат при температуре 5 °C и проводите определение ВЭЖХ в течение 24 часов после приготовления.

4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Подвижная фаза: ацетонитрил/ацетатный буфер (2.15).

Доводят скорость потока подвижной фазы через колонку до 2,0 ± 0,5 мл/мин. Установите длину волны детектора на 240 нм.

4.2.1. Калибровка

Вводят по 10 мкл каждого стандартного раствора консерванта (2.17) в жидкостную хроматографию (3.2). Для каждого раствора определяют отношения высот пиков исследуемых консервантов к высоте пика внутреннего стандарта, полученного по хроматограммам. Постройте график для каждого консерванта, связывающий соотношение высоты пика с концентрацией каждого стандартного раствора.

Убедитесь, что в ходе процедуры калибровки для стандартных растворов получен линейный отклик.

4.2.2. Определение

Вводят 10 мкл экстракта пробы (4.1.1) в жидкостный хроматограф (3.2) и записывают хроматограмму. Вводят 10 мкл стандартного раствора консерванта (2.17) и записывают хроматограмму. Сравните полученные хроматограммы. Если на хроматограмме экстракта пробы (4.1.1) не наблюдается пика, имеющего примерно такое же время удерживания, как у 2-метоксибензойной кислоты (рекомендуемый внутренний стандарт), введите 10 мкл экстракта пробы с добавленным внутренним стандартом (4.1.2). в жидкостный хроматограф и записать хроматограмму.

Если на хроматограмме экстракта пробы (4.1.1) наблюдается мешающий пик, имеющий то же время удерживания, что и 2-метоксибензойная кислота, следует выбрать другой подходящий внутренний стандарт. (Если один из исследуемых консервантов отсутствует на хроматограмме, этот консервант можно использовать в качестве внутреннего стандарта.)

Убедиться, что хроматограммы, полученные для стандартного раствора и раствора пробы, соответствуют следующим требованиям:

- пиковое разделение пары с худшим разделением должно быть не менее 0,90. (Определение разделения пиков см. на рисунке 1).

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Рисунок 1: Разделение пиков

ОЖ № L 231, 14.9.1993, с. 34.- Если требуемое разделение не достигается, следует использовать более эффективную колонку или корректировать состав мобильной фазы до тех пор, пока требование не будет выполнено.

- Коэффициент асимметрии As всех полученных пиков должен находиться в пределах от 0,9 до 1,5. (Определение пикового коэффициента асимметрии см. на рисунке 2). Для записи хроматограммы для определения коэффициента асимметрии рекомендуется скорость диаграммы не менее 2 см/мин.

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Рисунок 2: Пиковый коэффициент асимметрии

- Должна быть получена устойчивая базовая линия.

5. Расчет

Используйте отношения высот пиков исследуемых консервантов к высоте пика 2-метоксибензойной кислоты (внутренний стандарт) и калибровочный график для расчета концентрации кислотных консервантов в растворе пробы. Рассчитайте содержание бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, сорбиновой кислоты или салициловой кислоты в образце в массовых процентах (xi), используя формулу:

xi % (м/м) = 100 7 20 7 b 106 7 а = b 500 7 а

в котором:

а = масса (г) образца (4.1.2),

b = концентрация (мкг/мл) консерванта в экстракте пробы (4.1.2), полученная по калибровочному графику.

6. Повторяемость (1)

При содержании 4-гидроксибензойной кислоты 0,40 % разница между результатами двух определений, параллельно проводимых на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,035 %.

При содержании бензойной кислоты 0,50 % разница между результатами двух определений, параллельно проводимых на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,050 %.

При содержании салициловой кислоты 0,50 % разница между результатами двух определений, параллельно проводимых на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,045 %.

При содержании сорбиновой кислоты 0,60 % разница между результатами двух определений, параллельно проводимых на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,035 %.

7. Замечания

7.1. Результаты испытания на устойчивость метода показали, что количество серной кислоты, добавляемой для извлечения кислот из пробы, имеет решающее значение, и пределы количества обрабатываемой пробы следует удерживать в установленных пределах.

7.2. При желании можно использовать соответствующую защитную колонку.

C. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Область применения и применение.

