Директива Комиссии 92/69/EEC от 31 июля 1992 г., в семнадцатый раз адаптирующаяся к техническому прогрессу. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ.

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 92/69/EEC от 31 июля 1992 года об адаптации к техническому прогрессу в семнадцатый раз. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ.

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 67/548/EEC от 27 июня 1967 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (1), с последними поправками, внесенными Директивой 92/32/EEC. (2), и в частности его статьи 28 и 29,

(1) ОЖ № 196, 16.8.1967, с. 1.

(2) ОЖ № L 154, 5.6.1992, с. 1.

Принимая во внимание, что статья 3 (1) Директивы 67/548/EEC и статья 3 Директивы Совета 88/379/EEC от 7 июня 1988 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных препаратов (3), с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 90/492/EEC (4), предусматривают, что физико-химические свойства, токсичность и экотоксичность веществ и препаратов должны определяться в соответствии с методами, указанными в Приложении V к Директиве 67/548. /ЕЭС;

(1) ОЖ № 196, 16.8.1967, с. 1.

(3) ОЖ № L 187, 16.7.1988, с. 14.

(4) ОЖ № L 275, 5.10.1990, с. 35.

Принимая во внимание, что текст Приложения V к Директиве 67/548/EEC в настоящее время опубликован в двух частях, это соответственно Приложение к Директиве Комиссии 84/449/EEC (5) и Приложение к Директиве Комиссии 88/302/EEC (6 );

(5) ОЖ № L 251, 19.9.1984, с. 1.

(6) ОЖ № L 133, 30.5.1988, с. 1 и OJ № L 136, 2.6.1988, с. 20.

Принимая во внимание, что для учета технических разработок необходимо пересмотреть методы испытаний, указанные в Приложении к Директиве Комиссии 84/449/EEC;

Принимая во внимание, что для учета технических разработок также необходимо пересмотреть метод испытаний для испытания на ингибирование водорослей, который в настоящее время находится в Приложении к Директиве Комиссии 88/302/EEC, и в этом случае передать этот метод испытаний в Приложение к Директиве 84/449/EEC;

Принимая во внимание, что целесообразно сократить до минимума количество животных, используемых в экспериментальных целях, в соответствии с Директивой Совета 86/609/EEC о сближении законов, правил и административных положений государств-членов относительно защиты животных, используемых в экспериментальных целях. экспериментальные цели (7);

(7) ОЖ № L 358, 18.12.1986, с. 1.

Поскольку положения настоящей Директивы соответствуют мнению Комитета по адаптации к техническому прогрессу Директив по устранению технических барьеров в торговле опасными веществами и препаратами,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Приложение к Директиве 84/449/EEC настоящим заменяется Приложением к настоящей Директиве.

Статья 2

Метод испытания на ингибирование роста водорослей, описанный в Приложении к Директиве 88/302/EEC, настоящим удаляется.

Статья 3

Государства-члены должны ввести в действие законы, правила и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 30 октября 1993 г. Государства-члены должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации.

Порядок такой ссылки утверждается государствами-членами.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 31 июля 1992 года. За Комиссию.

Карел ВАН МИЕРТ

Член Комиссии

ПРИЛОЖЕНИЕ

Настоящее Приложение будет опубликовано в Официальном журнале Европейских сообществ № L 383 A. (См. уведомление, опубликованное на внутренней стороне задней обложки этого Официального журнала.)

Приложение к Директиве Комиссии 92/69/EEC от 31 июля 1992 года, в семнадцатый раз адаптирующейся к техническому прогрессу. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ.

(1)СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ А: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ //5

А.1. Температура плавления/замерзания //5

А.2. Температура кипения //15

А.3. Относительная плотность //21

А.4. Давление пара //26

А.5. Поверхностное натяжение //47

А.6. Растворимость в воде //54

А.8. Коэффициент распределения //63

А.9. Точка воспламенения //74

А.10. Горючесть (твердые вещества) //76

А.11. Горючесть (газы) //79

А.12. Горючесть (контакт с водой) //81

А.13. Пирофорные свойства твердых тел и жидкостей //85

А.14. Взрывчатые свойства //87

А.15. Температура самовоспламенения (жидкости и газы)//98

А.16. Относительная температура самовоспламенения твердых веществ //99

А.17. Окислительные свойства (твердые вещества) //102

ЧАСТЬ Б: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ //107

Общее введение//107

Б.1. Острая токсичность (перорально) //110

B.1 bis Острая токсичность (перорально) Метод с фиксированной дозой //113

БИ 2. Острая токсичность (ингаляционная) //117

Б.3. Острая токсичность (дермальная) //121

Б.4. Острая токсичность (раздражение кожи) //124

Б.5. Острая токсичность (раздражение глаз) //127

Б.6. Сенсибилизация кожи //131

Б.7. Токсичность при повторной дозе (28 дней) (перорально) //136

Б.8. Токсичность повторного приема (28 дней) (ингаляционно) //140

Б.9. Токсичность при повторной дозе (28 дней) (кожная) //144

Б.10. Мутагенность (цитогенетический тест на млекопитающих in vitro) //148

Б.11. Мутагенность (цитогенетический тест костного мозга млекопитающих in vivo, хромосомный анализ) //151

Б.12. Мутагенность (микроядерный тест) //154

Б.13. Мутагенность (Escherichia coli - анализ обратной мутации) //157

Б.14. Мутагенность (Salmonella typhimurium - анализ обратной мутации) //160

ЧАСТЬ С: МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИЧНОСТИ //163

С.1. Острая токсичность для рыб //163

С.2. Острая токсичность для дафний //172

С.3. Тест на ингибирование водорослей //179

С.4. Биодеградация: определение готовой биоразлагаемости //187

C.4-A: Вымирание растворенного органического углерода (DOC) //194

C.4-B: Модифицированный скрининговый тест ОЭСР //197

C.4-C: Выделение углекислого газа (CO2) //202

C.4-D: Манометрическая респирометрия //207

C.4-E: Закрытая бутылка //211

C.4-F: MITI (Министерство международной торговли и промышленности – Япония) //216

Приложения //221

С.5. Деградация: биохимическая потребность в кислороде //226

С.6. Деградация: химическая потребность в кислороде //227

С.7. Деградация: абиотическая деградация: гидролиз в зависимости от pH //229

ВВЕДЕНИЕ

В Приложении изложены методы испытаний для определения физико-химических, токсикологических и экотоксикологических свойств, перечисленных в Приложениях VII и VIII к Директиве 79/831/ЕЕС. Методы основаны на методах, признанных и рекомендованных компетентными международными организациями (в частности, ОЭСР).

Когда такие методы были недоступны, применялись национальные стандарты или методы научного консенсуса. Как правило, испытания следует проводить с веществом, определенным Директивой.

Следует обратить внимание на возможное влияние примесей на результаты испытаний.

Если методы настоящего Приложения не подходят для исследования определенного объекта, уведомитель должен обосновать используемый альтернативный метод.

Тесты и исследования на животных должны проводиться в соответствии с национальными правилами и с учетом гуманных принципов и международных достижений в области защиты животных.

Среди эквивалентных методов тестирования выбирают метод с использованием минимального количества животных.

ЧАСТЬ А: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

А.1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ/ЗАМЕРЗАНИЯ

1. МЕТОД

Большинство описанных методов основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). Фундаментальные принципы приведены в ссылках (2) и (3).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Описанные методы и устройства должны применяться для определения температуры плавления веществ без ограничения по степени их чистоты.

Выбор метода зависит от природы исследуемого вещества. В результате ограничивающий фактор будет зависеть от того, можно ли вещество измельчить легко, с трудом или вообще нельзя.

Для некоторых веществ более подходящим является определение температуры замерзания или затвердевания, и стандарты для этих определений также включены в этот метод.

Если из-за особых свойств вещества невозможно измерить ни один из вышеперечисленных параметров, можно указать температуру застывания.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Температура плавления определяется как температура, при которой происходит фазовый переход из твердого состояния в жидкое при атмосферном давлении, и эта температура идеально соответствует температуре замерзания.

Поскольку фазовый переход многих веществ происходит в определенном диапазоне температур, его часто называют диапазоном плавления.

Преобразование единиц (К в С)

т = Т 273,15

t: температура по Цельсию, градус Цельсия (C)

Т: термодинамическая температура, кельвин (К)

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества.

Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

Некоторые калибровочные вещества перечислены в ссылках (4).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Определена температура (диапазон температур) фазового перехода из твердого состояния в жидкое или из жидкого в твердое состояние. На практике при нагреве/охлаждении образца исследуемого вещества при атмосферном давлении определяют температуры начального плавления/замерзания и конечной стадии плавления/замерзания. Описано пять типов методов, а именно капиллярный метод, методы горячей стадии, определение температуры замерзания, методы термического анализа и определение температуры застывания (разработанные для нефтяных масел). В некоторых случаях может быть удобно измерять температуру замерзания вместо температуры плавления.

1.4.1. Капиллярный метод

1.4.1.1. Устройства температуры плавления с жидкостной ванной

Небольшое количество мелкоизмельченного вещества помещают в капилляр и плотно упаковывают. Трубку нагревают вместе с термометром, и во время фактического плавления повышение температуры доводят до уровня менее примерно 1 К/мин. Определены начальная и конечная температуры плавления.

1.4.1.2. Устройства температуры плавления с металлическим блоком

Как описано в 1.4.1.1, за исключением того, что капиллярная трубка и термометр расположены в нагретом металлическом блоке и их можно наблюдать через отверстия в блоке.

1.4.1.3. Обнаружение фотоэлементов

Образец в капиллярной трубке автоматически нагревается в металлическом цилиндре. Луч света направляется через вещество через отверстие в цилиндре на точно калиброванный фотоэлемент. Оптические свойства большинства веществ изменяются от непрозрачных до прозрачных при плавлении. Интенсивность света, попадающего на фотоэлемент, увеличивается и посылает сигнал остановки на цифровой индикатор, считывающий температуру платинового термометра сопротивления, расположенного в камере нагрева. Этот метод не подходит для некоторых сильно окрашенных веществ.

1.4.2. Горячие сцены

1.4.2.1. Кофлер горячий бар

В горячем стержне Кофлера используются два куска металла с разной теплопроводностью, нагреваемые электрически, при этом стержень сконструирован таким образом, что градиент температуры по его длине практически линейный. Температура горячего стержня может находиться в диапазоне от 283 до 573 К с помощью специального устройства для измерения температуры, включающего бегун с указателем и язычок, предназначенный для конкретного стержня. Для определения температуры плавления вещество наносят тонким слоем непосредственно на поверхность горячего стержня. Через несколько секунд появляется резкая разделительная линия между жидкой и твердой фазой. Температура на разделительной линии считывается путем установки указателя на линию.

1.4.2.2. Расплавленный микроскоп

Для определения температуры плавления очень малых количеств материала используются несколько горячих столиков микроскопа. На большинстве горячих стадий температура измеряется чувствительной термопарой, но иногда используются ртутные термометры. Типичный аппарат для измерения температуры плавления с подогревом под микроскопом имеет камеру нагрева, содержащую металлическую пластину, на которой на предметном стекле помещается образец. В центре металлической пластины имеется отверстие, через которое проникает свет от осветительного зеркала микроскопа. Во время использования камера закрывается стеклянной пластиной, чтобы исключить попадание воздуха в зону отбора проб.

Нагрев образца регулируется реостатом. Для очень точных измерений оптически анизотропных веществ можно использовать поляризованный свет.

1.4.2.3. Метод мениска

Этот метод специально используется для полиамидов.

Температуру, при которой смещение мениска силиконового масла, заключенного между горячим столиком и покровным стеклом, поддерживаемым полиамидным испытуемым образцом, определяют визуально.

1.4.3. Метод определения температуры замерзания

Пробу помещают в специальную пробирку и помещают в аппарат для определения температуры замерзания. Во время охлаждения образец осторожно и непрерывно перемешивают, а температуру измеряют через соответствующие промежутки времени. Как только температура остается постоянной в течение нескольких показаний, эта температура (с поправкой на погрешность термометра) записывается как температура замерзания.

Переохлаждения следует избегать, поддерживая равновесие между твердой и жидкой фазами.

1.4.4. Термический анализ

1.4.4.1 Дифференциальный термический анализ (ДТА)

Этот метод фиксирует разницу температур между веществом и эталонным материалом в зависимости от температуры, при этом вещество и эталонный материал подвергаются одной и той же контролируемой температурной программе. Когда образец претерпевает переход, включающий изменение энтальпии, на это изменение указывает эндотермическое (плавление) или экзотермическое (замерзание) отклонение от базовой линии температурного рекорда.

1.4.4.2 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

Этот метод фиксирует разницу в энергозатратах на вещество и эталонный материал в зависимости от температуры, при этом вещество и эталонный материал подвергаются одной и той же контролируемой температурной программе. Эта энергия представляет собой энергию, необходимую для установления нулевой разницы температур между веществом и эталонным материалом. Когда образец претерпевает переход, включающий изменение энтальпии, на это изменение указывает эндотермическое (плавление) или экзотермическое (замерзание) отклонение от базовой линии записи теплового потока.

1.4.5. Для точки

Этот метод был разработан для использования с нефтяными маслами и пригоден для использования с маслянистыми веществами с низкими температурами плавления. После предварительного нагрева образец охлаждают с определенной скоростью и с интервалом в 3 К проверяют характеристики течения. Наименьшую температуру, при которой наблюдается движение вещества, фиксируют как температуру застывания.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Применимость и точность различных методов, используемых для определения температуры плавления/диапазона плавления, указаны в следующей таблице:

ТАБЛИЦА: ПРИМЕНИМОСТЬ МЕТОДОВ

>ТАБЛИЦА>

>ТАБЛИЦА>

>ТАБЛИЦА>

>ТАБЛИЦА>

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

Процедуры почти всех методов испытаний описаны в международных и национальных стандартах (см. Приложение 1).

1.6.1. Методы с капиллярной трубкой

При медленном повышении температуры мелкоизмельченные вещества обычно демонстрируют стадии плавления, показанные на рисунке 1.

Рисунок 1

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Стадия А (Начало плавления): мелкие капли равномерно прилипают к внутренней стенке капилляра.

Стадия Б: между образцом и внутренней стенкой появляется зазор из-за усадки расплава.

Стадия C: сморщенный образец начинает сжиматься вниз и разжижаться.

Стадия D: на поверхности формируется полный мениск, но значительное количество образца остается твердым.

Стадия Е (Окончательная стадия плавления): твердые частицы отсутствуют.

При определении температуры плавления регистрируют температуры в начале плавления и на заключительной стадии.

1.6.1.1. Устройства для измерения температуры плавления с аппаратом с жидкой ванной

На рис. 2 показан тип стандартизированного аппарата для измерения температуры плавления стекла (JIS K 0064); все характеристики указаны в миллиметрах.

фигура 2

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

А: Измерительный сосуд

Б: Пробка

С: Ветер

D: Термометр

E: Вспомогательный термометр

F: жидкость для ванны

G: Капиллярная трубка из стекла длиной от 80 до 100 мм, внутренним диаметром 1,0 ± 0,2 мм, толщиной стенки от 0,2 до 0,3 мм.

H: Боковая трубка

Жидкость для ванны: следует выбрать подходящую жидкость. Выбор жидкости зависит от определяемой температуры плавления, например: парафин жидкий для температуры плавления не выше 473 К, силиконовое масло для температуры плавления не выше 573 К.

При температурах плавления выше 523 К можно использовать смесь, состоящую из трех частей серной кислоты и двух частей сернокислого калия (в массовом соотношении). При использовании такой смеси следует принять соответствующие меры предосторожности.

Термометр: следует использовать только те термометры, которые соответствуют требованиям следующих или эквивалентных стандартов:

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K8001.

Процедура: Сухое вещество мелко измельчают в ступке и помещают в капиллярную трубку, сплавляя с одного конца так, чтобы после плотной упаковки уровень наполнения составлял примерно 3 мм. Для получения однородно упакованной пробы капиллярную трубку следует уронить с высоты примерно 700 мм через стеклянную трубку вертикально на часовое стекло.

Наполненный капилляр помещают в ванну так, чтобы средняя часть ртутной колбы термометра касалась капилляра в той части, где находится образец. Обычно капиллярную трубку вводят в аппарат примерно на 10 К ниже температуры плавления.

Жидкость в ванне нагревается так, что повышение температуры составляет примерно 3 К/мин. Жидкость следует размешать. При температуре примерно на 10 К ниже ожидаемой температуры плавления скорость повышения температуры доводится до максимума 1 К/мин.

Рассчитать: Расчет температуры плавления производится следующим образом:

Т = ТД + 0,00016 (ТД ТЕ)n

где:

T = скорректированная температура плавления в К.

TD = показание температуры термометра D в К.

TE = показание температуры термометра E в К.

n = количество делений ртутной нити на термометре D на выступающем стержне.

1.6.1.2. Устройства температуры плавления с металлическим блоком

Аппарат:

Он состоит из:

- цилиндрический металлический блок, верхняя часть которого полая и образует камеру (см. рисунок 3),

- металлическая заглушка с двумя или более отверстиями, позволяющая монтировать трубки в металлический блок,

- система нагрева металлического блока, обеспечиваемая, например, электрическим сопротивлением, заключенным в блок,

- реостат для регулирования потребляемой мощности, если используется электрический нагрев,

- четыре окна из термостойкого стекла на боковых стенках камеры, расположенные диаметрально

под прямым углом друг к другу. Перед одним из этих окон установлен окуляр для наблюдения за капиллярной трубкой. Остальные три окна используются для освещения внутренней части вольера с помощью ламп.

- капиллярная трубка из термостойкого стекла, закрытая с одного конца (см. 1.6.1.1).

Термометр:

См. стандарты, упомянутые в 1.6.1.1. Применимы также термоэлектрические измерительные устройства сопоставимой точности.

Рисунок 3

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

1.6.1.3. Обнаружение фотоэлементов

Аппарат и процедура:

Аппарат состоит из металлической камеры с автоматизированной системой нагрева. Три капиллярные трубки заполняются согласно 1.6.1.1 и помещаются в термостат.

Для калибровки устройства доступны несколько линейных повышений температуры, а подходящее повышение температуры регулируется электрически с заранее выбранной постоянной и линейной скоростью.

Регистраторы показывают фактическую температуру печи и температуру вещества в капиллярах.

1.6.2. Горячие сцены

1.6.2.1. Горячий батончик Кофлер См. Приложение.

1.6.2.2. Микроскоп расплава См. Приложение.

1.6.2.3. Метод мениска (полиамиды)

Смотри Приложение.

Скорость нагрева до температуры плавления должна быть менее 1 К/мин.

1.6.3. Методы определения температуры замерзания

Смотри Приложение.

1.6.4. Термический анализ

1.6.4.1. Дифференциальный термический анализ

Смотри Приложение.

1.6.4.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия

Смотри Приложение.

1.6.5. Определение температуры застывания

Смотри Приложение.

2. ДАННЫЕ

В некоторых случаях необходима поправка термометра.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемый метод,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси) и стадия предварительной очистки, если таковая имеется,

- оценка точности.

Среднее значение по крайней мере двух измерений, находящихся в диапазоне расчетной точности (см. таблицы), указывается как температура плавления.

Если разница между температурой начала и конечной стадии плавления находится в пределах точности метода, за температуру плавления принимают температуру конечной стадии плавления; в противном случае сообщаются две температуры.

Если вещество разлагается или сублимируется до достижения температуры плавления, необходимо указать температуру, при которой наблюдается эффект.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 102, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) ИЮПАК, Б. Ле Нейндр, Б. Водар, ред. Экспериментальная термодинамика, Баттервортс, Лондон, 1975, вып. II, 803–834.

