Одиннадцатая Директива Комиссии 93/70/EEC от 28 июля 1993 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

ОДИННАДЦАТАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 93/70/EEC от 28 июля 1993 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов (1), с последними поправками, внесенными Регламентом (EEC) № 3768/85 (2), и, в частности, статью 2 этого документа,

Принимая во внимание, что Директива 70/373/EEC требует, чтобы официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, вытекающим из положений о качестве и составе, установленных законом, постановлением или административными действиями, проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества;

Принимая во внимание, что метод анализа Сообщества для добавки галофугинона должен быть установлен для использования при проверке соблюдения условий ее использования в питании животных;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы на содержание галофугинона в целях официальных проверок кормов проводились с использованием метода, описанного в Приложении к настоящему документу.

Статья 2

Государства-члены должны ввести в действие законы, правила и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, к 30 июня 1994 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки должен быть принят государствами-членами.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 28 июля 1993 года.

Для Комиссии

Рене ШТАЙХЕН

Член Комиссии

(1) ОЖ № L 170, 3.8.1970, с. 2.

(2) ОЖ № L 362, 31.12.1985, с. 8.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГАЛОФУГИНОНА DL-транс-7-бром-6-хлор-3-[3-(3-гидрокси-2-пиперидил)ацетонил]хиназолин-4-(3Н)-она гидробромида

1. Цель и сфера применения

Метод предназначен для определения галофугинона в кормах. Нижний предел определения — 1 мг/кг.

2. Принцип

После обработки горячей водой галофугинон экстрагируют в виде свободного основания этилацетатом и затем распределяют в виде гидрохлорида в водный раствор кислоты. Экстракт очищают ионообменной хроматографией. Содержание галофугинона определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с резервной фазой (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора.

3. Реагенты

3.1. Ацетонитрил, сорт для ВЭЖХ

3.2. Смола Амберлит ХАД-2

3.3. Ацетат аммония

3.4. Ацетат этила

3.5. Уксусная кислота ледяная

3.6. Стандартное вещество галофугинона (DL-транс-7-бром-6-хлор-3-[3-гидрокси-2-пиперидил)ацетонил]хиназолин-4-(3H)-она гидробромид, Е 764)

3.6.1. Исходный стандартный раствор галофугинона, 100 мг/мл

Навеску с точностью до 0,1 мг 50 мг галофугинона (3.6) помещают в градуированную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в буферном растворе ацетата аммония (3.18), доводят до метки буферным раствором и перемешивают. Этот раствор стабилен в течение трех недель при температуре 5 °C при хранении в темноте.

3.6.2. Калибровочные решения

В серию градуированных колб вместимостью 100 мл переносят по 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 и 6,0 мл исходного стандартного раствора (3.6.1). Доведите до метки подвижной фазой (3.21) и перемешайте. Эти растворы имеют концентрации галофугинона 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 и 6,0 мг/мл соответственно. Эти растворы должны быть свежеприготовленными перед применением.

3.7. Соляная кислота (r20 примерно 1,16 г/мл).

3.8. Метанол

3.9. Нитрат серебра

3.10. Аскорбат натрия

3.11. Карбонат натрия

3.12. Хлорид натрия

3.13. ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль)

3.14. Вода, степень ВЭЖХ

3.15. Раствор карбоната натрия, v = 10 г/100 мл

3.16. Насыщенный раствор карбоната натрия хлорида натрия, v = 5 г/100 мл

50 г карбоната натрия (3.11) растворяют в воде, доводят объем до 1 л и добавляют хлорид натрия (3.12) до насыщения раствора.

3.17. Соляная кислота, примерно 0,1 моль/л

10 мл HCl (3,7) разбавьте водой до 1 л.

3.18. Буферный раствор ацетата аммония, примерно 0,25

19,3 г ацетата аммония (3,3) и 30 мл уксусной кислоты (3,5) растворяют в воде (3,14) и доводят до 1 л.

3.19. Приготовление смолы Амберлит ХАД-2

Промывают соответствующее количество амберлита (3.2) водой до тех пор, пока все ионы хлорида не будут удалены, как показывает испытание с нитратом серебра (3.20), проведенное на отброшенной водной фазе. Затем промывают смолу 50 мл метанола (3.8), метанол выбрасывают и хранят смолу под свежим метанолом.

3.20. Раствор нитрата серебра, примерно 0,1 моль/л

0,17 г нитрата серебра (3.9) растворяют в 10 мл воды.