Этот метод подходит для определения пропионовой кислоты максимальной концентрацией 2 % (м/м) в косметических продуктах.

2. Определение

Концентрация пропионовой кислоты, измеренная этим методом, выражается в процентах по массе (% м/м) продукта.

3. Принцип

После извлечения пропионовой кислоты из продукта определение проводят методом газовой хроматографии с использованием 2-метилпропионовой кислоты в качестве внутреннего стандарта.

4. Реагенты

Все реагенты должны быть аналитической чистоты; Необходимо использовать дистиллированную воду или воду эквивалентного качества.

4.1. Этанол 96 % (об./об.)

4.2. Пропионовая кислота

4.3. 2-Метилпропионовая кислота

4.4. Ортофосфорная кислота, 10 % (масс./об.)

4.5. Раствор пропионовой кислоты

Точно отвешивают примерно 1,00 г (п грамм) пропионовой кислоты в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем этанолом (4.1).

4.6. Внутреннее стандартное решение

Точно отвешивают примерно 1,00 г (е грамм) 2-метилпропионовой кислоты в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем этанолом (4.1).

5. Аппарат

5.1. Обычное лабораторное оборудование и:

5.2. Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором

5.3. Стеклянная трубка (20×150 мм) с завинчивающейся крышкой

5.4. Водяная баня при 60 °C

5.5. Стеклянный шприц емкостью 10 мл с мембранным фильтром (диаметр пор: 0,45 мкм)

6. Процедура

6.1. Базовые приготовления

6.1.1. Подготовка проб без внутреннего стандарта

В стеклянную пробирку (5.3) отвешивают примерно 1 г образца. Добавляют 0,5 мл фосфорной кислоты (4.4) и 9,5 мл этанола (4.1).

Закройте пробирку и энергично встряхните. При необходимости помещают пробирку на водяную баню, нагретую до 60 °С (5.4), на пять минут для полного растворения липидной фазы. Быстро остудить под проточной водой. Часть раствора фильтруют через мембранный фильтр (5.5). В тот же день фильтрат хроматографируют.

6.1.2. Подготовка проб с использованием внутреннего стандарта

Взвешивают с точностью до трех десятичных знаков 1 ± 0,1 г (грамм) образца в стеклянную пробирку (5.3). Добавляют 0,5 мл фосфорной кислоты (4.4), 0,50 мл раствора внутреннего стандарта (4.6) и 9 мл этанола (4.1).

Закройте пробирку и энергично встряхните. При необходимости помещают пробирку на водяную баню, нагретую до 60 °С (5.4), на пять минут для растворения липидной фазы. Быстро остудить под проточной водой. Часть раствора фильтруют через мембранный фильтр (5.5). В тот же день фильтрат хроматографируют.

6.2. Условия газовой хроматографии

Рекомендуются следующие условия эксплуатации:

Столбец

Тип Нержавеющая сталь

Длина 2 м

Диаметр 1/8 ″

Набивка 10 % SPTM 1000 (или эквивалент) + 1 % H3PO4 на Chromosorb WAW от 100 до 120 меш.

Температура

Инжектор 200 °С

Колонка 120 °С

Детектор 200 °С

Газ-носитель азот

Скорость потока 25 мл/мин

6.3. Хроматография

6.3.1. Калибровка

В ряд мерных колб вместимостью 20 мл переносят пипеткой по 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 и 4,00 мл соответственно раствора пропионовой кислоты (4.5). В каждую мерную колбу пипеткой переносят по 1,00 мл раствора внутреннего стандарта (4.6); Доводят объем этанолом (4.1) и перемешивают. Приготовленные таким образом растворы содержат e мг/мл 2-метилпропионовой кислоты в качестве внутреннего стандарта (т.е. 1 мг/мл, если e = 1000) и p/4, p/2, p, 2p, 4p мг. /мл пропионовой кислоты (т.е. 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 мг/мл, если p = 1000).

Введите 1 мкл каждого из этих растворов и получите калибровочную кривую, нанеся соотношение массы пропионовой кислоты/2-метилпропионовой кислоты на ось x и соотношение соответствующих площадей пиков на ось y.