(3) Изд. Р. Вайсбергера: Техника органической химии, Физические методы органической химии, 3-е изд., Interscience Publ., Нью-Йорк, 1959, том. I, часть I, глава VII.

(4) ИЮПАК, Физико-химические измерения: Каталог эталонных материалов национальных лабораторий, Чистая и прикладная химия, 1976, вып. 48, 505–515.

Приложение

Дополнительные технические подробности можно найти, например, в следующих стандартах.

1. Капиллярные методы

1.1. Устройства температуры плавления с жидкостной ванной

ASTM E 324-69 Стандартный метод испытаний относительных начальных и конечных температур плавления и диапазона плавления органических химикатов.

BS 4634 Метод определения температуры плавления и/или интервала плавления.

DIN 53181 Определение интервала плавления смол капиллярными методами.

JIS K 00-64 Методы определения температуры плавления химических продуктов.

1.2. Устройства температуры плавления с металлическим блоком

DIN 53736 Визуальное определение температуры плавления полукристаллических пластмасс.

ISO 1218 (E) Пластмассы. Полиамиды. Определение температуры плавления.

2. Горячие сцены

2.1. Кофлер горячий бар

ANSI/ASTM D 3451-76 Стандартные рекомендуемые методы испытаний полимерных порошковых покрытий.

2.2. Расплавленный микроскоп

DIN 53736 Визуальное определение температуры плавления полукристаллических пластмасс.

2.3. Метод мениска (полиамиды)

ISO 1218 (E) Пластмассы. Полиамиды. Определение температуры плавления.

ANSI/ASTM D 2133-66 Стандартные спецификации для материалов для литья под давлением и экструзии ацеталевой смолы.

НФ Т 51-050 Полиамидные смолы. Определение «точки плавления» методом мениска.

3. Методы определения температуры замерзания.

BS 4633 Метод определения точки кристаллизации.

BS 4695 Метод определения температуры плавления нефтяного воска (кривая охлаждения)

DIN 51421 Определение температуры замерзания авиационного топлива, бензина и автомобильных бензолов.

ISO 2207 Нефтяные воски: определение температуры схватывания.

DIN 53175 Определение точки затвердевания жирных кислот.

НФ Т 60-114 Температура плавления парафинов

НФ Т 20-051 Метод определения температуры кристаллизации (температуры замерзания)

ISO 1392 Метод определения точки замерзания.

4. Термический анализ

4.1. Дифференциальный термический анализ

ASTM E 537-76 Стандартный метод оценки термической стабильности химических веществ методами дифференциального термического анализа.

ASTM E 473-85 Стандартные определения терминов, относящихся к термическому анализу.

ASTM E 472-86 Стандартная практика представления термоаналитических данных.

DIN 51005 Термический анализ, термины

4.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия

ASTM E 537-76 Стандартный метод оценки термической стабильности химических веществ методами дифференциального термического анализа.

ASTM E 473-85 Стандартные определения терминов, относящихся к термическому анализу.

ASTM E 472-86 Стандартная практика представления термоаналитических данных.

DIN 51005 Термический анализ, термины

5. Определение температуры застывания

NBN 52014 Echantillonnage et Analysis des Products du Pétrole: Point de Trouble et Point d'écoulement Limite. Отбор проб и разложение нефтепродуктов: температура помутнения и температура застывания.

ASTM D 97-66 Стандартный метод определения температуры застывания нефтяных масел.

ISO 3016 Нефтяные масла. Определение температуры застывания.

А.2. ТЕМПЕРАТУРА КИПЕНИЯ

1. МЕТОД

Большинство описанных методов основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). Фундаментальные принципы приведены в ссылках (2) и (3).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Описанные здесь методы и устройства можно применять к жидким и легкоплавким веществам при условии, что они не вступают в химическую реакцию ниже температуры кипения (например:

автоокисление, перегруппировка, деградация и т. д.). Методы могут применяться к чистым и нечистым жидким веществам.

Особое внимание уделяется методам с использованием фотоэлементного обнаружения и термического анализа, поскольку эти методы позволяют определять температуру плавления, а также температуру кипения. Кроме того, измерения могут выполняться автоматически.

«Динамический метод» имеет то преимущество, что его также можно применять для определения давления паров, и нет необходимости корректировать температуру кипения до нормального давления (101 325 кПа), поскольку нормальное давление можно отрегулировать во время измерения с помощью маностат.

Примечания:

Влияние примесей на определение температуры кипения во многом зависит от природы примеси. Если в образце присутствуют летучие примеси, которые могут повлиять на результаты, вещество можно очистить.

1.2 ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Нормальная температура кипения определяется как температура, при которой давление паров жидкости составляет 101325 кПа.

Если температуру кипения не измерять при нормальном атмосферном давлении, то температурную зависимость давления пара можно описать уравнением Клаузиуса-Клапейрона:

log p = 2,3 RTD Hv + const.

где:

p = давление паров вещества в паскалях

Ä Hv = теплота парообразования в Дж моль 1

R = универсальная молярная газовая постоянная = 8,314 Дж моль 1 К 1

T = термодинамическая температура в К

Температура кипения указывается с учетом давления окружающей среды во время измерения.

Конверсии

Давление (единицы измерения: кПа)

100 кПа = 1 бар = 0,1 МПа

(«бар» по-прежнему допустим, но не рекомендуется)

133 Па = 1 мм рт. ст. = 1 Торр

(единицы «мм рт. ст.» и «Торр» не допускаются).

1 атм = стандартная атмосфера = 101 325 Па

(единица измерения «атм» не допускается).

Температура (единицы измерения: К)

т = Т 273,15

t: температура по Цельсию, градус Цельсия (C)

Т: термодинамическая температура, кельвин (К)

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества.

Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

Некоторые калибровочные вещества можно найти в методах, перечисленных в Приложении.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Пять методов определения температуры кипения (диапазона кипения) основаны на измерении температуры кипения, два других основаны на термическом анализе.

1.4.1. Определение с помощью эбуллиометра

Эбуллиометры изначально были разработаны для определения молекулярной массы по повышению температуры кипения, но они также подходят для точного измерения температуры кипения. Очень простое устройство описано в ASTM D 1120-72 (см. Приложение). Жидкость в этом аппарате нагревают в равновесных условиях при атмосферном давлении до кипения.

1.4.2. Динамический метод

Этот метод включает измерение температуры повторной конденсации пара с помощью соответствующего термометра в флегме во время кипения. В этом методе давление можно варьировать.

1.4.3. Метод перегонки по температуре кипения

Этот метод включает перегонку жидкости, измерение температуры переконденсации паров и определение количества дистиллята.

1.4.4. Метод по Сиволобову

Образец нагревается в пробирке, погруженной в жидкость на тепловой бане. В пробирку с образцом погружают расплавленный капилляр, содержащий в нижней части пузырь воздуха.

1.4.5. Обнаружение фотоэлементов

Следуя принципу Сиволобоффа, автоматические фотоэлектрические измерения производятся с использованием поднимающихся пузырьков.

1.4.6. Дифференциальный термический анализ

Этот метод фиксирует разницу температур между веществом и эталонным материалом в зависимости от температуры, при этом вещество и эталонный материал подвергаются одной и той же контролируемой температурной программе. Когда образец претерпевает переход, включающий изменение энтальпии, на это изменение указывает эндотермическое отклонение (кипение) от базовой линии температурного рекорда.

1.4.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия

Этот метод фиксирует разницу в энергозатратах на вещество и эталонный материал в зависимости от температуры, при этом вещество и эталонный материал подвергаются одной и той же контролируемой температурной программе. Эта энергия представляет собой энергию, необходимую для установления нулевой разницы температур между веществом и эталонным материалом. Когда образец претерпевает переход, включающий изменение энтальпии, на это изменение указывает эндотермическое отклонение (кипение) от базовой линии записи теплового потока.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Применимость и точность различных методов, используемых для определения температуры/диапазона кипения, указаны в таблице 1.

>ТАБЛИЦА>

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

Процедуры некоторых методов испытаний описаны в международных и национальных стандартах (см. Приложение).

1.6.1. Эбуллиометр

Смотри Приложение.

1.6.2. Динамический метод

См. метод испытаний А.4. для определения давления пара.

Регистрируют температуру кипения, наблюдаемую при приложенном давлении 101325 кПа.

1.6.3. Процесс дистилляции (диапазон кипения)

Смотри Приложение.

1.6.4. Метод по Сиволобову

Образец нагревают в аппарате для определения температуры плавления в трубке для образца диаметром около 5 мм (рисунок 1).

На рисунке 1 показан тип стандартизированного аппарата для определения температуры плавления и кипения (JIS K 0064) (из стекла, все характеристики указаны в миллиметрах).

Рисунок 1

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

А: Измерительный сосуд

Б: Пробка

С: Ветер

D: Термометр

E: Вспомогательный термометр

F: жидкость для ванны

G: Пробирка для проб, внешний диаметр максимум 5 мм; содержащий капиллярную трубку длиной примерно 100 мм, внутренним диаметром примерно 1 мм и толщиной стенки примерно 0,2–0,3 мм.

H: Боковая трубка

В пробирку для пробы помещают капиллярную трубку (кипящий капилляр), вплавленную примерно на 1 см выше нижнего конца. Уровень добавления испытуемого вещества таков, что расплавленный участок капилляра находится ниже поверхности жидкости. Пробирка с кипящим капилляром крепится либо к термометру резинкой, либо фиксируется подставкой сбоку (см. рис. 2).

фигура 2

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Принцип по Сиволобову

Рисунок 3

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Модифицированный принцип

Жидкость для ванны выбирается в зависимости от температуры кипения. При температуре до 573 К можно использовать силиконовое масло. Жидкий парафин можно использовать только при температуре до 473 К. Нагрев жидкости в ванне сначала следует отрегулировать так, чтобы повышение температуры составляло 3 К/мин. Жидкость для ванны необходимо перемешивать. При температуре примерно на 10 К ниже ожидаемой температуры кипения нагрев снижается так, что скорость повышения температуры составляет менее 1 К/мин. При приближении к температуре кипения из кипящего капилляра начинают быстро выходить пузырьки.

Температура кипения — это температура, при которой при кратковременном охлаждении череда пузырьков прекращается и жидкость внезапно начинает подниматься в капилляре. Соответствующее показание термометра является температурой кипения вещества.

В модифицированном принципе (рисунок 3) температура кипения определяется в капилляре температуры плавления. Его растягивают до тонкой точки длиной около 2 см (а) и всасывают небольшое количество образца. Открытый конец тонкого капилляра закрывается плавлением, так что на конце располагается небольшой пузырь воздуха. При нагревании в плавильном аппарате (б) пузырек воздуха расширяется. Температура кипения соответствует температуре, при которой пробка вещества достигает уровня поверхности жидкости ванны (в).

1.6.5. Обнаружение фотоэлементов

Образец нагревается в капиллярной трубке внутри нагретого металлического блока.

Луч света направляется через соответствующие отверстия в блоке через вещество на точно калиброванный фотоэлемент.

При повышении температуры образца из кипящего капилляра выходят одиночные пузырьки воздуха. При достижении температуры кипения количество пузырьков значительно увеличивается. Это вызывает изменение интенсивности света, регистрируемое фотоэлементом, и подает сигнал остановки индикатору, считывающему температуру платинового термометра сопротивления, расположенного в блоке.

Этот метод особенно полезен, поскольку позволяет проводить определения при температуре ниже комнатной, вплоть до 253,15 К (20 С) без каких-либо изменений в аппаратуре. Прибор необходимо просто поместить в охлаждающую ванну.

1.6.6. Термический анализ

1.6.6.1. Дифференциальный термический анализ

Смотри Приложение.

1.6.6.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия

Смотри Приложение.

2. ДАННЫЕ

При небольших отклонениях давления от нормального (макс. ±5 кПа) температуры кипения нормализуются.

к Tn с помощью следующего численного уравнения Сидни Янга:

Тн = Т + (fT × D p)

где:

Ä p = (101,325 p) [знак примечания]

p = измерение давления в кПа

fT = скорость изменения температуры кипения в зависимости от давления, К/кПа.

T = измеренная температура кипения в К

Tn = температура кипения, приведенная к нормальному давлению в К.

Температурно-поправочные коэффициенты fT и уравнения для их аппроксимации включены в упомянутые выше международные и национальные стандарты для многих веществ.

Например, в методе DIN 53171 упоминаются следующие приблизительные поправки на растворители, входящие в состав красок:

>ТАБЛИЦА>

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемый метод,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси) и стадия предварительной очистки, если таковая имеется,

- оценка точности.

Среднее значение по крайней мере двух измерений, находящихся в диапазоне расчетной точности (см. таблицу 1), указывается как температура кипения.

Должны быть указаны измеренные температуры кипения и их среднее значение, а давление(я), при которых проводились измерения, должно быть указано в кПа. Давление предпочтительно должно быть близко к нормальному атмосферному давлению.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 103, Решение Совета C (81) 30 окончательное.

(2) ИЮПАК, Б. Ле Нейндр, Б. Водар, издания. Экспериментальная термодинамика, Баттервортс, Лондон.

1975, том II.

(3) Издание Р. Вайсбергера: Техника органической химии, Физические методы органической химии,

Третье издание, Interscience Publications, Нью-Йорк, 1959, том I, часть I, глава VIII.

Приложение

Дополнительные технические подробности можно найти, например, в следующих стандартах:

1. Эбуллиометр

ASTM D 1120-72 Стандартный метод определения температуры кипения антифризов двигателя.

2. Процесс дистилляции (диапазон кипения)

ISO/R 918 Метод испытаний при перегонке (выход при перегонке и диапазон перегонки)

BS 4349/68 Метод определения дистилляции нефтепродуктов.

BS 4591/71 Метод определения характеристик дистилляции.

DIN 53171 Растворители для красок, определение кривой кипения.

НФ Т 20-608 Перегонка: определение выхода и интервала перегонки

3. Дифференциальный термический анализ и дифференциальная сканирующая калориметрия.

ASTM E 537-76 Стандартный метод оценки термической стабильности химических веществ методами

дифференциальный термический анализ

ASTM E 473-85 Стандартные определения терминов, относящихся к термическому анализу.

ASTM E 472-86 Стандартная практика представления термоаналитических данных.

DIN 51005 Термический анализ: термины

А.3 ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОТНОСТЬ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). Фундаментальные принципы приведены в ссылке (2).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Описанные методы определения относительной плотности применимы к твердым и жидким веществам без каких-либо ограничений по степени их чистоты. Различные методы, которые следует использовать, перечислены в таблице 1.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Относительная плотность D420 твердых веществ или жидкостей представляет собой соотношение между массой объема исследуемого вещества, определенной при 20°С, и массой того же объема воды, определенной при 4°С. Относительная плотность не имеет значения. измерение.

Плотность вещества ñ равна частному массы m к его объему v.

Плотность ñ указывается в единицах СИ, кг/м3.

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА Эталонные вещества не обязательно должны использоваться во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Используются четыре класса методов.

1.4.1. Методы плавучести

1.4.1.1. Ареометр (для жидких веществ)

Достаточно точные и быстрые определения плотности можно получить с помощью поплавковых ареометров, которые позволяют определять плотность жидкости по глубине погружения по градуированной шкале.

1.4.1.2. Гидростатический баланс (для жидких и твердых веществ)

Разницу между массой испытуемого образца, измеренной на воздухе и в подходящей жидкости (например, воде), можно использовать для определения его плотности.

Для твердых веществ измеренная плотность является репрезентативной только для конкретного используемого образца. Для определения плотности жидкостей тело известного объема v взвешивают сначала на воздухе, а затем в жидкости.

1.4.1.3. Метод погруженного тела (для жидких веществ). В этом методе плотность жидкости определяют по разнице результатов взвешивания жидкости до и после погружения тела известного объема в исследуемую жидкость.

1.4.2. Пикнометрические методы

Для твердых веществ и жидкостей можно использовать пикнометры различной формы и известных объемов. Плотность рассчитывают по разнице веса полного и пустого пикнометра и его известного объема.

1.4.3. Пикнометр сравнения воздуха (для твердых веществ)

Плотность твердого тела в любой форме можно измерить при комнатной температуре с помощью пикнометра сравнения газов. Объем вещества измеряют на воздухе или в инертном газе в баллоне переменного калиброванного объема. Для расчета плотности проводится одно измерение массы после завершения измерения объема.

1.4.4. Осциллирующий плотномер (5) (6) (7)

Плотность жидкости можно измерить осциллирующим плотномером. Механический генератор, выполненный в виде U-образной трубки, вибрирует на резонансной частоте генератора, зависящей от его массы. Введение образца изменяет резонансную частоту генератора. Прибор необходимо калибровать по двум жидким веществам известной плотности. Эти вещества предпочтительно следует выбирать таким образом, чтобы их плотности находились в измеряемом диапазоне.

1,5. Применимость различных методов, используемых для определения относительной плотности, указана в таблице.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

Стандарты, приведенные в качестве примеров, с которыми можно ознакомиться для получения дополнительных технических подробностей, приведены в Приложении.

Испытания должны проводиться при температуре 20°С и выполняться как минимум два измерения.

2. ДАННЫЕ

См. стандарты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемый метод,

- точная характеристика вещества (идентичность и примеси) и стадия предварительной очистки, если таковая имеется.

Относительную плотность D420 следует указывать, как определено в 1.2, вместе с физическим состоянием измеряемого вещества.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

>ТАБЛИЦА>

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 109, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) Под ред. Р. Вайсбергера, Техника органической химии, Физические методы органической химии, 3-е изд., Глава IV, Interscience Publ., Нью-Йорк, 1959, том. Я, Часть 1.

(3) ИЮПАК, Рекомендуемые эталонные материалы для реализации физико-химических свойств, Чистая и прикладная химия, 1976, вып. 48, 508.

(4) Вагенбрет, Х., Дайвинг-шар для определения плотности жидкостей, Technisches Messen tm, 1979, том 11, 427-430.

(5) Леопольд Х. Цифровое измерение жидкостей. Электроника. 1970. Вып. 19, 297–302.

(6) Баумгартен Д., Контроль количества расфасованных продуктов. Методы определения плотности жидких продуктов и их практическое применение. Фармацевтическая промышленность, 1975, том. 37, 717 – 726.

(7) Риман Дж. Использование цифрового измерения плотности в лаборатории пивоваренного завода. Brewing Science, 1976, vol. 9, 253–255.

Приложение

Дополнительные технические подробности можно найти, например, в следующих стандартах:

1. МЕТОДЫ ПЛАВУЧИМОСТИ

1.1. Ареометр

DIN 12790, ISO 387 Ареометр; основные инструкции

DIN 12791 Часть I: Ареометры плотности; конструкция, регулировка и использование

Часть II: Плотномеры; стандартизированные размеры, обозначение

Часть III: Использование и тестирование

ISO 649-2 Лабораторная посуда: Ареометры плотности общего назначения.

НФ Т 20-050 Химическая продукция промышленного назначения. Определение плотности жидкостей. Ареометрический метод

DIN 12793 Посуда лабораторная стеклянная: ареометры для определения диапазона.

1.2. Гидростатический баланс

Для твердых веществ

ISO 1183 Метод А. Методы определения плотности и относительной плотности пластмасс, за исключением пористых пластиков.

НФ Т 20-049 Химические продукты промышленного назначения. Определение плотности твердых веществ, кроме порошков и ячеистых продуктов. Метод гидростатического баланса.

ASTM-D-792 Удельный вес и плотность пластмасс по вытеснению

DIN 53479 Испытания пластмасс и эластомеров; определение плотности

Для жидких веществ

ИСО 901 ИСО 758

DIN 51757 Испытание минеральных масел и родственных материалов; определение плотности

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 и ASTM D 1481-62.

ASTM D 1298 Плотность, удельный вес или плотность API сырой нефти и жидких нефтепродуктов методом ареометра.