3.21. ВЭЖХ Мобильная фаза

500 мл ацетонитрила (3.1) смешивают с 300 мл буферного раствора ацетата аммония (3.18) и 1200 мл воды (3.14). Доведите pH до 4,3 с помощью уксусной кислоты (3,5). Фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мм (4.8) и дегазируют раствор (например, ультразвуком в течение 10 минут). Этот раствор стабилен в течение одного месяца при хранении в темноте в закрытой таре.

4. Аппарат

4.1. Ультразвуковая ванна

4.2. Ротационный пленочный испаритель

4.3. Центрифуга

4.4. Оборудование для ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны или диодным детектором

4.4.1. Жидкостная хроматографическая колонка, 300 мм × 4 мм, С 18, упаковка 10 мм, или эквивалентная колонка

4.5. Стеклянная колонка (300 мм × 10 мм), оснащенная фильтром из спеченного стекла и запорным краном.

4.6. Стекловолоконные фильтры диаметром 150 мм.

4.7. Мембранные фильтры, 0,45 мм

4.8. Мембранные фильтры, 0,22 мм

5. Процедура

Примечание. Галофугинон как свободное основание неустойчив в щелочных растворах и растворах этилацетата. Он не должен оставаться в этилацетате более 30 минут.

5.1. Общий

5.1.1. Холостой корм следует проанализировать, чтобы убедиться в отсутствии галофугинона и мешающих веществ.

5.1.2. Тест на восстановление следует проводить путем анализа контрольного корма, обогащенного добавлением количества галофугинона, аналогичного количеству, присутствующему в образце. Для обогащения на уровне 3 мг/кг добавьте 300 мл исходного стандартного раствора (3.6.1) к 10 г контрольного корма, перемешайте и подождите 10 минут, прежде чем приступить к этапу экстракции (5.2).

Примечание: для целей этого метода холостое сырье должно быть аналогично типу образца, и при анализе галофугинон не должен обнаруживаться.

5.2. Добыча

Взвесьте с точностью до 0,1 г 10 г приготовленной пробы в центрифужную пробирку вместимостью 200 мл, добавьте 0,5 г аскорбата натрия (3.10), 0,5 г ЭДТА (3.13) и 20 мл воды и смешивание. Поместите пробирку на 5 минут на водяную баню (80 °C). После охлаждения до комнатной температуры прибавляют 20 мл раствора карбоната натрия (3,15) и перемешивают. Немедленно добавьте 100 мл этилацетата (3.4) и энергично встряхивайте вручную в течение 15 секунд. Затем поместите пробирку на три минуты в ультразвуковую ванну (4.1) и ослабьте пробку. Центрифугируйте в течение двух минут и декантируйте фазу этилацетата через стекловолоконный фильтр (4.6) в делительную воронку емкостью 500 мл. Повторите экстракцию образца второй порцией этилацетата объемом 100 мл. Объединенные экстракты промывают в течение одной минуты 50 мл насыщенного хлоридом натрия раствора карбоната натрия (3.16) и водный слой удаляют.

Органический слой экстрагируют в течение 1 мин 50 мл соляной кислоты (3.17). Налейте нижний слой кислоты в делительную воронку емкостью 250 мл. Органический слой повторно экстрагируют в течение 1,5 минут дополнительными 50 мл соляной кислоты и объединяют с первым экстрактом. Объединенные кислотные экстракты промывают, вращая в течение примерно 10 секунд, с 10 мл этилацетата (3.4).

Количественно переносят водный слой в круглодонную колбу емкостью 250 мл и органическую фазу отбрасывают. Весь оставшийся этилацетат из раствора кислоты выпаривают с помощью ротационного пленочного испарителя (2.4). Температура водяной бани не должна превышать 40°С. В вакууме примерно 25 мбар весь остаточный этилацетат будет удален в течение 5 минут при 38°С.

5.3. Очистить

5.3.1. Подготовка колонки с амберлитом

Для каждого экстракта образца готовят колонку XAD-2. Переносят 10 г приготовленного амберлита (3.19) в стеклянную колонку (4.5) с метанолом (3.8). Добавьте небольшой кусочек стекловаты на верхнюю часть слоя смолы. Слейте метанол из колонны и промойте смолу 100 мл воды, останавливая поток, когда жидкость достигает верхней части слоя смолы. Дайте колонке уравновеситься за 10 минут до использования. Никогда не позволяйте колонке иссякать.