Сделайте три инъекции каждого раствора и рассчитайте среднее соотношение площадей пиков.

6.3.2. Определение

Вводят 1 мкл фильтрата пробы. 6.1.1. Сравните хроматограмму с хроматограммой одного из стандартных растворов (6.3.1). Если пик имеет примерно такое же время удерживания, как и 2-метилпропионовая кислота, замените внутренний стандарт. Если помех не наблюдается, введите 1 мкл фильтрата пробы 6.1.2 и измерьте площади пика пропионовой кислоты и пика внутреннего стандарта.

Сделайте три инъекции каждого раствора и рассчитайте среднее соотношение площадей пиков.

7. Расчеты

7.1. Из калибровочной кривой, полученной в 6.3.1, получают соотношение масс (K), соответствующее отношению площадей пика, рассчитанному в 6.3.2.

7.2. По полученному таким образом массовому соотношению рассчитайте содержание пропионовой кислоты в образце (X) в массовых процентах по формуле:

х % (м/м) = К 0,5 7 100 7 е 50 7 а = К е а

в котором:

K = коэффициент, рассчитанный в 7.1,

e = масса внутреннего стандарта в граммах, взвешенная в 4,6,

а = масса образца, взвешенного в 6.1.2, в граммах.

Округлите результаты до одного десятичного знака.

8. Повторяемость (1)

При содержании пропионовой кислоты 2 % (м/м) разница между результатами двух определений, параллельно проводимых на одной и той же пробе, не должна превышать 0,12 %.

II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОХИНОНА, МОНОМЕТИЛЭФИРА ГИДРОХИНОНА, МОНОЭТИЛЭФИРА ГИДРОХИНОНА И МОНОБЕНЗИЛЭФИРА ГИДРОХИНОНА В КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Область применения и применение.

Способ описывает обнаружение и идентификацию гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, моноэтилового эфира гидрохинона и монобензилового эфира гидрохинона (монобензона) в косметических продуктах для осветления кожи.

2. Принцип

Гидрохинон и его эфиры идентифицируют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

3. Реагенты

Все реагенты должны быть аналитической чистоты.

3.1. Этанол, 96 % (об./об.)

3.2. Хлороформ

3.3. Диэтиловый эфир

3.4. Проявочный растворитель:

Хлороформ/диэтиловый эфир, 66:33 (об./об.)

3.5. Аммиак, 25 % (м/м) (d²04 = 0,91 г/мл)

3.6. Аскорбиновая кислота

3.7. гидрохинон

3.8. Монометиловый эфир гидрохинона

3.9. Моноэтиловый эфир гидрохинона

3.10. Монобензиловый эфир гидрохинона (монобензон)

3.11. Эталонные решения

Следующие эталонные растворы должны быть свежеприготовленными и стабильными в течение одного дня.

3.11.1. Отвесьте 0,05 г гидрохинона (3,7) в градуированную пробирку вместимостью 10 мл. Добавляют 0,250 г аскорбиновой кислоты (3.6) и 5 ​​мл этанола (3.1). Добавляют аммиак (3.5) до тех пор, пока pH не станет равным 10, и доводят объем 10 мл этанолом (3.1).

3.11.2. В градуированную пробирку вместимостью 10 мл отвешивают 0,05 г монометилового эфира гидрохинона (3.8). Добавляют 0,250 г аскорбиновой кислоты (3.6) и 5 ​​мл этанола (3.1). Добавляют аммиак (3,5) до тех пор, пока pH не станет равным 10, и доводят объем этанолом (3,1) до 10 мл.

3.11.3. В градуированную пробирку вместимостью 10 мл отвешивают 0,05 г моноэтилового эфира гидрохинона (3.9). Добавляют 0,250 г аскорбиновой кислоты (3.6) и 5 ​​мл этанола (3.1). Добавляют аммиак (3,5) до тех пор, пока pH не станет равным 10, и доводят объем этанолом (3,1) до 10 мл.

3.11.4. Отвешивают 0,05 г монобензилового эфира гидрохинона (3.10) в градуированную пробирку вместимостью 10 мл. Добавляют 0,250 г аскорбиновой кислоты (3.6) и 5 ​​мл этанола (3.1). Добавляют аммиак (3,5) до тех пор, пока pH не станет равным 10, и доводят объем этанолом (3,1) до 10 мл.