BS 4714 Плотность, удельный вес или плотность API сырой нефти и жидких нефтепродуктов методом ареометра.

1.3. Метод погруженного тела

DIN 53217 Испытание красок, лаков и аналогичных покрывающих материалов; определение плотности; метод погруженного тела

2. МЕТОДЫ ПИКНОМЕТРА.

2.1. Для жидких веществ

ISO 3507 Пикнометры

ISO 758 Жидкие химические продукты; определение плотности при 20 С

DIN 12797 Пикнометр Гей-Люссака (для нелетучих и не слишком вязких жидкостей)

DIN 12798 Пикнометр Липкина (для жидкостей с кинематической вязкостью менее 100 7 10 6 м2 с 1 при 15 С)

Пикнометр Шпренгеля DIN 12800 (для жидкостей по DIN 12798)

DIN 12801 Пикнометр Райшауэра (для жидкостей с кинематической вязкостью менее 100 7 10 6 м2 с 1 при 20 C, применим, в частности, также к углеводородам и водным растворам, а также к жидкостям с более высоким давлением паров, примерно 1 бар при 90 C) )

DIN 12806 Пикнометр Хаббарда (для вязких жидкостей всех типов, не имеющих слишком высокого давления пара, в частности, для красок, лаков и битума)

Пикнометр Бингама DIN 12807 (для жидкостей согласно DIN 12801)

Пикнометр Жольмеса DIN 12808 (особенно для смеси этанол-вода)

DIN 12809 Пикнометр с притертым термометром и капиллярной трубкой (для не слишком вязких жидкостей)

DIN 53217 Испытание красок, лаков и аналогичных продуктов; определение плотности пикнометром

DIN 51757, пункт 7: Испытание минеральных масел и родственных материалов; определение плотности

ASTM D 297 Раздел 15: Резиновые изделия – химический анализ

ASTM D 2111 Метод C: Галогенированные органические соединения.

BS 4699 Метод определения удельного веса и плотности нефтепродуктов (метод градуированного бикапиллярного пикнометра)

BS 5903 Метод определения относительной плотности и плотности нефтепродуктов методом капиллярно-пробкового пикнометра

НФ Т 20-053 Продукция химическая промышленного назначения. Определение плотности твердых веществ в порошках и жидкостях. Пикнометрический метод.

2.2. Для твердых веществ

ISO 1183 Метод B: Методы определения плотности и относительной плотности пластмасс, за исключением пористых пластиков.

НФ Т 20-053 Продукция химическая промышленного назначения. Определение плотности твердых веществ в порошках и жидкостях. Пикнометрический метод.

DIN 19683 Определение плотности грунтов

3. ПИКНОМЕТР ДЛЯ СРАВНЕНИЯ ВОЗДУХА.

DIN 55990 Часть 3: Испытания красок и аналогичных материалов для покрытий; порошковая краска;

Определение плотности

DIN 53243 Краски; хлорсодержащие полимеры; Тест

А.4. ДАВЛЕНИЕ ГАЗА

1. МЕТОД

Большинство описанных методов основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). Фундаментальные принципы приведены в ссылках (2) и (3).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Для проведения этого испытания полезно иметь предварительную информацию о структуре, температуре плавления и температуре кипения вещества.

Не существует единой процедуры измерения, применимой для всего диапазона давлений пара.

Поэтому для измерения давления пара рекомендуется использовать несколько методов из ПОЛОЖЕНИЯ ТАБЛИЦЫ>.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

1.6.1. Динамическое измерение

1.6.1.1. Аппарат

Измерительный аппарат обычно состоит из кипящего сосуда с прикрепленным к нему охладителем из стекла или металла (рисунок 1), оборудования для измерения температуры и оборудования для регулирования и измерения давления. Типовой измерительный прибор, показанный на рисунке, изготовлен из термостойкого стекла и состоит из пяти частей:

Большая труба с частично двойными стенками состоит из заземляющей рубашки, охладителя, охлаждающего сосуда и впускного отверстия.

Стеклянный цилиндр с «насосом» Коттрелла установлен в секции кипения трубки и имеет шероховатую поверхность из измельченного стекла, чтобы избежать «ударов» в процессе кипячения.

Температуру измеряют с помощью подходящего датчика температуры (например, термометра сопротивления, термопары в рубашке), погруженного в прибор до точки измерения (№ 5, рис. 1) через подходящее входное отверстие (например, охватываемое заземляющее соединение).

Выполнены необходимые подключения к регулятору давления и измерительному оборудованию.

Колба, выполняющая роль буферного объема, соединена с измерительным прибором посредством капиллярной трубки.

Сосуд для кипячения нагревается нагревательным элементом (например, патронным нагревателем), вставленным в стеклянный аппарат снизу. Требуемый ток нагрева устанавливается и регулируется с помощью термопары.

Необходимый вакуум от 102 Па до примерно 105 Па создается с помощью вакуумного насоса.

Подходящий клапан используется для дозирования воздуха или азота для регулирования давления (диапазон измерения примерно от 102 до 105 Па) и вентиляции.

Давление измеряется манометром.

1.6.1.2. Процедура измерения

Давление паров измеряется путем определения температуры кипения образца при различных заданных давлениях примерно от 103 до 105 Па. Устойчивая температура при постоянном давлении указывает на то, что температура кипения достигнута. Пенящиеся вещества не могут быть измерены этим методом.

Вещество помещают в чистый сухой сосуд для проб. Проблемы могут возникнуть с твердыми веществами, не являющимися порошкообразными, но иногда их можно решить путем нагрева охлаждающей рубашки. После заполнения сосуда аппарат герметизируют на фланце и вещество дегазируют. Затем устанавливается самое низкое желаемое давление и включается нагрев. При этом датчик температуры подключается к самописцу.

Равновесие достигается, когда фиксируется постоянная температура кипения при постоянном давлении.

Особую осторожность необходимо соблюдать, чтобы избежать ударов во время кипячения. Кроме того, на охладителе должна образоваться полная конденсация. При определении давления паров легкоплавких твердых веществ следует соблюдать осторожность, чтобы избежать блокировки конденсатора.

После фиксации этой точки равновесия устанавливается более высокое давление. Процесс продолжается таким образом до тех пор, пока не будет достигнуто значение 105 Па (всего примерно от 5 до 10 точек измерения). В качестве проверки необходимо повторить точки равновесия при уменьшении давления.

1.6.2. Статическое измерение

1.6.2.1. Аппарат

Аппарат включает в себя контейнер для пробы, систему нагрева и охлаждения для регулирования температуры пробы и измерения температуры. В состав аппарата также входят приборы для установки и измерения давления. Рисунки 2a и 2b иллюстрируют основные принципы.

Камера для проб (рис. 2а) ограничена с одной стороны подходящим клапаном высокого вакуума. К другой стороне прикреплена U-образная трубка, содержащая подходящую манометрическую жидкость. Один конец U-образной трубки отходит к вакуумному насосу, баллону с азотом или вентиляционному клапану и манометру.

Вместо U-образной трубки можно использовать манометр с индикатором давления (рисунок 2б).

Для регулирования температуры образца сосуд для образца вместе с клапаном и U-образной трубкой или манометром помещают в ванну, в которой поддерживается постоянная температура ± 0,2 К. Измерения температуры проводятся снаружи. стенке сосуда, содержащего образец, или в самом сосуде.

Для вакуумирования аппарата используется вакуумный насос с охлаждающей ловушкой на входе.

В методе 2а давление пара вещества измеряется косвенно с помощью нулевого индикатора. При этом учитывается тот факт, что плотность жидкости в U-образной трубке меняется при сильном изменении температуры.

В качестве нулевых индикаторов для U-образной трубки в зависимости от диапазона давлений и химического поведения испытуемого вещества подходят следующие жидкости: силиконовые жидкости, фталаты. Тестируемое вещество не должно заметно растворяться в жидкости U-образной трубки или вступать в реакцию с ней.

В качестве манометра можно использовать ртуть в диапазоне нормального давления воздуха до 102 Па, тогда как силиконовые жидкости и фталаты пригодны для использования при давлениях от 102 Па до 10 Па. Манометры с нагреваемой мембраной можно использовать даже при давлении ниже 10 1 Па. Существуют также другие манометры, которые можно использовать при давлении ниже 102 Па.

1.6.2.2. Процедура измерения

Перед измерением все компоненты аппарата, показанные на рисунке 2, должны быть тщательно очищены и высушены.

Для метода 2а заполните U-образную трубку выбранной жидкостью, которую необходимо дегазировать при повышенной температуре перед снятием показаний.

Испытуемое вещество помещают в аппарат, который затем закрывают и температуру снижают в достаточной степени для дегазации. Температура должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить отсасывание воздуха, но в случае многокомпонентной системы она не должна изменять состав материала. При необходимости равновесие можно установить быстрее путем перемешивания.

Образец можно переохладить, например, жидкий азот (следя за тем, чтобы избежать конденсации воздуха или насосной жидкости) или смесь этанола и сухого льда. Для низкотемпературных измерений используйте ванну с регулируемой температурой, подключенную к ультракриомату.

При открытом клапане над сосудом для пробы в течение нескольких минут применяется отсасывание для удаления воздуха. Затем клапан закрывается и температура образца снижается до минимально необходимого уровня. При необходимости операцию дегазации необходимо повторить несколько раз.

При нагревании образца давление пара увеличивается. Это изменяет равновесие жидкости в U-образной трубке. Чтобы компенсировать это, в аппарат через клапан подается азот или воздух до тех пор, пока индикатор давления жидкости снова не станет равным нулю. Требуемое для этого давление можно определить с помощью прецизионного манометра при комнатной температуре. Это давление соответствует давлению паров вещества при данной конкретной температуре измерения.

Метод 2b аналогичен, но давление пара измеряется напрямую.

Температурную зависимость давления пара определяют через достаточно малые интервалы времени (всего примерно от 5 до 10 точек измерения) до желаемого максимума. Показания низкой температуры необходимо повторить для проверки.

Если значения, полученные при повторных показаниях, не совпадают с кривой, полученной при повышении температуры, это может быть связано с одной из следующих причин:

1. Проба все еще содержит воздух (например, высоковязкие материалы) или низкокипящие вещества, которые выделяются при нагревании и могут быть удалены отсасыванием после дальнейшего переохлаждения.

2. Температура охлаждения недостаточно низкая. В качестве хладагента в этом случае используется жидкий азот.

Если имеет место 1 или 2, измерения необходимо повторить.

3. Вещество подвергается химической реакции в исследуемом диапазоне температур (например, разложение, полимеризация).

1.6.3. изотенископ

Полное описание этого метода можно найти в ссылке 7. Принцип действия измерительного устройства показан на рисунке 3. Подобно статическому методу, описанному в 1.6.2, изотенископ подходит для исследования твердых тел и жидкостей.

В случае жидкостей жидкостью во вспомогательном манометре служит само вещество. В изотенископ вводят количество жидкости, достаточное для заполнения колбы и короткой ножки секции манометра. Изотенископ подсоединяется к вакуумной системе, вакуумируется, а затем заполняется азотом. Вакуумирование и продувка системы повторяются дважды для удаления остаточного кислорода. Заполненный изотенископ помещают в горизонтальное положение так, чтобы образец растекался тонким слоем в колбе для образца и секции манометра (U-образная часть). Давление в системе снижают до 133 Па и пробу осторожно нагревают до кипения (удаление растворенных фиксированных газов). Затем изотенископ помещают так, чтобы образец вернулся в колбу и короткую ножку манометра, так что оба они полностью заполнены жидкостью. Давление поддерживают как при дегазации; вытянутый кончик колбы для пробы нагревается небольшим пламенем до тех пор, пока выделившийся пар пробы не расширится настолько, чтобы вытеснить часть пробы из верхней части колбы и рычага манометра в манометрическую секцию изотенископа, создавая заполненную паром камеру. , безазотное пространство.

Затем изотенископ помещают в баню с постоянной температурой и доводят давление азота до тех пор, пока его давление не станет равным давлению образца. Баланс давления определяется манометрической частью изотенископа. В равновесии давление пара азота равно давлению пара вещества.

В случае твердых веществ в зависимости от диапазона давлений и температур применяют манометрические жидкости, перечисленные в 1.6.2.1. Дегазированная манометрическая жидкость заливается в выпуклость на длинном плече изотенископа. Затем исследуемое твердое вещество помещают в колбу и дегазируют при повышенной температуре. После этого изотенископ наклоняют так, чтобы манометрическая жидкость могла течь в U-образную трубку. Измерение давления пара в зависимости от температуры проводят по 1.6.2.

1.6.4. Метод выпота: баланс давления пара

1.6.4.1. Аппарат

В литературе описаны различные варианты установки (1). Описанное здесь устройство иллюстрирует общий принцип работы (рис. 4). На рис. 4 показаны основные компоненты аппарата, включающие высоковакуумную емкость из нержавеющей стали или стекла, оборудование для создания и измерения вакуума и встроенные компоненты для измерения давления пара на весах. В состав устройства входят следующие встроенные компоненты:

- печь-испаритель с фланцевым и поворотным входом. Испарительная печь представляет собой цилиндрический сосуд, изготовленный, например, из медь или химически стойкий сплав с хорошей теплопроводностью. Можно также использовать стеклянный сосуд с медной стенкой. Печь имеет диаметр примерно от 3 до 5 см и высоту от 2 до 5 см. Для потока пара имеется от одного до трех отверстий разного размера. Печь нагревается либо нагревательной пластиной внизу, либо нагревательной спиралью снаружи. Для предотвращения рассеивания тепла на опорную плиту нагреватель крепят к опорной плите с помощью металла с низкой теплопроводностью (никель-серебряной или хромо-никелевой стали), напр. никель-серебряная трубка, прикрепленная к поворотному входному отверстию, если используется печь с несколькими отверстиями. Такое расположение имеет то преимущество, что позволяет вставить медный стержень. Это позволяет охлаждать снаружи с помощью охлаждающей ванны,

- если крышка медной печи имеет три отверстия разного диаметра под углом 90° друг к другу, можно охватить различные диапазоны давления пара в пределах общего диапазона измерения (отверстия диаметром примерно от 0,30 до 4,50 мм). Большие отверстия используются для низкого давления пара и наоборот. Вращая печь, можно установить желаемое отверстие или промежуточное положение в потоке пара (отверстие печи - экран - чаша весов), и поток молекул высвобождается или отклоняется через отверстие печи на чашу весов. Для измерения температуры вещества в подходящую точку помещают термопару или термометр сопротивления.

- над экраном находится чашка весов, принадлежащая высокочувствительным микровесам (см. ниже). Диаметр чаши весов составляет около 30 мм. Позолоченный алюминий является подходящим материалом,

- чаша весов окружена цилиндрическим латунным или медным холодильным боксом. В зависимости от типа весов он имеет отверстия для балансира и защитное отверстие для потока молекул и должен гарантировать полную конденсацию пара на чаше весов. Обеспечивается отвод тепла наружу, например. медной планкой, соединенной с холодильной камерой. Шина пропускается через опорную плиту и теплоизолируется от нее, например, с трубкой из хромоникелевой стали. Стержень погружают в колбу Дьюара, содержащую жидкий азот под пластиной основания, или жидкий азот циркулирует через стержень. Таким образом, в холодильной камере поддерживается температура примерно 120 C. Чашка весов охлаждается исключительно за счет излучения и является удовлетворительной для исследуемого диапазона давлений (охлаждение примерно за 1 час до начала измерения).

- весы расположены над холодильным боксом. Подходящими балансами являются, например, высокочувствительные электронные микровесы с двумя плечами (8) или высокочувствительный прибор с подвижной катушкой (см. Руководство для испытаний ОЭСР 104, издание 12.05.81),

- на опорной плите также имеются электрические соединения для термопар (или термометров сопротивления) и нагревательных спиралей,

- в сосуде создают вакуум с помощью насоса частичного вакуума или насоса высокого вакуума (необходимый вакуум примерно от 1 до 2 7 10 3 Па, получаемый после 2 ч откачки). Давление регулируется подходящим ионизационным манометром.

1.6.4.2. Процедура измерения

Сосуд наполняют испытуемым веществом и закрывают крышкой. Щит и холодильный шкаф скользят по печи. Аппарат закрывается и включаются вакуумные насосы. Конечное давление перед началом проведения измерений должно составлять примерно 10 4 Па. Охлаждение холодильного бокса начинается с 10 2 Па.

После достижения необходимого вакуума начните серию калибровок при самой низкой требуемой температуре. В крышке устанавливается соответствующее отверстие, струя пара проходит через экран непосредственно над отверстием и попадает на охлаждаемую чашу весов. Чаша весов должна быть достаточно большой, чтобы обеспечить попадание на нее всей струи, проходящей через щит. Импульс потока пара действует как сила, воздействующая на чашку весов, и молекулы конденсируются на ее холодной поверхности.

Импульс и одновременная конденсация создают сигнал на записывающем устройстве. Оценка сигналов предоставляет две части информации:

1. В описанном здесь аппарате давление пара определяется непосредственно по импульсу на чашке весов (для этого не обязательно знать молекулярную массу (2)). При оценке показаний необходимо учитывать геометрические факторы, такие как отверстие печи и угол молекулярного потока.

2. Одновременно можно измерить массу конденсата и на основании этого рассчитать скорость испарения. Давление пара также можно рассчитать по скорости испарения и молекулярной массе, используя уравнение Герца (2).

р = G2 р RT × 103M

где

G = скорость испарения (кг с 1 м 2 )

M = молярная масса (г моль 1)

Т = температура (К)

R = универсальная молярная газовая постоянная (Дж моль 1 К 1)

p = давление пара (Па)

После достижения необходимого вакуума серию измерений начинают при самой низкой желаемой температуре измерения. Для дальнейших измерений температуру повышают небольшими интервалами до достижения максимального желаемого значения температуры. Затем образец снова охлаждают и можно записать вторую кривую давления пара. Если второй прогон не подтвердил результаты первого прогона, то возможно, что вещество разлагается в измеряемом диапазоне температур.

1.6.5. Выпотной метод – путем потери веса

1.6.5.1. Аппарат

Эффузионный аппарат состоит из следующих основных частей:

- резервуар, который можно термостатировать и вакуумировать и в котором расположены выпотные клетки,

- насос высокого вакуума (например, диффузионный насос или турбомолекулярный насос) с вакуумметром,

- ловушка, использующая сжиженный азот или сухой лед.

Например, на рисунке 5 показан алюминиевый вакуумный резервуар с электрическим подогревом и четырьмя эффузионными ячейками из нержавеющей стали. Фольга из нержавеющей стали толщиной около 0,3 мм имеет выпотное отверстие диаметром от 0,2 до 1,0 мм и крепится к выпотной ячейке с помощью крышки с резьбой.

1.6.5.2. Процедура измерения

В каждую эффузионную ячейку засыпают эталонное и испытуемое вещество, металлическую диафрагму с отверстием фиксируют крышкой с резьбой, и каждую ячейку взвешивают с точностью до 0,1 мг. Ячейку помещают в термостатируемый аппарат, из которого затем откачивают давление до уровня ниже одной десятой ожидаемого. Через определенные промежутки времени от 5 до 30 часов в аппарат впускают воздух и путем повторного взвешивания определяют потерю массы выпотной клетки.

Чтобы гарантировать, что летучие примеси не влияют на результаты, ячейку повторно взвешивают через определенные интервалы времени, чтобы проверить, что скорость испарения постоянна в течение как минимум двух таких интервалов времени.