5.3.2. Пример очистки

Количественно перенесите экстракт (5.2) в верхнюю часть подготовленной колонки с амберлитом (5.3.1) и элюируйте, отбрасывая элюат. Скорость элюирования не должна превышать 20 мл/мин. Ополосните круглодонную колбу 20 мл хлористоводородной кислоты (3.17) и промывайте ею колонку со смолой. Продуйте остатки раствора кислоты струей воздуха. Выбросьте стирку. Добавьте в колонку 100 мл метанола (3.8) и дайте элюировать от 5 до 10 мл, собирая элюат в круглодонную колбу емкостью 250 мл. Оставшийся метанол оставляют на 10 минут для уравновешивания со смолой и продолжают элюирование со скоростью не более 20 мл/мин, собирая элюат в ту же круглодонную колбу. Метанол выпаривают на ротационном пленочном испарителе (4.2), температура водяной бани не должна превышать 40 °С. Количественно переносят остаток в калиброванную колбу вместимостью 10 мл, используя подвижную фазу (3.21). Доведите до метки подвижной фазой и перемешайте. Аликвоту фильтруют через мембранный фильтр (4.7). Зарезервируйте этот раствор для определения ВЭЖХ (5.4).

5.4. Определение ВЭЖХ

5.4.1. Параметры

Следующие условия предлагаются в качестве руководства; можно использовать и другие условия, если они дают эквивалентные результаты.

Жидкостная хроматографическая колонка (4.4.1)

ВЭЖХ Подвижная фаза (3.21)

Скорость потока: от 1,5 до 2 мл/мин.

Длина волны обнаружения: 243 нм

Объем инъекции: от 40 до 100 мл.

Проверяют стабильность хроматографической системы, несколько раз вводя калибровочный раствор (3.6.2), содержащий 3,0 мг/мл, до достижения постоянной высоты пика (или площади) и времени удерживания.

5.4.2. Калибровочный график

Вводят каждый калибровочный раствор (3.6.2) несколько раз и измеряют высоту (площадь) пика для каждой концентрации. Постройте калибровочный график, используя средние высоты пиков или площади калибровочных растворов в качестве ординат и соответствующие концентрации в мг/мл в качестве абсцисс.

5.4.3. Пример решения

Вводят экстракт образца (5.3.2) несколько раз, используя тот же объем, что и калибровочные растворы, и определяют среднюю высоту (площадь) пиков галофугинона.

6. Подсчет результатов

Концентрацию раствора пробы определяют в мг/мл по средней высоте (площади) пиков галофугинона в растворе пробы, сверяясь с калибровочным графиком (5.4.2).

Содержание галофугинона w (мг/кг) в образце определяется по следующей формуле:

ш = с × 10 м

в котором:

- c: концентрация галофугинона в растворе образца в мг/мл,

- m: масса исследуемой порции в граммах.

7. Проверка результатов

7.1. Личность

Идентичность аналита можно подтвердить с помощью совместной хроматографии или с помощью диодно-матричного детектора, с помощью которого сравнивают спектры экстракта пробы и калибровочного раствора (3.6.2), содержащего 6,0 мг/мл.

7.1.1. Кохроматография

Экстракт пробы обогащают добавлением соответствующего количества калибровочного раствора (3.6.2). Количество добавленного галофугинона должно быть аналогично предполагаемому количеству галофугинона, обнаруженного в экстракте образца.

Следует увеличить только высоту пика галофугинона с учетом как добавленного количества, так и разбавления экстракта. Ширина пика на половине его максимальной высоты должна находиться в пределах ± 10 % от исходной ширины.

7.1.2. Обнаружение диодной матрицы

Результаты оцениваются по следующим критериям:

(a) длина волны максимального поглощения образца и стандартного спектра, записанная на вершине пика на хроматограмме, должна быть одинаковой в пределах, определяемых разрешающей способностью системы обнаружения. Для обнаружения с помощью диодной матрицы это обычно находится в пределах ± 2 нм;

(b) в диапазоне от 225 до 300 нм спектры образца и стандарта, записанные на вершине пика хроматограммы, не должны отличаться для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне от 10 до 100 % или относительного поглощения. Этот критерий выполняется, когда присутствуют одни и те же максимумы и ни в одной наблюдаемой точке отклонение между двумя спектрами не превышает 15 % оптической плотности стандартного аналита;

(c) в диапазоне 225–300 нм спектры подъема, вершины и спада пика, образуемого экстрактом образца, не должны отличаться друг от друга для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне от 10 до 100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется при наличии одинаковых максимумов и когда во всех наблюдаемых точках отклонение между спектрами не превышает 15 % оптической плотности спектра апекса.

Если один из этих критериев не соответствует, присутствие аналита не подтверждено.

7.2. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 0,5 мг/кг при содержании галофугинона до 3 мг/кг.

7.3. Восстановление

Для обогащенного холостого образца извлечение должно составлять не менее 80 %.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование (1), в ходе которого восемь лабораторий проанализировали три образца.

Полученные результаты

/* Таблицы: см. OJ */

(1) The Analyst 108, 1983, стр. 1252–1256.