3.12. Нитрат серебра

3.13. 12-молибдофосфорная кислота

3.14. Гексагидрат феррицианида калия

3.15. Хлорид железа, гексагидрат

3.16. Распыление реагентов

3.16.1. К 5%-ному водному раствору нитрата серебра (3.12) добавляют аммиак (3.5) до растворения образовавшегося осадка.

Предупреждение:

раствор становится взрывоопасным при стоянии и его следует выбросить после использования.

3.16.2. 10% (масс./об.) раствор 12-молибдофосфорной кислоты (3.13) в этаноле (3.1).

3.16.3. Приготовьте 1%-ный (масс./об.) водный раствор феррицианида калия (3.14) и 2%-ный (масс./об.) водный раствор хлорида железа (3.15). Смешайте равные части обоих растворов непосредственно перед использованием.

4. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование и:

4.1. Обычное оборудование для ТСХ

4.2. Пластины для ТСХ, готовые к использованию: силикагель GHAR/UV254; 20 × 20 см (Macherey, Nagel или аналог). Толщина слоя 0,25 мм

4.3. Ультразвуковая ванна

4.4. Центрифуга

4.5. УФ-лампа, 254 нм

5. Процедура

5.1. Подготовка образца

Взвесьте 3,0 г образца в градуированную пробирку емкостью 10 мл. Добавляют 0,250 г аскорбиновой кислоты (3.6) и 5 ​​мл этанола (3.1). Доведите pH раствора до 10, используя аммиак (3,5). Доводят объём 10 мл этанолом (3.1). Закройте пробирку пробкой и гомогенизируйте в ультразвуковой ванне в течение 10 минут. Фильтруют через фильтровальную бумагу или центрифугируют при 3000 об/мин.

5.2. ТСХ

5.2.1. Насытите хроматографический резервуар проявителем (3.4).

5.2.2. Нанесите на чашку 2 мкл эталонных растворов (3.11) и 2 мкл раствора образца (5.1). Проявите в темноте при температуре окружающей среды до тех пор, пока фронт растворителя не переместится на 15 см от начала.

5.2.3. Снимите пластину и дайте высохнуть при комнатной температуре.

5.3. Обнаружение

5.3.1. Наблюдайте за пластинкой под УФ-светом с длиной волны 254 нм и отметьте положение пятен.

5.3.2. Опрыскайте тарелку:

- реагент нитрат серебра (3.16.1), или

- реактив 12-молибдофосфорная кислота (3.16.2); нагреть примерно до 120°C или

- раствор феррицианида калия и раствор хлорида железа (3.16.3).

6. Идентификация

Рассчитайте значение Rf для каждого пятна.

Сравните пятна, полученные для раствора образца, с пятнами для эталонных растворов относительно: их значений Rf; цвет пятен под воздействием УФ-излучения; и цвета пятен после визуализации с помощью распыляемого реагента.

Выполните ВЭЖХ, описанную в следующем разделе (B), и сравните время удерживания, полученное для пика(ов) образца, со временем удерживания для эталонных растворов.

Объедините результаты ТСХ и ВЭЖХ, чтобы определить присутствие гидрохинона и/или его эфиров.

7. Замечания

В описанных условиях наблюдались следующие значения Rf:

гидрохинон: 0,32

монометиловый эфир гидрохинона: 0,53

моноэтиловый эфир гидрохинона: 0,55

монобензиловый эфир гидрохинона: 0,58

Б. РЕШЕНИЕ

1. Область применения и применение.

Настоящий метод определяет процедуру определения гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, моноэтилового эфира гидрохинона и монобензилового эфира гидрохинона в косметических средствах для осветления кожи.

2. Принцип

Образец экстрагируют смесью воды и метанола при слабом нагревании для расплавления любого липидного материала. Определение аналитов в полученном растворе проводят методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.

3. Реагенты

3.1. Все реагенты должны быть аналитического качества. Используемая вода должна быть дистиллированной водой или водой, по крайней мере, эквивалентной чистоты.