Давление пара p в эффузионной ячейке определяется выражением:

р =mKAtE2pRTM

где

p = давление пара (Па)

m = масса вещества, покидающего клетку за время t (кг)

t = время (с)

A = площадь отверстия (м2)

K = поправочный коэффициент

R = универсальная газовая постоянная (Дж моль 1 К 1)

Т = температура (К)

M = молекулярная масса (кг моль 1)

Поправочный коэффициент K зависит от отношения длины к радиусу цилиндрического отверстия:

соотношение:0,10,20,61,02,0

К:0,9520,9090,7710,6720,514

Приведенное выше уравнение можно записать:

р = ЭмтТМ

где

= E1KA2pR и – константа выпотной клетки.

Константу выпотной ячейки E можно определить с помощью эталонных веществ (2,9), используя следующее уравнение:

Е =p(r)tmM(r)T

где

p(r) = давление паров эталонного вещества (Па)

M(r) = молекулярная масса эталонного вещества (кг.моль 1)

1.6.6. Метод газонасыщения

1.6.6.1. Аппарат

Типичное устройство, используемое для проведения этого испытания, состоит из ряда компонентов, представленных на рисунке 6а и описанных ниже (1).

Инертный газ:

Газ-носитель не должен вступать в химическую реакцию с испытуемым веществом. Для этой цели обычно достаточно азота, но иногда могут потребоваться и другие газы (10). Используемый газ должен быть сухим (см. рисунок 6а, позиция 4: датчик относительной влажности).

Управление потоком:

Для обеспечения постоянного и заданного потока через колонну сатуратора необходима соответствующая система газового контроля.

Уловители для сбора пара:

Они зависят от конкретных характеристик пробы и выбранного метода анализа. Пар должен улавливаться количественно и в такой форме, которая позволяет проводить последующий анализ. Для некоторых тестируемых веществ подходят ловушки, содержащие жидкости, такие как гексан или этиленгликоль. Для других могут быть применимы твердые поглотители.

В качестве альтернативы улавливанию паров и последующему анализу для количественного определения количества материала, транспортируемого известным количеством газа-носителя, можно использовать внутрипоездные аналитические методы, такие как хроматография. Кроме того, можно измерить потерю массы образца.

Теплообменник:

Для измерений при различных температурах может потребоваться включение в комплект теплообменника.

Колонна сатуратора:

Испытуемое вещество наносят из раствора на подходящий инертный носитель. Носитель с покрытием упаковывают в колонну-сатуратор, размеры которой и скорость потока должны быть такими, чтобы обеспечить полное насыщение газа-носителя. Колонна сатуратора должна быть термостатирована. При измерениях при температуре выше комнатной область между колонной насыщения и ловушками должна быть нагрета, чтобы предотвратить конденсацию испытуемого вещества.

Чтобы снизить массоперенос, происходящий за счет диффузии, после колонны сатуратора можно поместить капилляр (рисунок 6б).

1.6.6.2. Процедура измерения

Подготовка колонны-сатуратора:

К подходящему количеству носителя добавляют раствор испытуемого вещества в легколетучем растворителе. Следует добавить достаточное количество тестируемого вещества для поддержания насыщения на протяжении всего испытания. Растворитель полностью испаряется на воздухе или в ротационном испарителе, а тщательно перемешанный материал добавляется в сатураторную колонну. После термостатирования образца через аппарат пропускают сухой азот.

Измерение:

Уловители или встроенный в линию детектор подключаются к линии вывода жидкости из колонны и регистрируется время. Скорость потока проверяют в начале и через регулярные промежутки времени в ходе эксперимента с помощью пузырькового расходомера (или постоянно с помощью массового расходомера).

Необходимо измерить давление на выходе из сатуратора. Это можно сделать либо:

(а) путем установки манометра между сатуратором и ловушками (это может быть неудовлетворительно, поскольку при этом увеличивается мертвое пространство и адсорбционная поверхность); или

(б) путем определения падения давления в конкретной системе улавливания, используемой в качестве функции скорости потока в отдельном эксперименте (это может быть не очень удовлетворительно для жидкостных ловушек).

Время, необходимое для сбора количества тестируемого вещества, необходимого для различных методов анализа, определяется предварительным или расчетным путем. В качестве альтернативы сбору вещества для дальнейшего анализа можно использовать встроенный метод количественного анализа (например, хроматографию). Перед расчетом давления пара при заданной температуре необходимо провести предварительные прогоны для определения максимальной скорости потока, при которой газ-носитель полностью насытится парами вещества. Это гарантируется, если газ-носитель проходит через сатуратор достаточно медленно, так что более низкая скорость не приводит к увеличению расчетного давления пара.

Конкретный аналитический метод будет определяться природой испытуемого вещества (например, газовая хроматография или гравиметрия).

Определяется количество вещества, переносимое известным объемом газа-носителя.

1.6.6.3. Расчет давления пара

Давление пара рассчитывается на основе плотности пара W/V по уравнению:

p =WV×RTM

где:

p = давление пара (Па)

W = масса испарившегося испытуемого вещества (г)

V = объем насыщенного газа (м3)

R = универсальная молярная газовая постоянная (Дж моль 1 К 1)

Т = температура (К)

M = молярная масса испытуемого вещества (г моль 1)

Измеренные объемы необходимо корректировать с учетом разницы давления и температуры между расходомером и термостатируемым сатуратором. Если расходомер расположен после пароуловителя, могут потребоваться поправки для учета любых испаряющихся ингредиентов ловушки (1).

1.6.7. Вращающийся ротор (8, 11, 13)

1.6.7.1. Аппарат

Методика с вращающимся ротором может быть реализована с использованием датчика вязкости с вращающимся ротором, как показано на рисунке 8. Схематическое изображение экспериментальной установки показано на рисунке 7.

Измерительный аппарат обычно состоит из измерительной головки с вращающимся ротором, помещенной в термостатируемый корпус (регулируется в пределах 0,1°С). Контейнер для проб помещают в термостатируемую камеру (регулируется в пределах 0,01°С), а все остальные части установки поддерживают при более высокой температуре во избежание образования конденсата. К системе при помощи высоковакуумных клапанов подключается высоковакуумное насосное устройство.

Измерительная головка вращающегося ротора состоит из стального шарика (диаметром от 4 до 5 мм) в трубке. Шар подвешивается и стабилизируется в магнитном поле, обычно с использованием комбинации постоянных магнитов и катушек управления.

Шар вращается за счет вращающихся полей, создаваемых катушками. Датчики, измеряющие всегда присутствующую низкую боковую намагниченность шарика, позволяют измерить скорость его вращения.

1.6.7.2. Процедура измерения

Когда шарик достигает заданной скорости вращения v(o) (обычно около 400 оборотов в секунду), дальнейшая подача напряжения прекращается и происходит торможение за счет трения газа.

Падение скорости вращения измеряется как функция времени. Поскольку трение, вызванное магнитной подвеской, незначительно по сравнению с трением газа, давление газа p определяется выражением:

р =pcrrs10t×lnv(t)v(o)

где

c = средняя скорость молекул газа

r = радиус шара

ñ = массовая плотность шара

ó = коэффициент тангенциальной передачи импульса (å =1 для идеальной сферической поверхности шара)

т = время

v(t) = скорость вращения по истечении времени t

v(o) = начальная скорость вращения

Это уравнение также можно записать:

p =pcrr10s×tn tn-1 tn × tn-1

где tn, tn 1 — времена, необходимые для данного числа N оборотов. Эти временные интервалы tn и tn 1 следуют друг за другом, причем tn > tn 1.

Средняя скорость молекулы газа c определяется выражением:

в = (8 РТп М)12

где:

Т = температура

R = универсальная молярная газовая постоянная

M = молярная масса

2. ДАННЫЕ

Давление пара любым из предыдущих методов следует определять как минимум для двух температур. Предпочтительны три или более в диапазоне от 0 до 50°С, чтобы проверить линейность кривой давления пара.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемый метод,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси) и стадия предварительной очистки, если таковая имеется,

- по меньшей мере два значения давления пара и температуры, предпочтительно в диапазоне от 0 до 50°С,

- все исходные данные,

- кривая log p в зависимости от 1/T,

- оценка давления пара в 20 или 25 С.

Если наблюдается переход (изменение состояния, разложение), следует отметить следующую информацию:

- характер изменения,

- температура, при которой происходит изменение атмосферного давления,

- давление пара на 10 и 20 С ниже температуры перехода и на 10 и 20 С выше этой температуры (если только не происходит переход из твердого состояния в газ).

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 104, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) Амброуз Д. в книге Б. Ле Нейндра, Б. Водар (ред.): Экспериментальная термодинамика, Баттервортс, Лондон, 1975, Vol. II.

(3) Под ред. Р. Вайсбергера: Техника органической химии, Физические методы органической химии, 3-е изд. Глава IX, Interscience Publ., Нью-Йорк, 1959, Vol. Я, Часть I.

(4) Кнудсен, М. Энн. Физ. Лпз., 1909, т. 29, 1979; 1911, т. 34, 593.

(5) NF T 20-048 AFNOR (сентябрь 85 г.). Химическая продукция промышленного назначения - Определение давления паров твердых веществ и жидкостей в диапазоне от 10 1 до 105 Па - Статический метод.

(6) NF T 20-047 AFNOR (сентябрь 85 г.). Химическая продукция промышленного назначения - Определение давления пара твердых веществ и жидкостей в диапазоне от 10 3 до 1 Па - Метод баланса давления пара.

(7) ASTM D 2879-86, Стандартный метод испытания зависимости давления пара от температуры и начальной температуры разложения жидкостей с помощью изотенископа.

(8) Г. Мессер, П. Рёль, Г. Гросс и В. Йитчин. Дж.Вак. наук. Технол.(А), 1987, вып. 5(4), 2440.

(9) Эмброуз, Д.; Лоуренсон, Ай-Джей; Спрейк, CHS. Дж. Хим. Термодинамика 1975, вып. 7, 1173.

(10) Б. Ф. Рордорф. Thermochimica Acta, 1985, вып. 85, 435.

(11) Г. Комса, Дж.К. Фремери и Б. Линденау. Дж. Вак. наук. Техн., 1980, вып. 17 (2), 642.

(12) Г. Райх. Дж. Вак. наук. Техн., 1982, вып. 20 (4), 1148.

(13) Дж.К. Фремери. Дж. Вак. наук. Технол.(А), 1985, вып. 3 (3), 1715.

Приложение 1

Метод оценки

ВВЕДЕНИЕ

Можно использовать расчетные значения давления пара:

- для принятия решения о том, какой из экспериментальных методов является целесообразным,

- для предоставления оценочного или предельного значения в случаях, когда экспериментальный метод не может быть

применяется по техническим причинам (в том числе там, где давление пара очень низкое),

- помочь выявить те случаи, когда пропуск экспериментальных измерений оправдан, поскольку давление пара, скорее всего, будет СТАРТ ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Аппарат для определения кривой давления пара динамическим методом

1 = Термопара

2 = Объем вакуумного буфера

3 = Манометр

4 = Вакуум

5 = Точка измерения

6 = Нагревательный элемент около 150 Вт

Рисунок 2а

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Аппарат для определения кривой давления паров статическим методом (с помощью U-образного манометра)

1. Испытуемое вещество

6. Температурная ванна

2. Паровая фаза

7. Устройство измерения температуры.

3. Клапан высокого вакуума.

8. К вакуумному насосу

4. U-образная трубка (вспомогательный манометр)

9. Вентиляция

5. Манометр

Рисунок 2б

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Аппарат для определения кривой давления паров статическим методом (с использованием индикатора давления)

1. Испытуемое вещество

5. Индикатор давления

2. Паровая фаза

6. Температурная ванна

3. Клапан высокого вакуума.

7. Устройство измерения температуры.

4. Манометр

Рисунок 3

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

Изотенископ (см. ссылку 7)

1. К системе контроля и измерения давления.

2. Трубка диаметром 8 мм

3. Сухой азот в системе давления.

4. Образец пара

5. Маленький совет

6. Жидкий образец

Рисунок 4

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

Аппарат для определения кривой давления пара по методу баланса давления пара

1. Испытуемое вещество

7. Щит

2. Паровая фаза с потоком пара.

8. Холодильный бар для

3. Испарительная печь с холодильной камерой с поворотным входом.

3а. Крышка печи с отверстием

9. Балансировочная чаша

4. Печное отопление (охлаждение)

10. Микровесы

5. Измерение температуры образца

11. К диктофону

6. Холодильный шкаф

12. К высоковакуумному насосу

Рисунок 5

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Пример аппарата для выпаривания при низком давлении диффузионным методом с объемом выпотной ячейки 8 см

1 Подключение к вакууму

2 лунки для платинового термометра сопротивления или измерения и контроля температуры (2)

3 Крышка вакуумного бака

4 уплотнительное кольцо

5 Алюминиевый вакуумный бак

6 Устройство для установки и удаления выпотных ячеек

7 Крышка с резьбой

8 орехов-бабочек (6)

9 болтов (6)

10 эффузионных ячеек из нержавеющей стали

11 картриджей нагревателя (6)

Фигура ша

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

Пример проточной системы для определения давления пара методом газонасыщения

1 = регулятор расхода

2 = Теплообменник

3 = Игольчатые клапаны

4 = Датчик относительной влажности

5 = столбцы насыщения

6 = соединения из ПТФЭ

7 = Расходомер

8 = Ловушка (поглотитель)

9 = Маслоуловитель

10 = Барботер с фриттой

Рисунок 6б

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Пример системы для определения давления пара методом газонасыщения с капилляром, размещенным после камеры насыщения

1. Тепловой массовый расходомер

6. Камера насыщения газа.

2. Манометр

7. Капилляр

3. Камера с контролируемой температурой.

8. Поглощающие сосуды

4. Змеевик термостата для газа-носителя.

9. Газовый счетчик

5. Термометр (Пт 100)

10. Холодная ловушка

Рисунок 7

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Пример экспериментальной установки для метода вращающегося ротора Аппарат давления пара

A. сенсорная головка вращающегося ротора;

Б. ячейка для образца;

С. термостат

D. вакуумная линия (турбонасос);

E. воздушный термостат.

Рисунок 8

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Пример измерительной головки с вращающимся ротором

1. Мяч;

2. Вакуумированный трубчатый удлинитель 6 шт.

3. Постоянные магниты (2);

4. Катушки (2) вертикальной стабилизации;

5. Приводные катушки (4)

6. Соединительный фланец.

А. 5. ПОВЕРХНОСТНОЕ НАТЯЖЕНИЕ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). Фундаментальные принципы приведены в ссылке (2).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Описанные методы подлежат применению для измерения поверхностного натяжения водных растворов.

Перед проведением этих испытаний полезно иметь предварительную информацию о растворимости в воде, строении, гидролизных свойствах и критической концентрации мицеллообразования вещества.

Следующие методы применимы к большинству химических веществ без каких-либо ограничений по степени их чистоты.

Измерение поверхностного натяжения методом кольцевого тензиометра ограничивается водными растворами с динамической вязкостью менее примерно 200 мПа·с.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Энтальпия свободной поверхности на единицу площади поверхности называется поверхностным натяжением.

Поверхностное натяжение определяется как:

Н/м (единица СИ) или

мН/м (подединица СИ)1 Н/м = 103 дин/см1 мН/м = 1 дин/см в устаревшей системе СГС

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

Эталонные вещества, охватывающие широкий диапазон поверхностного натяжения, приведены в ссылках 1 и 3.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Методы основаны на измерении максимальной силы, которую необходимо приложить вертикально к стремени или кольцу, контактирующему с поверхностью исследуемой жидкости, помещенной в мерный стакан, с целью отделения ее от этой поверхности. или на тарелке так, чтобы край контактировал с поверхностью, чтобы вытянуть образовавшуюся пленку.

Вещества, растворимые в воде не менее чем в концентрации 1 мг/л, испытывают в водном растворе в одной концентрации.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Эти методы обеспечивают большую точность, чем это может потребоваться для экологической оценки.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

Раствор вещества готовят на дистиллированной воде. Концентрация этого раствора должна составлять 90 % насыщенной растворимости вещества в воде; когда эта концентрация превышает 1 г/л, для тестирования используют концентрацию 1 г/л. Вещества с растворимостью в воде ниже 1 мг/л испытывать не нужно.

1.6.1. Пластинчатый метод

См. ISO 304 и NF T 73-060 (Поверхностно-активные вещества – определение поверхностного натяжения путем составления жидких пленок).

1.6.2. Метод стремени

См. ISO 304 и NF T 73-060 (Поверхностно-активные вещества – определение поверхностного натяжения путем составления жидких пленок).

1.6.3. Кольцевой метод

См. ISO 304 и NF T 73-060 (Поверхностно-активные вещества – определение поверхностного натяжения путем составления жидких пленок).

1.6.4. Гармонизированный кольцевой метод ОЭСР

1.6.4.1. Аппарат

Для этого измерения подходят имеющиеся в продаже тензиометры. Они состоят из следующих элементов:

- мобильный стол для проб,

- система измерения силы,

- измерительный корпус (кольцо),

- измерительный сосуд.

1.6.4.1.1. Мобильный стол для образцов

Передвижной стол для проб используется в качестве опоры для измерительного сосуда с регулируемой температурой, содержащего тестируемую жидкость. Вместе с силоизмерительной системой он установлен на стойке.

1.6.4.1.2. Система измерения силы

Система измерения силы (см. рисунок) расположена над столом для образцов. Погрешность измерения силы не должна превышать ± 10 6 Н, что соответствует пределу погрешности ± 0,1 мг при измерении массы. В большинстве случаев измерительная шкала имеющихся в продаже тензиометров откалибрована в мН/м, так что поверхностное натяжение можно считывать непосредственно в мН/м с точностью 0,1 мН/м.

1.6.4.1.3. Измерительный корпус (кольцо)

Кольцо обычно изготавливается из платино-иридиевой проволоки толщиной около 0,4 мм и средней окружностью 60 мм. Проволочное кольцо подвешивается горизонтально на металлическом штыре и кронштейне для крепления провода для обеспечения соединения с системой измерения силы (см. рисунок).

Фигура

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Измерительный корпус (все размеры указаны в миллиметрах)

1.6.4.1.4. Измерительный сосуд

Измерительный сосуд, содержащий измеряемый испытуемый раствор, должен представлять собой стеклянный сосуд с контролируемой температурой. Он должен быть сконструирован таким образом, чтобы во время измерения температура жидкого испытуемого раствора и газовой фазы над его поверхностью оставалась постоянной и чтобы образец не мог испаряться. Допускаются цилиндрические стеклянные сосуды с внутренним диаметром не менее 45 мм.

1.6.4.2. Подготовка аппарата

1.6.4.2.1. Очистка

Стеклянные сосуды следует тщательно мыть. При необходимости их промывают горячей хромосерной кислотой, а затем сиропообразной фосфорной кислотой (от 83 до 98% по массе H3PO4), тщательно промывают водопроводной водой и, наконец, промывают бидистиллированной водой до получения нейтральной реакции и затем высушены или промыты частью измеряемой жидкости.

Кольцо сначала тщательно промывают в воде для удаления любых веществ, растворимых в воде, ненадолго погружают в хромосерную кислоту, промывают бидистиллированной водой до достижения нейтральной реакции и, наконец, ненадолго нагревают над пламенем метанола.

Примечание:

Загрязнения веществами, которые не растворяются и не разрушаются хромосерной или фосфорной кислотой, например силиконами, должны быть удалены с помощью подходящего органического растворителя.

1.6.4.2.2. Калибровка аппарата

Проверка прибора заключается в проверке нулевой точки и ее настройке таким образом, чтобы показания прибора позволяли надежно определять значения в мН/м.

Монтаж:

Аппарат необходимо выровнять, например, с помощью спиртового уровня на основании тензиометра, регулируя регулировочные винты в основании.

Регулировка нулевой точки:

После установки кольца на аппарат и перед погружением в жидкость показания тензиометра устанавливают на ноль и проверяют параллельность кольца поверхности жидкости. Для этой цели поверхность жидкости можно использовать как зеркало.

Калибровки:

Фактическая тестовая калибровка может быть выполнена с помощью одной из двух процедур:

(a) Использование гири: процедура с использованием наездников известной массы от 0,1 до 1,0 г, помещенных на ринг. Калибровочный коэффициент Öa, на который должны быть умножены все показания прибора, определяется по уравнению (1):

фа = срса(1)

где:

sr = mg2b (мН/м)

m = масса гонщика (г)

g = ускорение свободного падения (981 см с 2 на уровне моря)

b = средняя окружность кольца (см)

óa = показания тензиометра после установки наездника на кольцо (мН/м).

(b) Использование воды: процедура с использованием чистой воды, поверхностное натяжение которой, например, при 23°С равно 72,3 мН/м. Эта процедура выполняется быстрее, чем калибровка веса, но всегда существует опасность того, что поверхностное натяжение воды будет искажено следами загрязнения поверхностно-активными веществами.

Калибровочный коэффициент Öb, на который умножаются все показания прибора, определяется в соответствии с уравнением (2):

фб = сосг(2)

где:

óo = указанное в литературе значение поверхностного натяжения воды (мН/м).

óg = измеренное значение поверхностного натяжения воды (мН/м) при одинаковой температуре.

1.6.4.3. Подготовка образцов

Водные растворы испытуемых веществ должны быть приготовлены в необходимых концентрациях в воде и не должны содержать нерастворенных веществ.

Раствор необходимо поддерживать при постоянной температуре (± 0,5 С). Поскольку поверхностное натяжение раствора в измерительном сосуде меняется с течением времени, необходимо провести несколько измерений в разное время и построить кривую, показывающую зависимость поверхностного натяжения от времени. Когда дальнейших изменений не происходит, достигается состояние равновесия.

Пыль и газообразные загрязнения другими веществами мешают измерению. Поэтому работы следует проводить под защитным кожухом.

1.6.5. Условия испытаний

Измерение должно проводиться при температуре примерно 20°С и контролироваться с точностью ±0,5°С.

1.6.6. Выполнение теста

Измеряемые растворы переносят в тщательно очищенный измерительный сосуд, стараясь избегать вспенивания, а затем измерительный сосуд помещают на стол испытательного аппарата. Столешницу с измерительным сосудом следует поднимать до тех пор, пока кольцо не погрузится под поверхность измеряемого раствора. Затем столешницу следует постепенно и равномерно опускать (со скоростью примерно 0,5 см/мин), чтобы отделить кольцо от поверхности до достижения максимального усилия. Слой жидкости, прикрепленный к кольцу, не должен отделяться от кольца. После завершения измерений кольцо снова погружают под поверхность и повторяют измерения до достижения постоянного значения поверхностного натяжения. Время от переноса раствора в измерительный сосуд фиксируют для каждого определения. Показания следует снимать при максимальной силе, необходимой для отрыва кольца от поверхности жидкости.

2. ДАННЫЕ

Для расчета поверхностного натяжения значение, считанное на приборе в мН/м, сначала необходимо умножить на калибровочный коэффициент Öa или Öb (в зависимости от используемой процедуры калибровки). Это даст значение, которое применимо лишь приблизительно и поэтому требует коррекции.

Харкинс и Джордан (4) эмпирически определили поправочные коэффициенты для значений поверхностного натяжения, измеренных методом колец, которые зависят от размеров кольца, плотности жидкости и ее поверхностного натяжения.

Поскольку определение поправочного коэффициента для каждого отдельного измерения по таблицам Харкинса и Джордана затруднительно, для расчета поверхностного натяжения водных растворов можно использовать упрощенную процедуру считывания скорректированных значений поверхностного натяжения непосредственно из таблицы. (Интерполяция должна использоваться для показаний, находящихся в пределах табличных значений.)

>ТАБЛИЦА>

Эта таблица составлена ​​на основе поправки Харкинса-Джордана. Он аналогичен стандарту DIN (DIN 53914) для воды и водных растворов (плотность ñ = 1 г/см3) и предназначен для имеющегося в продаже кольца с размерами R = 9,55 мм (средний радиус кольца) и r = 0,185 мм (радиус кольцевой проволоки). В таблице приведены скорректированные значения измерений поверхностного натяжения, полученные после калибровки с помощью гирь или калибровки с водой.

Альтернативно, без предварительной калибровки, поверхностное натяжение можно рассчитать по следующей формуле:

s = 4 p Rf × F

где:

F = сила, измеренная на динамометре в месте разрыва пленки.

R = радиус кольца

f = поправочный коэффициент (1)

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемый метод,

- тип используемой воды или раствора,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси),

- результаты измерений: поверхностное натяжение (показания) с указанием как отдельных показаний, так и их среднего арифметического, а также скорректированного среднего значения (с учетом коэффициента оснащения и таблицы поправок),

- концентрация раствора,

- температура испытания,

- возраст использованного раствора; в частности время между приготовлением и измерением раствора,

- описание зависимости поверхностного натяжения от времени после переноса раствора в мерную емкость,

- должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

3.2. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учитывая, что дистиллированная вода имеет поверхностное натяжение 72,75 мН/м при 20°С, вещества, имеющие поверхностное натяжение менее 60 мН/м в условиях данного метода, следует рассматривать как поверхностно-активные материалы.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 115, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) Под ред. Р. Вайсбергера: Техника органической химии, Физические методы органической химии, 3-е место.

изд., Interscience Publ., Нью-Йорк, 1959, Vol. I, часть I, глава XIV

(3) Чистое приложение. хим., 1976, вып. 48, 511.

(4) Харкинс, В.Д., Джордан, Х.Ф., Дж. Амер. хим. Сок., 1930, вып. 52, 1751.

А.6 РАСТВОРИМОСТЬ В ВОДЕ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Для проведения этого теста полезно иметь предварительную информацию о структурной формуле, давлении паров, константе диссоциации и гидролизе (в зависимости от pH) вещества.

Доступен единственный метод, охватывающий весь диапазон растворимости в воде.

Два метода испытаний, описанные ниже, охватывают весь диапазон растворимости, но не применимы к летучим веществам:

- тот, который применяется к по существу чистым веществам с низкой растворимостью (10 2 грамма на литр) и стабильным в воде, называемый «методом колбы».

На растворимость испытуемого вещества в воде может существенно влиять присутствие примесей.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ЕДИНИЦЫ

Растворимость вещества в воде определяется массовой концентрацией насыщения вещества в воде при данной температуре. Растворимость в воде указывается в единицах массы на объем раствора. Единица измерения СИ — кг/м3 (также можно использовать граммы на литр).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Приблизительное количество пробы и время, необходимое для достижения массовой концентрации насыщения, следует определить с помощью простого предварительного испытания.

1.4.1. Колоночный метод элюирования

Этот метод основан на элюировании испытуемого вещества водой из микроколонки, наполненной инертным материалом-носителем, например стеклянными шариками или песком, покрытым избытком испытуемого вещества. Растворимость в воде определяют при постоянной массовой концентрации элюата. Об этом свидетельствует плато концентрации как функция времени.

1.4.2. Колбовой метод

В этом методе вещество (твердые вещества необходимо измельчить) растворяют в воде при температуре несколько выше температуры испытания. После достижения насыщения смесь охлаждают и выдерживают при температуре испытания, перемешивая столько времени, сколько необходимо для достижения равновесия. Альтернативно, измерение может быть выполнено непосредственно при температуре испытания, если путем соответствующего отбора проб можно гарантировать достижение равновесия насыщения. Затем подходящим аналитическим методом определяют массовую концентрацию вещества в водном растворе, который не должен содержать нерастворенных частиц.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

1.5.1. Повторяемость

Для метода элюирования на колонке (3 % на C) следует также использовать две другие температуры, по крайней мере на 10 C выше и ниже первоначально выбранной температуры. При этом регулировка температуры должна составлять ±0,1 С.

Выбранная температура должна поддерживаться постоянной во всех соответствующих частях оборудования.

1.6.2. Предварительный тест

Примерно к 0,1 г образца (твердые вещества необходимо измельчить) в градуированном цилиндре емкостью 10 мл со стеклянной пробкой добавляют возрастающие объемы дистиллированной воды комнатной температуры в соответствии с этапами, указанными в таблице ниже:

>ТАБЛИЦА>

После каждого добавления указанного количества воды смесь энергично встряхивают в течение 10 мин и визуально проверяют на наличие нерастворенных частей пробы. Если после добавления 10 мл воды образец или его части остаются нерастворенными, опыт необходимо повторить в мерном цилиндре вместимостью 100 мл с большими объемами воды. При более низкой растворимости время, необходимое для растворения вещества, может быть значительно больше (должно быть не менее 24 часов). Примерная растворимость приведена в таблице при том объеме добавленной воды, в котором происходит полное растворение пробы. Если вещество по-прежнему очевидно нерастворимо, следует выдержать более 24 часов (максимум 96 часов) или провести дальнейшее разбавление, чтобы определить, следует ли использовать метод элюирования на колонке или метод определения растворимости в колбе.

1.6.3. Колоночный метод элюирования

1.6.3.1. Вспомогательный материал, растворитель и элюент

Материал носителя для метода элюирования на колонке должен быть инертным. Возможными материалами, которые можно использовать, являются стеклянные бусины и песок. Для нанесения испытуемого вещества на материал носителя следует использовать подходящий летучий растворитель качества аналитического реагента. В качестве элюента следует использовать воду, дважды перегнанную в стеклянном или кварцевом аппарате.

Примечание:

Нельзя использовать воду непосредственно из органического ионообменника.

1.6.3.2. Загрузка опоры

Приблизительно 600 мг материала носителя взвешивают и переносят в круглодонную колбу емкостью 50 мл.

Подходящее взвешенное количество тестируемого вещества растворяют в выбранном растворителе. Соответствующее количество этого раствора добавляют к материалу подложки. Растворитель должен быть полностью выпарен, напр. в ротационном испарителе; в противном случае водонасыщение носителя не достигается из-за эффектов разделения на поверхности материала носителя.

Загрузка материала подложки может вызвать проблемы (ошибочные результаты), если тестируемое вещество осаждается в виде масла или другой кристаллической фазы. Проблему следует изучить экспериментально и сообщить подробности.

Загруженному материалу носителя дают пропитаться примерно два часа примерно в 5 мл воды, а затем суспензию добавляют в микроколонку. Альтернативно, сухой загруженный материал носителя можно залить в микроколонку, заполненную водой, а затем уравновесить ее в течение примерно двух часов.

Тестовая процедура:

Элюирование вещества из материала носителя может осуществляться одним из двух различных способов:

- рециркуляционный насос (см. рисунок 1),

- уравнительный сосуд (см. рисунок 4).

1.6.3.3. Колоночный метод элюирования с рециркуляционным насосом

Аппарат

Схематическое устройство типичной системы представлено на рисунке 1. Подходящая микроколонка показана на рисунке 2, хотя допускается любой размер, при условии, что он соответствует критериям воспроизводимости и чувствительности. Колонка должна обеспечивать свободное пространство не менее пяти объемов воды и вмещать минимум пять проб. Альтернативно, размер можно уменьшить, если использовать подпиточный растворитель для замены первоначальных пяти объемов слоя, удаленных примесями.

Колонку следует подключить к рециркуляционному насосу, способному контролировать поток примерно 25 мл/ч. Насос подключается с помощью политетрафторэтилена (ПТФЭ) и/или стеклянных соединений. Колонка и насос в сборе должны иметь приспособления для отбора проб эффлюента и уравновешивания свободного пространства при атмосферном давлении. Материал колонки поддерживается небольшой (5 мм) пробкой из стекловаты, которая также служит для фильтрации частиц. Рециркуляционный насос может представлять собой, например, перистальтический насос или мембранный насос (необходимо следить за тем, чтобы не происходило загрязнения и/или абсорбции материала трубки).

Процедура измерения

Начинается поток через колонну. Рекомендуется использовать скорость потока примерно 25 мл/час (это соответствует 10 объемам слоя в час для описанной колонки). Первые пять объемов слоя (минимум) отбрасывают для удаления водорастворимых примесей. После этого рециркуляционному насосу дают поработать до тех пор, пока не установится равновесие, определенное случайным образом по пяти последовательным пробам, концентрации которых не различаются более чем на ± 30 %. Эти пробы должны быть отделены друг от друга промежутками времени, соответствующими прохождению не менее 10 объемов слоя элюента.

1.6.3.4. Метод элюирования на колонке с уравнительным сосудом

Аппарат (см. рисунки 4 и 3)

Уравнительный резервуар: Соединение с уравнительным резервуаром осуществляется с помощью притертого стеклянного соединения, соединенного трубкой из ПТФЭ. Рекомендуется использовать скорость потока примерно 25 мл/час. Последовательные фракции элюата должны быть собраны и проанализированы выбранным методом.

Процедура измерения

Для определения растворимости в воде используют те фракции из среднего диапазона элюата, концентрации которых постоянны (± 30 %) не менее чем в пяти последовательных фракциях.

В обоих случаях (при использовании рециркуляционного насоса или уравнительного бака) второй прогон необходимо выполнить при половинном расходе первого. Если результаты двух прогонов совпадают, испытание считается удовлетворительным; если наблюдается более высокая кажущаяся растворимость при более низкой скорости потока, то уменьшение скорости потока вдвое должно продолжаться до тех пор, пока два последовательных опыта не дадут одинаковую растворимость.

В обоих случаях (с использованием рециркуляционного насоса или уравнительного сосуда) фракции следует проверять на наличие коллоидных веществ путем исследования эффекта Тиндаля (рассеяния света). Присутствие таких частиц делает результаты недействительными, и испытание следует повторить с улучшением фильтрующего действия колонки.

Необходимо записать pH каждого образца. Второй прогон следует провести при той же температуре.

1.6.4. Колбовой метод

1.6.4.1. Аппарат

Для колбового метода необходим следующий материал:

- обычная лабораторная посуда и инструменты,

- устройство, подходящее для перемешивания растворов при контролируемых постоянных температурах,

- центрифуга (предпочтительно с термостатом), если требуется для эмульсий, и

- оборудование для аналитического определения.

1.6.4.2. Процедура измерения

Количество материала, необходимое для насыщения желаемого объема воды, оценивается по результатам предварительного испытания. Требуемый объем воды будет зависеть от аналитического метода и диапазона растворимости. В каждый из трех стеклянных сосудов, снабженных стеклянными пробками (например, центрифужных пробирок, колб), взвешивают примерно в пять раз большее количество материала, определенное выше. В каждый сосуд добавляют выбранный объем воды и плотно закрывают сосуды. Затем закрытые сосуды перемешивают при температуре 30°С (следует использовать встряхивающее или перемешивающее устройство, способное работать при постоянной температуре, например, магнитное перемешивание на термостатируемой водяной бане). Через сутки один из сосудов вынимают и снова уравновешивают на 24 часа при температуре испытания, периодически встряхивая. Затем содержимое сосуда центрифугируют при температуре испытания и концентрацию испытуемого вещества в прозрачной водной фазе определяют подходящим аналитическим методом. Остальные две колбы обрабатывают аналогичным образом после первоначального уравновешивания при 30°С в течение двух и трех дней соответственно. Если результаты концентрации по крайней мере в двух последних сосудах соответствуют требуемой воспроизводимости, тест считается удовлетворительным. Весь тест следует повторить, используя более длительное время установления равновесия, если результаты сосудов 1, 2 и 3 демонстрируют тенденцию к увеличению значений.

Процедуру измерения можно также проводить без предварительной инкубации при 30°С. Чтобы оценить скорость установления равновесия насыщения, пробы отбирают до тех пор, пока время перемешивания не перестанет влиять на концентрацию тестируемого раствора.

Необходимо записать pH каждого образца.

1.6.5. Анализ

Для этих определений предпочтительнее использовать аналитический метод, специфичный для конкретного вещества, поскольку небольшие количества растворимых примесей могут вызвать большие ошибки в измерении растворимости. Примерами таких методов являются: газовая или жидкостная хроматография, методы титрования, фотометрические методы, вольтамперометрические методы.

2. ДАННЫЕ

2.1. МЕТОД КОЛОННОГО ЭЛЮЦИИ

Среднее значение по крайней мере пяти последовательных проб, взятых с плато насыщения, должно рассчитываться для каждого анализа, как и стандартное отклонение. Результаты следует давать в единицах массы на объем раствора.

Сравниваются средние значения, рассчитанные для двух испытаний с использованием разных потоков, и они должны иметь повторяемость менее 30 %.

2.2. КОЛБОЧНЫЙ МЕТОД

Отдельные результаты должны быть приведены для каждой из трех колб, а те результаты, которые считаются постоянными (повторяемость менее 15 %), должны быть усреднены и выражены в единицах массы на объем раствора. Это может потребовать обратного преобразования единиц массы в единицы объема с использованием плотности, когда растворимость очень высока (> 100 граммов на литр).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. МЕТОД КОЛОННОГО ЭЛЮЦИИ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- результаты предварительного испытания,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси),

- индивидуальные концентрации, скорости потока и pH каждого образца,

- средние значения и стандартные отклонения по меньшей мере пяти образцов с плато насыщения каждого анализа,

- среднее значение двух последовательных приемлемых прогонов,

- температура воды в процессе насыщения,

- используемый метод анализа,

- характер используемого вспомогательного материала,

- загрузка вспомогательного материала,

- используемый растворитель,

- доказательства какой-либо химической нестабильности вещества во время испытания и использованного метода,

- вся информация, необходимая для интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

3.2. КОЛБОЧНЫЙ МЕТОД

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- результаты предварительного испытания,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси),

- отдельные аналитические определения и средние значения, в которых было более одного значения.

определяется для каждой колбы,

- pH каждого образца,

- среднее значение для разных колб, которые оказались согласованными,

- температура испытания,

- используемый аналитический метод,

- доказательства какой-либо химической нестабильности вещества во время испытания и использованного метода,

- всю информацию, необходимую для интерпретации результатов, особенно в отношении

примеси и физическое состояние вещества.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 105, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (сентябрь 85 г.). Химические продукты промышленного назначения. Определение воды

растворимость твердых веществ и жидкостей с низкой растворимостью - метод колоночного элюирования

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (сентябрь 85 г.). Химические продукты промышленного назначения. Определение растворимости в воде твердых веществ и жидкостей с высокой растворимостью. Колбочный метод.

Приложение

Рисунок 1

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Колоночный метод элюирования с рециркуляционным насосом

фигура 2

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Типичная микроколонка

(Все размеры в миллиметрах)

Рисунок 3

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Типичная микроколонка

(Все размеры в миллиметрах)

Рисунок 4

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Метод элюирования на колонке с уравнительным сосудом

p = Уравнительный сосуд (например, 2,5-литровая колба)

2 = Столбец (см. рисунок 3)

3 = Сборщик фракций

4 = Термостат

5 = тефлоновая трубка

6 = Шлифованное стекло

7 = Водопровод (между термостатом и колонкой, внутренний диаметр: примерно 8 мм)

А.8. КОЭФФИЦИЕНТ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

1. МЕТОД

Описанный метод «встряхивания колбы» основан на Руководстве для испытаний ОЭСР (1).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Для проведения этого теста полезно иметь предварительную информацию о структурной формуле, константе диссоциации, растворимости в воде, гидролизе, растворимости в н-октаноле и поверхностном натяжении вещества.

Измерения следует проводить на ионизируемых веществах только в их неионизированной форме (свободная кислота или свободное основание), полученной с использованием соответствующего буфера с pH, по крайней мере, на одну единицу pH ниже (свободная кислота) или выше (свободное основание) пк.