3.2. Метанол

3.3. гидрохинон

3.4. Монометиловый эфир гидрохинона

3.5. Монетиловый эфир гидрохинона

3.6. Монобензиловый эфир гидрохинона (монобензон)

3.7. Тетрагидрофуран, сорт для ВЭЖХ

3.8. Смесь вода/метанол 1:1 (об./об.). Смешать один объем воды и один объем метанола (3.2)

3.9. Подвижная фаза: смесь тетрагидрофуран/вода 45:55 (по объему). Смешайте 45 объемов тетрагидрофурана (3,7) и 55 объемов воды.

3.10. Эталонное решение

В мерную колбу вместимостью 50 мл отвешивают 0,06 г гидрохинона (3.3), 0,08 г монометилового эфира гидрохинона (3.4), 0,10 г моноэтилового эфира гидрохинона (3.5) и 0,12 г монобензилового эфира гидрохинона (3.6). Растворяют и доводят объем метанолом (3.2). Приготовьте раствор сравнения, разбавив 10,00 мл этого раствора до 50,00 мл смесью воды и метанола (3.8). Эти растворы должны быть свежеприготовленными.

4. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование и:

4.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60 °C.

4.2. Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором с переменной длиной волны и инжекционной петлей объемом 10 мкл.

4.3. Аналитическая колонка:

Хроматографическая колонка из нержавеющей стали, длина 250 мм, внутренний диаметр 4,6 мм, набитая фенилом Zorbax (химически связанным фенетилсиланом на Zorbax SIL, с концевыми группами триметилхлорсилана), размер частиц 6 мкм или эквивалент. Не используйте защитную колонку, кроме фенил-защитной или эквивалентной.

4.4. Фильтровальная бумага диаметром 90 мм, Schleicher and Schull, Weissband No 5892, или эквивалент.

5. Процедура

5.1. Базовые приготовления

Взвешивают с точностью до трех десятичных знаков 1 ± 0,1 г (грамм) образца в мерную колбу вместимостью 50 мл. Диспергируют образец в 25 мл смеси воды и метанола (3.8). Закройте колбу и энергично встряхните до получения однородной суспензии. Встряхивайте не менее одной минуты. Поместите колбу на водяную баню (4.1), поддерживаемую при температуре 60 °С для усиления экстракции. Охладите колбу и доведите объем водой/метанолом (3.8). Отфильтруйте экстракт, используя фильтровальную бумагу (4.4). Выполните определение ВЭЖХ в течение 24 часов после приготовления экстракта.

5.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

5.2.1. Доведите скорость потока подвижной фазы (3.9) до 1,0 мл/мин и установите длину волны детектора на 295 нм.

5.2.2. Введите 10 мкл раствора образца, полученного, как описано в разделе 5.1, и запишите хроматограмму. Измерьте площади пиков. Выполните калибровку, как описано в 5.2.3. Сравните хроматограммы, полученные для пробы и стандартных растворов. Используйте пиковые значения aera и коэффициенты отклика (RF), рассчитанные в соответствии с 5.2.3, для расчета концентрации аналитов в растворе пробы.

5.2.3. Калибровка

Вводят 10 мкл эталонного раствора (3.10) и записывают хроматограмму. Введите несколько раз до получения постоянной площади пика.

Определим коэффициент отклика RFi:

RFi = пи ci

в котором:

pi = площадь пика гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона и монобензилового эфира гидрохинона, и

ci = концентрация (г/50 мл) в эталонном растворе (3.10) гидрохинона, монометилового эфира гидрохинона, моноэтилового эфира гидрохинона или монобензилового эфира гидрохинона.

Убедиться, что хроматограммы, полученные для стандартного раствора и раствора пробы, соответствуют следующим требованиям:

- пиковое разделение пары с худшим разделением должно быть не менее 0,90. (Определение разделения пиков см. на рисунке 1.)

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Рисунок 1: Разделение пиков

Если требуемое разделение не достигается, следует использовать более эффективную колонку или корректировать состав подвижной фазы до тех пор, пока требование не будет выполнено.