Этот метод тестирования включает две отдельные процедуры: метод встряхивания колбы и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Первое применимо, когда значение log Pow (определения см. ниже) находится в диапазоне от 2 до 4, а второе — в диапазоне от 0 до 6. Перед проведением любой из экспериментальных процедур сначала следует провести предварительную оценку коэффициента разделения. полученный.

Метод встряхивания применим только к практически чистым веществам, растворимым в воде и н-октаноле. Он не применим к поверхностно-активным материалам (для которых необходимо предоставить расчетное значение или оценку, основанную на индивидуальной растворимости н-октанола и воды).

Метод ВЭЖХ неприменим к сильным кислотам и основаниям, металлокомплексам, поверхностно-активным материалам или веществам, вступающим в реакцию с элюентом. Для этих материалов следует предоставить расчетное значение или оценку, основанную на индивидуальной растворимости н-октанола и воды.

Метод ВЭЖХ менее чувствителен к присутствию примесей в тестируемом соединении, чем метод встряхиваемой колбы. Тем не менее, в некоторых случаях примеси могут затруднить интерпретацию результатов, поскольку назначение пиков становится неопределенным. Для смесей, которые дают неразрешенную полосу, следует указать верхний и нижний пределы log P.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ЕДИНИЦЫ

Коэффициент распределения (P) определяется как отношение равновесных концентраций (ci) растворенного вещества в двухфазной системе, состоящей из двух практически несмешивающихся растворителей. В случае н-октанола и воды:

Pow = cn-октанол-вода

Таким образом, коэффициент распределения (P) представляет собой частное двух концентраций и обычно задается в виде логарифма по основанию 10 (log P).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Метод встряхивания

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

метод ВЭЖХ

Чтобы сопоставить измеренные данные ВЭЖХ соединения с его значением P, необходимо построить калибровочный график зависимости log P от хроматографических данных с использованием как минимум 6 контрольных точек. Пользователь должен выбрать соответствующие эталонные вещества. По возможности, по крайней мере, одно эталонное соединение должно иметь Pow выше, чем у испытуемого вещества, а другое - ниже, чем у испытуемого вещества. Для значений log P менее 4 калибровка может быть основана на данных, полученных методом встряхивания. Для значений log P более 4 калибровка может быть основана на проверенных литературных значениях, если они согласуются с расчетными значениями. Для большей точности предпочтительно выбирать эталонные соединения, структурно родственные испытуемому веществу.

Доступны обширные списки значений log Pow для многих групп химических веществ (2)(3). Если данные о коэффициентах распределения структурно родственных соединений недоступны, можно использовать более общую калибровку, установленную с использованием других эталонных соединений.

Перечень рекомендуемых эталонных веществ и значения их Pow приведены в Приложении 2.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

1.4.1. Метод встряхивания

Для определения коэффициента распределения необходимо достичь равновесия между всеми взаимодействующими компонентами системы и определить концентрации растворенных в двух фазах веществ. Изучение литературы по этому вопросу показывает, что для решения этой проблемы можно использовать несколько различных методов, а именно тщательное смешивание двух фаз с последующим их разделением с целью определения равновесной концентрации исследуемого вещества.

1.4.2. метод ВЭЖХ

ВЭЖХ выполняется на аналитических колонках, заполненных коммерчески доступной твердой фазой, содержащей длинные углеводородные цепи (например, C8, C18), химически связанные с диоксидом кремния. Химические вещества, вводимые в такую ​​колонну, движутся по ней с разной скоростью из-за разной степени разделения между подвижной фазой и неподвижной углеводородной фазой. Смеси химических веществ элюируются в порядке их гидрофобности: водорастворимые химические вещества элюируются первыми, а маслорастворимые химические вещества - последними, пропорционально их коэффициенту распределения углеводород-вода. Это позволяет установить взаимосвязь между временем удерживания на такой (обратно-фазовой) колонке и коэффициентом распределения н-октанол/вода. Коэффициент разделения выводится из коэффициента мощности k, определяемого выражением:

к = tR t0t0

где tR = время удерживания тестируемого вещества, а t0 = среднее время, необходимое молекуле растворителя через колонку (мертвое время).

Количественные аналитические методы не требуются, необходимо только определение времени элюирования.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

1.5.1. Повторяемость

Метод встряхивания

Чтобы гарантировать точность коэффициента распределения, необходимо провести повторные определения в трех различных условиях испытания, при этом указанное количество вещества, а также соотношение объемов растворителя могут варьироваться. Определенные значения коэффициента распределения, выраженные в виде их десятых логарифмов, должны находиться в пределах ±0,3 логарифмических единиц.

метод ВЭЖХ

Чтобы повысить достоверность измерений, необходимо выполнить дублирующиеся определения. Значения log P, полученные на основе отдельных измерений, должны находиться в пределах ± 0,1 log единиц.

1.5.2. Чувствительность

Метод встряхивания

Диапазон измерения метода определяется пределом обнаружения аналитической методики. Это должно позволять оценивать значения log Pow в диапазоне от 2 до 4 (иногда, при определенных условиях, этот диапазон может быть расширен до log Pow до 5), когда концентрация растворенного вещества в любой фазе не превышает 0. 01 моль на литр.

метод ВЭЖХ

Метод ВЭЖХ позволяет оценивать коэффициенты распределения в диапазоне log Pow от 0 до 6. Обычно коэффициент распределения соединения можно оценить с точностью до ± 1 логарифмической единицы значения при встряхивании колбы. Типичные корреляции можно найти в литературе (4)(5)(6)(7)(8). Более высокая точность обычно может быть достигнута, если графики корреляции основаны на структурно родственных эталонных соединениях (9).

1.5.3. Специфика

Метод встряхивания

Закон распределения Нернста применим только при постоянной температуре, давлении и pH для разбавленных растворов. Это строго относится к чистому веществу, диспергированному между двумя чистыми растворителями. Если в одной или обеих фазах одновременно присутствуют несколько разных растворенных веществ, это может повлиять на результаты.

Диссоциация или ассоциация растворенных молекул приводит к отклонениям от закона распределения Нернста. На такие отклонения указывает тот факт, что коэффициент распределения становится зависимым от концентрации раствора.

Из-за наличия множественных равновесий этот метод испытаний не следует применять к ионизируемым соединениям без внесения поправки. Для таких соединений следует рассмотреть возможность использования буферных растворов вместо воды; рН буфера должен составлять не менее 1 единицы рН от рКа вещества с учетом значимости этого рН для окружающей среды.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Предварительная оценка коэффициента распределения

Коэффициент распределения предпочтительно оценивается с использованием расчетного метода (см. Приложение 1),

или, где это возможно, исходя из соотношения растворимости испытуемого вещества в чистых растворителях.

(10).

1.6.2. Метод встряхивания

1.6.2.1. Подготовка

н-Октанол: Определение коэффициента распределения следует проводить с использованием реактива высокой чистоты аналитического качества.

Вода: следует использовать дистиллированную или дважды перегнанную воду в стеклянном или кварцевом аппарате. Для ионизируемых соединений, если это оправдано, следует использовать буферные растворы вместо воды.

Примечание. Не следует использовать воду, взятую непосредственно из ионообменника.

1.6.2.1.1. Предварительное насыщение растворителей

Перед определением коэффициента распределения фазы системы растворителей взаимно насыщаются путем встряхивания при температуре эксперимента. Для этого целесообразно встряхивать две большие бутыли с н-октанолом или водой высокой чистоты аналитического качества с достаточным количеством другого растворителя в течение 24 часов на механическом шейкере, а затем дать им постоять достаточно долго, чтобы дать возможность фазы для разделения и достижения состояния насыщения.

1.6.2.1.2. Подготовка к тесту

Весь объем двухфазной системы должен почти заполнять испытательный сосуд. Это поможет предотвратить потери материала из-за улетучивания. Объемное соотношение и количества используемого вещества определяются следующим образом:

- предварительная оценка коэффициента распределения (см. выше),

- минимальное количество испытуемого вещества, необходимое для аналитической процедуры, и

- ограничение максимальной концентрации в любой фазе 0,01 моль на литр.

Проводятся три теста. В первом используется расчетное объемное соотношение н-октанола к воде; во втором это соотношение делится на два; а в третьем это соотношение умножается на два (например, 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3. Тестируемое вещество

Исходный раствор готовят в н-октаноле, предварительно насыщенном водой. Концентрацию этого исходного раствора следует точно определить, прежде чем его использовать для определения коэффициента распределения. Этот раствор следует хранить в условиях, обеспечивающих его стабильность.

1.6.2.2. Условия испытаний

Температура испытания должна поддерживаться постоянной (± 1°С) и находиться в диапазоне от 20 до 25°С.

1.6.2.3. Процедура измерения

1.6.2.3.1. Установление равновесия распределения. Для каждого из условий испытания следует подготовить дубликаты испытательных сосудов, содержащих необходимые, точно отмеренные количества двух растворителей вместе с необходимым количеством исходного раствора.

Фазы н-октанола следует измерять по объему. Сосуды для испытаний следует либо поместить в подходящий шейкер, либо встряхнуть вручную. При использовании центрифужной пробирки рекомендуется быстро повернуть пробирку на 180° вокруг ее поперечной оси, чтобы весь захваченный воздух поднялся через две фазы. Опыт показал, что 50 таких поворотов обычно достаточно для установления равновесия раздела. Для уверенности рекомендуется сделать 100 вращений за пять минут.

1.6.2.3.2. Разделение фаз

При необходимости для разделения фаз следует провести центрифугирование смеси. Это следует делать в лабораторной центрифуге, поддерживаемой при комнатной температуре, или, если используется центрифуга без контроля температуры, центрифужные пробирки следует выдерживать для уравновешивания при температуре испытания в течение как минимум одного часа перед анализом.

1.6.2.4. Анализ

Для определения коэффициента распределения необходимо определить концентрации испытуемого вещества в обеих фазах. Это можно сделать, взяв аликвоту каждой из двух фаз из каждой пробирки для каждого условия испытания и проанализировав ее с помощью выбранной процедуры. Общее количество вещества, присутствующего в обеих фазах, следует рассчитать и сравнить с количеством первоначально введенного вещества.

Пробы водной фазы следует отбирать с помощью процедуры, сводящей к минимуму риск включения следов н-октанола: для отбора проб водной фазы можно использовать стеклянный шприц со съемной иглой. Первоначально шприц должен быть частично заполнен воздухом. Воздух следует осторожно вытеснять, вставляя иглу через слой н-октанола. В шприц набирают достаточный объем водной фазы. Шприц быстро вынимают из раствора и отделяют иглу. Содержимое шприца затем можно использовать в качестве водной пробы. Концентрацию в двух разделенных фазах предпочтительно следует определять методом, специфичным для конкретного вещества. Примерами аналитических методов, которые могут оказаться подходящими, являются:

- фотометрические методы,

- газовая хроматография,

- высокоэффективная жидкостная хроматография.

1.6.3. метод ВЭЖХ

1.6.3.1. Подготовка

Аппарат

Требуется жидкостный хроматограф, оснащенный безимпульсным насосом и подходящим детекторным устройством. Рекомендуется использовать инжекторный клапан с инжекторными петлями. Присутствие полярных групп в неподвижной фазе может серьезно ухудшить работу колонки ВЭЖХ. Поэтому неподвижные фазы должны иметь минимальный процент полярных групп (11). Можно использовать коммерческие насадки для микрочастиц с обращенной фазой или готовые насадочные колонки. Между системой ввода и аналитической колонкой может быть расположена защитная колонка.

Мобильная фаза

Для приготовления элюирующего растворителя, который перед использованием дегазируют, используют метанол для ВЭЖХ и воду для ВЭЖХ. Следует использовать изократическое элюирование. Следует использовать соотношение метанол/вода с минимальным содержанием воды 25 %. Обычно смесь метанол-вода в соотношении 3:1 (по объему) достаточна для элюирования соединений log P 6 в течение часа при скорости потока 1 мл/мин. Для соединений с высоким log P может потребоваться сократить время элюирования (и время элюирования эталонных соединений) за счет уменьшения полярности подвижной фазы или длины колонки.

Вещества с очень низкой растворимостью в н-октаноле имеют тенденцию давать аномально низкие значения log Pow при использовании метода ВЭЖХ; пики таких соединений иногда сопровождают фронт растворителя. Вероятно, это связано с тем, что процесс разделения слишком медленный, чтобы достичь равновесия за время, обычно необходимое для разделения с помощью ВЭЖХ. Тогда снижение скорости потока и/или снижение соотношения метанол/вода может оказаться эффективным для получения надежного значения.

Тестируемые и эталонные соединения должны быть растворимы в подвижной фазе в концентрациях, достаточных для их обнаружения. Только в исключительных случаях к смеси метанола и воды можно использовать добавки, поскольку добавки изменят свойства колонны. Для хроматограмм с добавками обязательно использовать отдельную однотипную колонку. Если метанол-вода не подходит, можно использовать другие смеси органических растворителей и воды, например этанол-вода или ацетонитрил-вода.

pH элюента имеет решающее значение для ионизируемых соединений. Оно должно находиться в пределах рабочего диапазона pH колонки, который обычно составляет от 2 до 8. Рекомендуется буферизация. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать осаждения солей и ухудшения качества колонки, которые происходят при использовании некоторых смесей органической фазы и буфера. Измерения ВЭЖХ с неподвижными фазами на основе диоксида кремния при pH выше 8 не рекомендуются, поскольку использование щелочной подвижной фазы может привести к быстрому ухудшению характеристик колонки.

Растворенные вещества

Эталонные соединения должны быть максимально чистыми. Соединения, которые будут использоваться в целях тестирования или калибровки, по возможности растворяются в подвижной фазе.

Условия испытаний

Температура во время измерений не должна изменяться более чем на ±2 К.

1.6.3.2. Измерение

Расчет мертвого времени

Мертвое время может быть определено с использованием либо гомологического ряда (например, н-алкилметилкетонов), либо неудерживаемых органических соединений (например, тиомочевины или формамида). Для расчета мертвого времени to с использованием гомологического ряда вводят набор из по меньшей мере семи членов гомологического ряда и определяют соответствующие времена удерживания. Необработанные времена удерживания tr(nc + 1) представлены на графике как функция tr(nc), а также точки пересечения a и наклона b уравнения регрессии:

tr(nc + 1) = a + b tr(nc) определяются (nc = число атомов углерода). Тогда мертвое время определяется по формуле:

t0 = а/(1б)

Калибровочный график

Следующим шагом является построение графика корреляции значений log k и log P для соответствующих эталонных соединений. На практике одновременно вводят набор из 5–10 стандартных эталонных соединений, log P которых находится в пределах ожидаемого диапазона, и определяют время удерживания, предпочтительно на регистрирующем интеграторе, связанном с системой обнаружения. Соответствующие логарифмы коэффициентов емкости log k рассчитываются и наносятся на график в зависимости от log P, определенного методом встряхиваемой колбы. Калибровка проводится через регулярные промежутки времени, по крайней мере, один раз в день, чтобы можно было учесть возможные изменения в работе колонки. Определение коэффициента емкости тестируемого вещества. Тестируемое вещество вводится в как можно меньшем количестве подвижной фазы. Время удерживания определяют (в двух экземплярах), что позволяет рассчитать коэффициент емкости k. По графику корреляции эталонных соединений можно интерполировать коэффициент распределения испытуемого вещества. Для очень низких и очень высоких коэффициентов разделения необходима экстраполяция. В таких случаях особое внимание следует уделять доверительным границам линии регрессии.

2. ДАННЫЕ

Метод встряхивания

Надежность определенных значений P можно проверить путем сравнения средних значений повторяющихся определений с общим средним значением.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси),

- когда методы неприменимы (например, поверхностно-активный материал), следует предоставить расчетное значение или оценку, основанную на индивидуальной растворимости н-октанола и воды,

- вся информация и замечания, имеющие значение для интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

Для метода встряхивания:

- результат предварительной оценки, если таковая имеется,

- температура определения,

- данные об аналитических методиках, использованных при определении концентраций,

- время и скорость центрифугирования, если оно используется,

- измеренные концентрации в обеих фазах для каждого определения (это означает, что всего будет сообщено о 12 концентрациях),

- вес испытуемого вещества, объем каждой фазы, использованной в каждом испытательном сосуде, и общее расчетное количество испытуемого вещества, присутствующего в каждой фазе после уравновешивания,

- рассчитанные значения коэффициента разделения (Р) и среднего значения должны быть указаны для каждого набора условий испытаний, как и средние значения для всех определений. Если есть предположение о концентрационной зависимости коэффициента распределения, это следует отметить в отчете.

- следует указывать стандартное отклонение отдельных значений P от их среднего значения,

- среднее значение P всех определений также должно быть выражено в виде его логарифма (по основанию 10),

- рассчитанное теоретическое значение Pow, если это значение было определено или когда измеренное значение > 104,

- pH используемой воды и водной фазы во время эксперимента,

- если используются буферы, обоснование использования буферов вместо воды, состав, концентрация и pH буферов, pH водной фазы до и после эксперимента.

Для метода ВЭЖХ:

- результат предварительной оценки, если таковая имеется,

- тестовые и эталонные вещества и их чистота,

- температурный диапазон определений,

- pH, при котором проводятся определения,

- детали аналитической и охранной колонны, подвижной фазы и средств обнаружения,

- данные удерживания и литературные значения P для эталонных соединений, использованных при калибровке,

- детали подобранной линии регрессии (log k по сравнению с log P),

- средние данные удерживания и интерполированное значение log P для тестируемого соединения,

- описание оборудования и условий эксплуатации,

- профили элюирования,

- количества тестируемых и эталонных веществ, внесенных в колонку,

- мертвое время и способы его измерения.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 107, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

(2) К. Ханш и А.Дж. Лео, Константы заместителей для корреляционного анализа в химии и

Биология, Джон Уайли, Нью-Йорк, 1979.

(3) База данных журналов P и параметров, инструмент для количественного прогнозирования биоактивности (К. Ханш,

председатель, А.Дж. Лео, реж.) - Доступно в рамках проекта медицинской химии колледжа Помоны, 1982 г., Помона.

Колледж, Клермонт, Калифорния 91711.

4. Ренберг Л., Сундстрём Г., Сунд-Нюгард К., Хемосфера, 1980, т. 1, с. 80, 683.

(5) Х. Эллгехаузен, К. Д'Ондт и Р. Фюрер, Пестич. наук., 1981, вып. 12, 219 (1981).

6. Макдаффи Б. Хемосфера. 10, 73.

(7) МЫ. Хаммерс и др., Ж. Хроматогр., 1982, вып. 247, 1.

(8) Дж.Э. Хаки и А.М. Янг, Дж. Лик. Хромат., 1984, вып. 7, 675

(9) С. Фудзисава и Э. Масухара, J. ​​Biomed. Мат. Рез., 1981, вып. 15 787

(10) О. Юберманн, Распределение и экстракция, в «Методах органической химии» (Хубен Вейль),

Общая лабораторная практика (под редакцией Э.Мюллера), Георг Тиме Верлаг, Штутгарт, 1958, Том I/1,

223-339.

(11) Р.Ф. Реккер и Х.М. де карты, евро. Дж. Мед. хим., 1979, т. 14, 479.

(12) А. Лео, К. Ханш и Д. Элкинс, Коэффициенты распределения и их использование. хим. преп., 1971, вып.

71, 525.

(13) Р.Ф. Реккер, Гидрофобная фрагментарная константа, Elsevier, Амстердам, 1977.

(14) НФ Т 20-043 АФНОР (1985). Химическая продукция промышленного назначения. Определение раздела

коэффициент - метод встряхивания опоки.

(15) К.В. Идсфорт и П. Мозер, Хемосфера, 1983, вып. 12, 1459 г.

(16) А. Лео, К. Ханш и Д. Элкинс, Chem. преп., 1971, вып. 71, 525

(17) К. Ханш, А. Лео, С.Х. Унгер, К.Х. Ким, Д. Никайтани и Э.Дж. Лиен, Дж. Мед. хим., 1973, вып.