- Коэффициент асимметрии AS всех полученных пиков должен находиться в диапазоне от 0,9 до 1,5. (Определение пикового коэффициента асимметрии см. на рисунке 2.) Для записи хроматограммы для определения коэффициента асимметрии рекомендуется использовать скорость диаграммы не менее 2 см/мин.

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Рисунок 2: Пиковый коэффициент асимметрии

- Должна быть получена устойчивая базовая линия.

6. Расчет

Используйте площади пиков аналитов для расчета концентрации аналитов в образце. Рассчитайте концентрацию аналита в образце в массовых процентах (xi) по формуле:

xi % (м/м) = bi 7 100 RFi 7 а

в котором:

а = масса образца в граммах, и

bi = площадь пика аналита i в образце.

7. Повторяемость (1)

7.1. При содержании гидрохинона 2,0 % разница между результатами двух определений, проведенных параллельно на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,13 %.

7.2. При содержании монометилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, проводимых параллельно на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,1 %.

7.3. При содержании моноэтилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, проведенных параллельно на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,11 %.

7.4. При содержании монобензилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, проведенных параллельно на одной и той же пробе, не должна превышать абсолютное значение 0,11 %.

8. Воспроизводимость (1)

8.1. При содержании гидрохинона 2,0 % разница между результатами двух определений, проведенных на одной и той же пробе в разных условиях (разные лаборатории, разные операторы, разная аппаратура и/или разное время), не должна превышать абсолютное значение 0, 37 %.

8.2. При содержании монометилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, выполненных на одной и той же пробе в разных условиях (разные лаборатории, разные операторы, разная аппаратура и/или разное время), не должна превышать абсолютное значение 0. ,21 %.

8.3. При содержании моноэтилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, выполненных на одной и той же пробе в разных условиях (разные лаборатории, разные операторы, разная аппаратура и/или разное время), не должна превышать абсолютное значение 0. ,19 %.

8.4. При содержании монобензилового эфира гидрохинона 1,0 % разница между результатами двух определений, выполненных на одной и той же пробе в разных условиях (разные лаборатории, разные операторы, разная аппаратура и/или разное время), не должна превышать абсолютное значение 0. ,11 %.

9. Замечания

9.1. Если обнаружено содержание гидрохинона, значительно превышающее 2 %, и требуется точная оценка содержания, экстракт образца (5.1) следует разбавить до концентрации, аналогичной той, которая была бы получена для образца, содержащего 2 % гидрохинона, и повторить определение. .

(В некоторых приборах оптическая плотность может выходить за пределы линейного диапазона детектора при высоких концентрациях гидрохинона.)

9.2. Помехи

Описанный выше метод позволяет определять гидрохинон и его эфиры за один изократический анализ. Использование фенильной колонки обеспечивает достаточное удерживание гидрохинона, что не может быть гарантировано при использовании колонки C18 с описанной подвижной фазой.

Однако этот метод подвержен помехам со стороны ряда парабенов. В таких случаях определение следует повторить, используя другую систему подвижной/стационарной фазы. Подходящие методы можно найти в ссылках 1 и 2, а именно:

Колонка: Zorbax ODS, 4,6 мм × 25 мм или эквивалент:

температура: 36 °С

поток: 1,5 мл/мин

Мобильная фаза:

для гидрохинона: метанол/вода 5/95 (об/об)

для монометилового эфира гидрохинона: метанол/вода 30/70 (об/об)

для монобензилового эфира гидрохинона: метанол/вода 80/20 (об/об) (1).

Колонка: Spherisorb S5-ODS или эквивалент:

подвижная фаза: вода/метанол 90/10 (об/об)

поток: 1,5 мл/мин.

Эти условия подходят для гидрохинона (2).

(1) ИСО 5725.

(1) ИСО 5725.

(1) ИСО 5725.

(1) М. Герполь-Борреманс и М.-О. Масса, идентификация и дозировка гидрохинона и его метиловых и бензиловых эфиров в косметических средствах для отбеливания кожи. Межд. Дж. Косметический. наук. 8-203-214 (1986).

(2) Дж. Ферт и И. Рикс, Определение гидрохинона в тонирующих кремах для кожи, Аналитик (1986), 111, с. 129.