16, 1207.

(18) В.Б. Нили, Д.Р. Брэнсон и Дж.Э. Блау, Окружающая среда. наук. Техн., 1974, вып. 8, 1113.

(19) Д.С. Браун и Э.В. Флэгг, J. Environ. Отв., 1981, вып. 10, 382

(20) Дж.К. Зейдел и К.Дж. Шапер, Химическая структура и биологическая активность действующих веществ,

Verlag Chemie, Вайнхайм, Нью-Йорк, 1979.

(21) Р. Франке, Теоретические методы разработки лекарств, Elsevier, Амстердам, 1984 г.,

(22) Ю.К. Мартин, Количественный дизайн лекарств, Марсель Деккер, Нью-Йорк, Базель, 1978.

(23) Н.С. Нирлис, С.Дж. Ноултон, Коннектикут Мерфи, Пи Джей Тейлор; Дж. Мед. хим., 1976, вып. 19, 615.

Приложение 1

Методы расчета/оценки

ВВЕДЕНИЕ

Общее введение в методы расчета, данные и примеры представлены в Справочнике по методам оценки химических свойств (а).

Расчетные значения Pow можно использовать:

- для принятия решения о том, какой из экспериментальных методов подходит (диапазон встряхиваемой колбы: log Pow: от 2 до 4, диапазон ВЭЖХ: log Pow: от 0 до 6),

- для выбора подходящих условий испытаний (например, эталонные вещества для процедур ВЭЖХ, объемное соотношение н-октанол/вода для метода встряхиваемой колбы),

- в качестве внутренней лабораторной проверки возможных экспериментальных ошибок,

- для предоставления оценки Pow в случаях, когда экспериментальные методы не могут быть применены по техническим причинам.

МЕТОД ОЦЕНКИ

Предварительная оценка коэффициента распределения

Значение коэффициента распределения можно оценить, используя растворимость испытуемого вещества в чистых растворителях:

Для этого:

Расчетное значение = насыщение октаноловой насыщенной воды.

МЕТОДЫ РАСЧЕТА

Принцип методов расчета

Все методы расчета основаны на формальном фрагментировании молекулы на подходящие подструктуры, для которых известны надежные log Pow-приращения. Затем рассчитывается log Pow всей молекулы как сумма значений соответствующих фрагментов плюс сумма поправочных членов для внутримолекулярных взаимодействий.

Списки констант фрагментов и поправочных членов доступны (b) (c) (d) (e). Некоторые из них регулярно обновляются (b).

Критерии качества

В целом надежность метода расчета снижается с увеличением сложности исследуемого соединения. В случае простых молекул с низкой молекулярной массой и одной или двумя функциональными группами можно ожидать отклонения от 0,1 до 0,3 log Pow единиц между результатами различных методов фрагментации и измеренным значением. В случае более сложных молекул погрешность может быть больше. Это будет зависеть от достоверности и доступности констант фрагментов, а также от способности распознавать внутримолекулярные взаимодействия (например, водородные связи) и правильного использования поправочных членов (меньше проблем с компьютерным программным обеспечением CLOGP-3) (б ). В случае ионизирующих соединений важен правильный учет заряда или степени ионизации.

Процедуры расчета

ð-метод Ханша

Исходная константа гидрофобного заместителя ð, введенная Fujita et al. (f) определяется как:

ðx = log Pow (PhX) log Pow (PhH), где Pow (PhX) — коэффициент распределения ароматического производного, а Pow (PhH) — коэффициент распределения исходного соединения.

Расчетное значение = насыщение октаноловой насыщенной воды.

По своему определению ð-метод применим преимущественно для ароматического замещения. Значения ð для большого числа заместителей сведены в таблицы (b) (c) (d). Они используются для расчета log Pow для ароматических молекул или субструктур.

Метод Рекера

Согласно Реккеру (g) значение log Pow рассчитывается следующим образом:

log Pow = Siai fi + Sj (члены взаимодействия), где fi представляет константы различных молекулярных фрагментов, а ai — частоту их появления в исследуемой молекуле. Поправочные члены могут быть выражены как целое кратное одной константы Cm (так называемая «магическая константа»). Константы фрагментов fi и Cm определяли из списка из 1054 экспериментальных значений Pow (825 соединений) с использованием множественного регрессионного анализа (c)(h). Определение условий взаимодействия проводят по установленным правилам, описанным в литературе (e)(h)(i).

Метод Ханша-Лео

Согласно Ханшу и Лео (с), значение log Pow рассчитывается по формуле:

log Pow = Siai fi + Sj bj Fj

где fi представляет собой различные константы молекулярных фрагментов, Fj — поправочные члены, а ai, bj — соответствующие частоты встречаемости. На основании экспериментальных значений Pow методом проб и ошибок был определен список атомных и групповых фрагментарных значений и список поправочных членов Fj (так называемые «факторы»). Поправочные члены распределены по нескольким различным классам (a)(c). Учесть все правила и условия коррекции достаточно сложно и трудоемко. Разработаны пакеты программного обеспечения (б).

Комбинированный метод

Расчет log Pow сложных молекул можно значительно улучшить, если молекулу разбить на более крупные субструктуры, для которых доступны надежные значения log Pow либо из таблиц (b) (c), либо на основе собственных измерений. Такие фрагменты (например, гетероциклы, антрахинон, азобензол) затем можно комбинировать с ð-значениями Ханша или константами фрагментов Реккера или Лео.

Примечания

и) Методы расчета могут применяться только к частично или полностью ионизированным соединениям, когда есть возможность учесть необходимые поправочные коэффициенты.

ii) Если можно предположить наличие внутримолекулярных водородных связей, необходимо добавить соответствующие поправочные члены (приблизительно от +0,6 до +1,0 log Pow единиц) (a). Признаки наличия таких связей можно получить из стереомоделей или спектроскопических данных молекулы.

iii) Если возможно несколько таутомерных форм, в качестве основы для расчета следует использовать наиболее вероятную форму.

iv) Следует внимательно следить за пересмотром списков констант фрагментов.

Отчет

При использовании методов расчета/оценки протокол испытаний должен, по возможности, включать следующую информацию:

- описание вещества (смесь, примеси и т.п.),

- указание на любые возможные внутримолекулярные водородные связи, диссоциацию, заряд и любые другие необычные эффекты (например, таутомерию),

- описание метода расчета,

- идентификация или предоставление базы данных,

- особенности выбора фрагментов,

- полная документация расчета.

ЛИТЕРАТУРА

(а) У.Дж. Лайман, У.Ф. Рил и Д.Х. Розенблатт (ред.), Справочник по методам оценки химических свойств, McGraw-Hill, Нью-Йорк, 1983.

(b) Колледж Помона, Проект медицинской химии, Клермонт, Калифорния 91711, США, База данных Log P и Med. хим. Программное обеспечение (Программа CLOGP-3).

(с) К. Ханш, А.Дж. Лео, Константы заместителей для корреляционного анализа в химии и биологии, Джон Уайли, Нью-Йорк, 1979.

(г) А. Лео, К. Ханш, Д. Элкинс, Chem. преп., 1971, вып. 71, 525.

(д) Р.Ф. Реккер, Х.М. де Корт, Евр. Дж. Мед. хим. - Чим. Там. 1979, вып. 14, 479.

(f) Т. Фудзита, Дж. Иваса и К. Ханш, J. Amer. хим. Сок., 1964, вып. 86, 5175.

(ж) Р.Ф. Реккер, Гидрофобная фрагментарная константа, Фармакохимическая библиотека, Эльзевир, Нью-Йорк, 1977, том. 1.

(h) К.В. Идсфорт, П. Мозер, Хемосфера, 1983, т. 1, с. 12, 1459.

(i) Р.А. Шеррер, ACS, Американское химическое общество, Вашингтон, округ Колумбия, 1984, серия симпозиумов 255, стр. 225.

Приложение 2

>ТАБЛИЦА>

А.9. ТОЧКА ВОЗГОРАНИЯ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Перед проведением этого испытания полезно иметь предварительную информацию о воспламеняемости вещества. Процедура испытания применима к жидким веществам, пары которых могут воспламеняться от источников воспламенения. Методы испытаний, перечисленные в этом тексте, надежны только для диапазонов температур вспышки, указанных в отдельных методах.

При выборе метода, который будет использоваться, следует учитывать возможность химических реакций между веществом и держателем образца.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Температура вспышки — это самая низкая температура, скорректированная на давление 101 325 кПа, при которой жидкость выделяет пары в условиях, определенных в методе испытаний, в таком количестве, что в испытательном сосуде образуется легковоспламеняющаяся смесь пара и воздуха. .

Единицы: Ct = T273,15(t в C и T в K)

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Вещество помещают в испытательный сосуд и нагревают или охлаждают до температуры испытания в соответствии с процедурой, описанной в отдельном методе испытаний. Испытания на воспламенение проводятся для того, чтобы установить, вспыхнул ли образец при температуре испытания.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

1.5.1. Повторяемость

Повторяемость варьируется в зависимости от диапазона температуры вспышки и используемого метода испытаний; максимум 2 С.

1.5.2. Чувствительность

Чувствительность зависит от используемого метода тестирования.

1.5.3. Специфика

Специфичность некоторых методов испытаний ограничена определенным диапазоном температур вспышки и зависит от данных, связанных с веществом (например, высокая вязкость).

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Препараты

Образец испытуемого вещества помещают в испытательную аппаратуру согласно 1.6.3.1 и/или 1.6.3.2.

В целях безопасности рекомендуется использовать метод с использованием образца небольшого размера, около 2 см3, для энергетических или токсичных веществ.

1.6.2. Условия испытаний

Если это соответствует требованиям безопасности, аппарат следует размещать в месте, защищенном от сквозняков.

1.6.3. Производительность теста

1.6.3.1. Равновесный метод

См. ИСО 1516, ИСО 3680, ИСО 1523, ИСО 3679.

1.6.3.2. Неравновесный метод

Аппарат Абеля:

См. BS 2000, часть 170, NF M07-011, NF T66-009.

Аппарат Абеля-Пенского:

См. EN 57, DIN 51755 часть 1 (для температур от 5 до 65 C), DIN 51755 часть 2 (для температур ниже 5 C), NF M07-036.

Метка аппарата:

См. ASTM D 56.

Аппарат Пенского-Мартенса:

См. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Примечания:

Если температура вспышки, определенная неравновесным методом по 1.6.3.2, равна 0 ± 2 С, 21 ± 2 С или 55 ± 2 С, ее следует подтвердить равновесным методом с использованием того же прибора. .

Для уведомления могут использоваться только те методы, которые могут определить температуру вспышки.

Для определения температуры вспышки вязких жидкостей (красок, камедей и т.п.), содержащих растворители, можно использовать только аппаратуру и методы испытаний, подходящие для определения температуры вспышки вязких жидкостей.

См. ISO 3679, ISO 368O, ISO 1523, DIN 53213 часть 1.

2. ДАННЫЕ

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентификация и примеси),

- должен быть указан использованный метод, а также возможные отклонения,

- результаты и любые дополнительные замечания, имеющие значение для интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

Никто.

А.10. ВОСПЛАМЕНЯЮЩИЕСЯ (ТВЕРДЫЕ ВЕЩЕСТВА)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Перед проведением этого испытания полезно иметь предварительную информацию о потенциально взрывоопасных свойствах вещества.

Это испытание следует применять только к порошкообразным, гранулированным или пастообразным веществам.

Чтобы не включать все вещества, которые могут воспламениться, а только те, которые быстро горят или те, чье поведение при горении каким-либо образом особенно опасно, легковоспламеняющимися считаются только вещества, скорость горения которых превышает определенное предельное значение.

Это может быть особенно опасно, если накал распространяется через металлический порошок из-за трудностей с тушением пожара. Металлические порошки следует считать легковоспламеняющимися, если они способствуют распространению накала по массе в течение определенного времени.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ЕДИНИЦЫ

Время горения выражается в секундах.

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Не указан.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Вещество формуют в виде непрерывной полосы или ряда порошка длиной около 250 мм и проводят предварительный отборочный тест, чтобы определить, происходит ли при воспламенении газовым пламенем распространение путем горения пламенем или тления. Если распространение шлейфа на расстояние более 200 мм происходит в течение заданного времени, то проводится полная программа испытаний по определению скорости горения.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Не указано.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Предварительный скрининговый тест

Вещество формируют в виде сплошной ленты или порошкового шлейфа длиной около 250 мм, шириной 20 мм и высотой 10 мм на негорючей, непористой и малотеплопроводной опорной плите. Горячее пламя газовой горелки (минимальный диаметр 5 мм) наносится на один конец порошковой ленты до воспламенения порошка или максимум на 2 минуты (5 минут для порошков металлов или металлических сплавов). Следует отметить, распространяется ли горение на 200 мм шлейфа в течение 4-минутного периода испытаний (или 40 минут для металлических порошков). Если вещество не воспламеняется и не распространяет горение либо путем горения пламенем, либо тления на расстоянии 200 мм от ряда порошка в течение 4-минутного (или 40-минутного) периода испытаний, то вещество не следует считать легковоспламеняющимся и дальнейшие испытания не проводятся. необходимый. Если вещество распространяет горение на шлейфе порошков длиной 200 мм менее чем за 4 минуты или менее чем за 40 минут для металлических порошков, следует провести процедуру, описанную ниже (пункт 1.6.2 и последующие).

1.6.2. Тест скорости горения

1.6.2.1. Подготовка

Порошкообразные или сыпучие вещества засыпают в форму длиной 250 мм треугольного сечения с внутренней высотой 10 мм и шириной 20 мм. По обеим сторонам формы в продольном направлении в качестве боковых ограничений установлены две металлические пластины, выступающие на 2 мм за верхнюю кромку треугольного сечения (рисунок). Затем форму трижды роняют с высоты 2 см на твердую поверхность. При необходимости форму снова заполняют. Затем боковые ограничения удаляются и излишки вещества соскабливаются. На верхнюю часть формы помещают негорючую, непористую опорную плиту с низкой теплопроводностью, аппарат переворачивают и форму удаляют.

Пастообразные вещества наносят на негорючую, непористую и малотеплопроводную опорную плиту в виде жгута длиной 250 мм и сечением около 1 см2.

1.6.2.2. Условия испытаний

В случае вещества, чувствительного к влаге, испытание следует проводить как можно быстрее после его извлечения из контейнера.

1.6.2.3. Производительность теста

Разложите кучу поперек сквозняка в вытяжном шкафу.

Скорость воздуха должна быть достаточной, чтобы предотвратить попадание паров в лабораторию, и не должна меняться во время испытания. Вокруг аппарата следует установить защитную ширму.

Горячее пламя газовой горелки (диаметром не менее 5 мм) используется для поджигания штабеля с одного конца. Когда куча прогорела на расстоянии 80 мм, измеряют скорость горения на следующих 100 мм.

Тест проводят шесть раз, каждый раз используя чистую прохладную пластинку, если ранее не наблюдается положительный результат.

2. ДАННЫЕ

Для оценки имеют значение время горения в результате предварительного проверочного испытания (1.6.1.) и самое короткое время горения в шести испытаниях (1.6.2.3.).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентификация и примеси),

- описание испытуемого вещества, его физическое состояние, включая содержание влаги,

- результаты предварительного проверочного теста и теста на скорость горения, если он проводился,

- все дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

3.2. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТА

Порошкообразные, гранулированные или пастообразные вещества считаются легковоспламеняющимися, если время горения при любых испытаниях, проводимых по методике испытаний, описанной в 1.6.2, составляет менее 45 секунд. Порошки металлов или металлических сплавов считаются легковоспламеняющимися, если они могут воспламениться и пламя или зона реакции распространяется по всему образцу за 10 минут и менее.

4. ССЫЛКИ

(1) NF T 20-042 (85 СЕНТЯБРЯ). Химическая продукция промышленного назначения. Определение воспламеняемости твердых тел.

Приложение

Фигура

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Форма и принадлежности для подготовки сваи (Все размеры в миллиметрах)

А.11. ВОСПЛАМЕНЯЕМОСТЬ (ГАЗЫ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Этот метод позволяет определить, являются ли легковоспламеняющимися газы, смешанные с воздухом при комнатной температуре (около 20°С) и атмосферном давлении, и если да, то в каком диапазоне концентраций. Смеси возрастающих концентраций испытательного газа с воздухом подвергают воздействию электрической искры и наблюдают, происходит ли воспламенение.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ЕДИНИЦЫ

Диапазон воспламеняемости – это диапазон концентраций между нижним и верхним пределами взрываемости. Нижним и верхним пределами взрываемости являются такие пределы концентрации горючего газа в смеси с воздухом, при которых распространение пламени не происходит.

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Не указан.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Концентрацию газа в воздухе повышают шаг за шагом, и на каждом этапе смесь подвергается воздействию электрической искры.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Не указано.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Аппарат

Испытательный сосуд представляет собой вертикальный стеклянный цилиндр с минимальным внутренним диаметром 50 мм и минимальной высотой 300 мм. Электроды зажигания разнесены на расстояние от 3 до 5 мм и располагаются на высоте 60 мм над дном цилиндра. Цилиндр снабжен отверстием для сброса давления. Аппарат должен быть экранирован, чтобы ограничить ущерб от взрыва.

Стоячая индукционная искра 0,5 сек. В качестве источника воспламенения используется высоковольтный трансформатор с выходным напряжением от 10 до 15 кВ (максимальная потребляемая мощность 300 Вт). Пример подходящего устройства описан в ссылке (2).

1.6.2. Условия испытаний

Тест необходимо проводить при комнатной температуре (около 20 C).

1.6.3. Производительность теста

С помощью дозирующих насосов в стеклянный цилиндр вводят известную концентрацию газа в воздухе. Через смесь пропускают искру и наблюдают, отделяется ли пламя от источника возгорания и распространяется ли оно самостоятельно. Концентрация газа варьируется с шагом 1 % об. до тех пор, пока не произойдет воспламенение, как описано выше.

Если химическое строение газа указывает на то, что он будет негорючим и можно рассчитать состав стехиометрической смеси с воздухом, то нужны только смеси в диапазоне от 10 % меньше стехиометрического состава до 10 % большего этого состава. тестироваться с шагом 1 %.

2. ДАННЫЕ

Возникновение распространения пламени является единственной значимой информационной информацией для определения этого свойства.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентификация и примеси),

- описание с размерами используемого аппарата.

- температура, при которой проводилось испытание,

- протестированные концентрации и полученные результаты,

- результат испытания: негорючий газ или легковоспламеняющийся газ,

- если делается вывод, что газ негорючий, то следует указать диапазон концентраций, в котором он был испытан с шагом 1 %,

- должна быть представлена ​​вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

(1) NF T 20-041 (85 СЕНТЯБРЯ). Химическая продукция промышленного назначения. Определение воспламеняемости газов.

(2) В. Бертольд, Д. Конрад, Т. Гревер, Х. Гросс-Вортманн, Т. Редекер и Х. Шаке. «Разработка эталонного аппарата для измерения пределов взрываемости». Хим.-Инж.-Техн. 1984, том 56, 2, 126-127.

А.12. ВОСПЛАМЕНЯЮЩАЯСЯ (КОНТАКТ С ВОДОЙ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Этот метод испытаний можно использовать для определения того, приводит ли реакция вещества с водой или влажным воздухом к образованию опасных количеств газа или газов, которые могут быть легковоспламеняющимися.

Метод испытаний может применяться как к твердым, так и к жидким веществам. Этот метод неприменим к веществам, которые самовозгораются при контакте с воздухом.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Легковоспламеняющиеся: вещества, которые при контакте с водой или влажным воздухом выделяют легковоспламеняющиеся газы в опасных количествах с минимальной скоростью 1 литр/кг в час.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА

Вещество тестируется в соответствии с пошаговой последовательностью, описанной ниже; если на каком-либо этапе происходит возгорание, дальнейшие испытания не требуются. Если известно, что вещество не бурно реагирует с водой, переходим к шагу 4 (1.3.4).

1.3.1. Шаг 1

Испытуемое вещество помещают в ванну с дистиллированной водой при температуре 20°С и отмечают, воспламеняется ли выделяющийся газ.

1.3.2. Шаг 2

Испытуемое вещество помещают на фильтровальную бумагу, плавающую на поверхности чашки с дистиллированной водой при температуре 20°С, и отмечают, воспламеняется ли выделяющийся газ. Фильтровальная бумага предназначена лишь для того, чтобы удерживать вещество в одном месте, чтобы увеличить вероятность возгорания.

1.3.3. Шаг 3

Исследуемое вещество собирают в кучу высотой примерно 2 см и диаметром 3 см. В кучу добавляют несколько капель воды и отмечают, воспламенится ли выделяющийся газ.

1.3.4. Шаг 4

Испытуемое вещество смешивают с дистиллированной водой при температуре 20°С и измеряют скорость выделения газа в течение семи часов с часовыми интервалами. Если скорость эволюции непостоянна или увеличивается по истечении семи часов, время измерения следует продлить максимум до пяти дней. Тест может быть остановлен, если скорость в любой момент превысит 1 литр/кг в час.

1.4. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Не указан.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Не указано.

1.6 ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ

1.6.1. Шаг 1

1.6.1.1. Условия испытаний

Тест проводится при комнатной температуре (около 20 C).

1.6.1.2. Производительность теста

Небольшое количество (диаметром около 2 мм) испытуемого вещества следует поместить в ванну с дистиллированной водой. Следует отметить, (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли возгорание газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.2. Шаг 2

1.6.2.1. Аппарат

Фильтровальную бумагу кладут плашмя на поверхность дистиллированной воды в любом подходящем сосуде, например испарительная чаша диаметром 100 мм.

1.6.2.2. Условия испытаний

Тест проводится при комнатной температуре (около 20 C).

1.6.2.3. Производительность теста

Небольшое количество тестируемого вещества (диаметром около 2 мм) помещают в центр фильтровальной бумаги. Следует отметить, (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли возгорание газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.3. Шаг 3

1.6.3.1. Условия испытаний

Тест проводится при комнатной температуре (около 20 C).

1.6.3.2. Производительность теста

Исследуемое вещество складывают в кучку высотой примерно 2 см и диаметром 3 см с углублением наверху. В полость добавляют несколько капель воды и отмечают: (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли воспламенение газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.4. Шаг 4

1.6.4.1. Аппарат

Устройство устроено, как показано на рисунке.

1.6.4.2. Условия испытаний

Осмотрите контейнер с тестируемым веществом на наличие порошка. НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Аппарат

А.13. ПИРОФОРНЫЕ СВОЙСТВА ТВЕРДЫХ ТВЕРДЫХ ТВЕРДЫХ И ЖИДКОСТЕЙ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Процедура испытания применима к твердым или жидким веществам, которые в небольших количествах самопроизвольно воспламеняются через короткое время после контакта с воздухом при комнатной температуре (около 20 C).

Вещества, которые должны подвергаться воздействию воздуха в течение нескольких часов или дней при комнатной температуре или при повышенных температурах, прежде чем произойдет возгорание, не подпадают под этот метод испытаний.

1.2 ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Вещества считаются пирофорными, если они воспламеняются или вызывают обугливание в условиях, описанных в 1.6.

Самовоспламеняемость жидкостей также может потребоваться проверить с использованием метода А.15 «Температура самовоспламенения (жидкости и газы)».

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Не указан.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Вещество, твердое или жидкое, добавляется к инертному носителю и приводится в контакт с воздухом при температуре окружающей среды в течение пяти минут. Если жидкие вещества не воспламеняются, они впитываются фильтровальной бумагой и подвергаются воздействию воздуха при температуре окружающей среды (около 20 C) в течение пяти минут. Если твердое вещество или жидкость воспламеняется, либо жидкость воспламеняет или обугливает фильтровальную бумагу, то вещество считается пирофорным.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Повторяемость: из-за важности с точки зрения безопасности достаточно одного положительного результата, чтобы вещество считалось пирофорным.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Аппарат

Фарфоровую чашку диаметром около 10 см заполняют диатомитом на высоту около 5 мм при комнатной температуре (около 20°С).

Примечание:

Кизельгур или любое другое аналогичное инертное вещество, которое обычно доступно, следует рассматривать как образец почвы, на которую может быть пролито испытуемое вещество в случае аварии.

Сухая фильтровальная бумага необходима для испытания жидкостей, которые не воспламеняются при контакте с воздухом при контакте с инертным носителем.

1.6.2. Выполнение теста

а) Порошкообразные твердые вещества

От 1 до 2 см3 испытуемого порошкообразного вещества высыпают с высоты около 1 м на негорючую поверхность и наблюдают, воспламеняется ли вещество при падении или в течение пяти минут после осаждения.

Испытание проводят шесть раз, если не происходит возгорания.

б) Жидкости

В подготовленную фарфоровую чашку наливают около 5 см3 испытуемой жидкости и наблюдают, воспламеняется ли вещество в течение пяти минут.

Если в ходе шести испытаний воспламенение не произошло, выполните следующие испытания:

Пробу объемом 0,5 мл наносят из шприца на фильтровальную бумагу с углублениями и наблюдают, происходит ли возгорание или обугливание фильтровальной бумаги в течение пяти минут после добавления жидкости. Испытание проводят трижды, если не происходит воспламенения или обугливания.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Тестирование может быть прекращено при получении положительного результата в любом из тестов.

2.2. ОЦЕНКА

Если вещество воспламеняется в течение пяти минут при добавлении к инертному носителю и на воздухе, или жидкое вещество обугливается или воспламеняет фильтровальную бумагу в течение пяти минут при добавлении и воздействии на воздух, оно считается пирофорным.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентификация и примеси),

- результаты испытаний,

- любые дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

(1) НФ Т 20-039 (85 СЕНТЯБРЯ). Химическая продукция промышленного назначения. Определение самовозгораемости твердых тел и жидкостей.

(2) Рекомендации по перевозке опасных грузов, испытания и критерии, 1990 г., Организация Объединенных Наций, Нью-Йорк.

А.14. ВЗРЫВНЫЕ СВОЙСТВА

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Метод предусматривает схему испытаний, позволяющую определить, представляет ли твердое или пастообразное вещество опасность взрыва при воздействии пламени (термическая чувствительность), ударе или трении (чувствительность к механическим воздействиям), а также является ли жидкость вещество представляет опасность взрыва при воздействии пламени или ударе.

Метод состоит из трех частей:

(а) тест на термическую чувствительность (1);

(б) испытание механической чувствительности к удару (1);

(в) испытание механической чувствительности к трению (1).

Метод дает данные для оценки вероятности инициирования взрыва с помощью некоторых общих стимулов. Метод не предназначен для определения способности вещества взрываться при любых условиях.

Этот метод подходит для определения того, будет ли вещество представлять опасность взрыва (термическая и механическая чувствительность) в конкретных условиях, указанных в директиве. Он основан на ряде типов аппаратов, которые широко используются во всем мире (1) и обычно дают значимые результаты. Признается, что метод не является окончательным. Альтернативное оборудование по сравнению с указанным может использоваться при условии, что оно признано на международном уровне и результаты могут быть адекватно коррелированы с результатами, полученными на указанном устройстве.

Испытания нет необходимости проводить, если имеющаяся термодинамическая информация (например, теплота образования, теплота разложения) и/или отсутствие определенных реакционноспособных групп (2) в структурной формуле устанавливает вне разумных сомнений, что вещество неспособно к быстрому разложению с выделением газов или выделения тепла (т.е. материал не представляет опасности взрыва). Для жидкостей испытание на механическую чувствительность к трению не требуется.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Взрывной:

Вещества, которые могут взрываться под действием пламени или чувствительны к ударам или трению в указанном аппарате (или являются более механически чувствительными, чем 1,3-динитробензол в альтернативном аппарате).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

1,3-динитробензол, технический кристаллический продукт, просеянный через сито 0,5 мм, для трения и ударных методов.

Пергидро-1,3,5-тринитро-1,3,5-триазин (гексоген, гексоген, циклонит - CAS 121-82-4), перекристаллизованный из водного циклогексанона, просеянный через мокрое сито через 250 мкм и выдержанный на 150 мкм. просеивали и сушили при 103±2 С (в течение 4 часов) для второй серии испытаний на трение и удар.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Предварительные тесты необходимы для создания безопасных условий для проведения трех тестов на чувствительность.

1.4.1. Испытания на безопасность при обращении (3)

В целях безопасности перед проведением основных испытаний очень малые образцы (около 10 мг) вещества подвергают безудержному нагреву в газовом пламени, ударам в аппаратах любой удобной формы и трению молотком о наковальня или любой другой механизм трения. Цель состоит в том, чтобы выяснить, является ли вещество настолько чувствительным и взрывоопасным, что предписанные испытания на чувствительность, особенно на тепловую чувствительность, следует проводить с особыми мерами предосторожности, чтобы избежать травм оператора.

1.4.2. Термическая чувствительность

Этот метод включает нагревание вещества в стальной трубке, закрытой диафрагмами с отверстиями разного диаметра, с целью определить, может ли вещество взорваться в условиях сильного нагрева и определенного ограничения.

1.4.3. Механическая чувствительность (шок)

Метод заключается в том, что вещество подвергается удару определенной массы, брошенной с определенной высоты.

1.4.4. Механическая чувствительность (трение)

Метод заключается в том, что твердые или пастообразные вещества подвергаются трению между стандартными поверхностями при заданных условиях нагрузки и относительного движения.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Не указано.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Термическая чувствительность (эффект пламени)

1.6.1.1. Аппарат

Аппарат состоит из одноразовой стальной трубки с многоразовым закрывающим устройством (рисунок 1), установленной в нагревательно-защитном устройстве. Каждая трубка изготовлена ​​методом глубокой вытяжки из листовой стали (см. Приложение) и имеет внутренний диаметр 24 мм, длину 75 мм и толщину стенки 0,5 мм. Трубки имеют фланцы на открытом конце, что позволяет закрывать их узлом диафрагмы. Он состоит из устойчивой к давлению диафрагмы с центральным отверстием, прочно прикрепленной к трубке с помощью винтового соединения, состоящего из двух частей (гайка и резьбовое кольцо). Гайка и резьбовое кольцо изготовлены из хромомарганцевой стали (см. Приложение), не вызывающей искр до 800 C. Диафрагмы толщиной 6 мм изготовлены из жаростойкой стали (см. Приложение) и поставляются с диапазон диаметров отверстий.

1.6.1.2. Условия испытаний

Обычно вещество проверяется в том виде, в котором оно получено, хотя в некоторых случаях, например, если вещество спрессовано, отлито или иным образом уплотнено, может возникнуть необходимость в испытании вещества после раздавливания.

Для твердых веществ масса материала, используемого в каждом испытании, определяется с использованием двухэтапной процедуры пробного прогона. Тарированную трубку наполняют 9 см3 вещества и утрамбовывают вещество с силой 80 Н, приложенной ко всему поперечному сечению трубки. По соображениям безопасности или в случаях, когда физическая форма образца может быть изменена путем сжатия, могут использоваться другие процедуры наполнения; например если вещество очень чувствительно к трению, трамбовка нецелесообразна. Если материал сжимаемый, его добавляют еще и утрамбовывают, пока трубка не заполнится до 55 мм от верха. Определяют общую массу, использованную для заполнения трубки до уровня 55 мм, и добавляют еще две порции, каждая из которых утрамбовывается с усилием 80 Н. Затем материал либо добавляют с утрамбовкой, либо вынимают по мере необходимости, оставляя трубку заполненной до уровня 15 мм от верха. Выполняют второй пробный прогон, начиная с утрамбованного количества, составляющего треть общей массы, полученной при первом пробном прогоне. Еще два таких приращения добавляются с усилием 80 Н и уровень вещества в трубке доводится до 15 мм от верха путем добавления или удаления материала по мере необходимости. Количество твердого вещества, определенное во втором пробном прогоне, используют для каждого испытания; заполнение производится тремя равными объемами, каждый из которых сжимается до 9 см3 с любой необходимой силой. (Этому может способствовать использование дистанционных колец.)

Жидкости и гели загружают в пробирку на высоту 60 мм, обращая особое внимание на гели, чтобы не допустить образования пустот. Резьбовое кольцо надевается на трубку снизу, вставляется соответствующая диафрагма и затягивается гайка после нанесения смазки на основе дисульфида молибдена. Очень важно убедиться, что никакое вещество не застряло между фланцем и пластиной или в резьбе.

Нагрев осуществляется пропаном, отбираемым из промышленного баллона, снабженным регулятором давления (60-70 мбар), через счетчик и равномерно распределяемым (по визуальному наблюдению пламени от горелок) коллектором на четыре горелки. Горелки расположены вокруг испытательной камеры, как показано на рисунке 1. Общий расход четырех горелок составляет около 3,2 литра пропана в минуту. Можно использовать альтернативные топливные газы и горелки, но скорость нагрева должна соответствовать указанной на рисунке 3. Для всех аппаратов скорость нагрева должна периодически проверяться с использованием трубок, заполненных дибутилфталатом, как указано на рисунке 3.

1.6.1.3. Выполнение тестов

Каждое испытание проводится до тех пор, пока трубка не будет фрагментирована или трубка не будет нагреваться в течение пяти минут. Испытание, в результате которого трубка разбивается на три или более частей, которые в некоторых случаях могут быть соединены друг с другом узкими полосками металла, как показано на рисунке 2, оценивается как вызывающее взрыв. Испытание, в результате которого образовалось меньше осколков или не произошло вовсе, считается не дающим взрыва.

Сначала проводят серию из трех испытаний с диафрагмой диаметром 6,0 мм и, если взрывов не получено, проводят вторую серию из трех испытаний с диафрагмой диаметром 2,0 мм. Если во время любой из серий испытаний произойдет взрыв, дальнейшие испытания не требуются.

1.6.1.4. Оценка

Результат испытания считается положительным, если в любой из вышеуказанных серий испытаний произошел взрыв.

1.6.2. Механическая чувствительность (шок)

1.6.2.1. Аппарат (рисунок 4)

Основными частями типичного устройства с падающим молотом являются литой стальной блок с основанием, наковальней, колонной, направляющими, падающими грузами, устройством освобождения и держателем образца. Стальная наковальня 100 мм (диаметр) × 70 мм (высота) прикручивается к верху стального блока 230 мм (длина) × 250 мм (ширина) × 200 мм (высота) с литым основанием 450 мм (длина) × 450 мм (ширина) × 60 мм (высота). Колонна, изготовленная из бесшовной тянутой стальной трубы, закреплена в держателе, привинченном к задней части стального блока. Четыре винта крепят аппарат к прочному бетонному блоку размером 60×60×60 см так, чтобы направляющие были абсолютно вертикальны и падающий груз свободно падал. Для использования доступны гири массой 5 ​​и 10 кг, изготовленные из прочной стали. Ударная головка каждой гири изготовлена ​​из закаленной стали с твердостью HRC от 60 до 63 и имеет минимальный диаметр 25 мм.

Испытуемый образец заключен в ударное устройство, состоящее из двух соосных цельных стальных цилиндров, расположенных один над другим в полом цилиндрическом стальном направляющем кольце. Цельнолитые стальные цилиндры должны иметь диаметр 10 (0,003, 0,005) мм и высоту 10 мм, полированные поверхности, закругленные края (радиус кривизны 0,5 мм) и твердость от 58 до 65 HRC. Полый цилиндр должен иметь внешний диаметр 16 мм, полированное отверстие 10 (+0,005, +0,010) мм и высота 13 мм. Ударное устройство собрано на промежуточной наковальне (диаметром 26 мм и высотой 26 мм), изготовленной из стали и центрированной кольцом с перфорацией для обеспечения выхода дыма.

1.6.2.2. Условия испытаний

Объем пробы должен составлять 40 мм3 или объем, подходящий для любого альтернативного прибора. Твердые вещества следует испытывать в сухом состоянии и готовить следующим образом:

а) порошкообразные вещества просеивают (размер сита 0,5 мм); все, что прошло через сито, используется для проверки;

(б) прессованные, литые или иным образом сгущенные вещества разбивают на мелкие кусочки и просеивают; для испытаний используют сито-фракцию диаметром от 0,5 до 1 мм, которая должна быть репрезентативной для исходного вещества.

Вещества, обычно поставляемые в виде паст, следует по возможности испытывать в сухом состоянии или, в любом случае, после удаления максимально возможного количества разбавителя. Жидкие вещества испытываются при зазоре 1 мм между верхним и нижним стальными цилиндрами.

1.6.2.3. Выполнение тестов

Проводится серия из шести испытаний по падению груза массой 10 кг с высоты 0,40 м (40 Дж). Если в ходе шести испытаний при 40 Дж получен взрыв, необходимо провести дополнительную серию из 6 испытаний с падением массы массой 5 ​​кг с высоты 0,15 м (7,5 Дж). В другом аппарате образец сравнивается с выбранным эталонным веществом с использованием установленной процедуры (например, метода «вверх-вниз» и т. д.).

1.6.2.4. Оценка

Результат испытания считается положительным, если в любом из испытаний с указанным ударным устройством хотя бы один раз произошел взрыв (возгорание пламени и/или отчет, эквивалентный взрыву) или образец более чувствителен, чем 1,3-динитробензол или RDX в альтернативном шоковом тесте.

1.6.3. Механическая чувствительность (трение)

1.6.3.1. Аппарат (рисунок 5)

Аппарат трения состоит из литой стальной опорной плиты, на которой установлено фрикционное устройство. Он состоит из фиксированного фарфорового штифта и подвижной фарфоровой пластины. Фарфоровая тарелка удерживается на каретке, которая движется по двум направляющим. Каретка соединена с электродвигателем через шатун, эксцентриковый кулачок и подходящую зубчатую передачу так, что фарфоровая пластина перемещается только один раз вперед и назад под фарфоровым штифтом на расстояние 10 мм. Фарфоровый колышек может быть нагружен, например, 120 или 360 ньютонами.

Плоские фарфоровые пластины изготавливаются из белого технического фарфора (шероховатость от 9 до 32 мкм) и имеют размеры 25 мм (длина) × 25 мм (ширина) × 5 мм (высота). Цилиндрический фарфоровый штифт также изготовлен из белого технического фарфора, имеет длину 15 мм, диаметр 10 мм и шероховатые сферические торцевые поверхности с радиусом кривизны 10 мм.

1.6.3.2. Условия испытаний

Объем пробы должен составлять 10 мм3 или объем, подходящий для любого альтернативного прибора.

Твердые вещества испытывают в сухом состоянии и готовят следующим образом:

а) порошкообразные вещества просеивают (размер сита 0,5 мм); все, что прошло через сито, используется для проверки;

(б) прессованные, литые или иным образом сгущенные вещества разбивают на мелкие кусочки и просеивают; сито фракционное НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

фигура 2

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Тест на термическую чувствительность

Примеры фрагментации

Рисунок 3

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Калибровка скорости нагрева для проверки тепловой чувствительности

Кривая зависимости температуры от времени, полученная при нагревании дибутилфталата (27 см3) в закрытой трубке (с диафрагмой 1,5 мм) при скорости потока пропана 3,2 л/мин. Температуру измеряют с помощью хромель/алюмелевой термопары диаметром 1 мм из нержавеющей стали, расположенной по центру на 43 мм ниже края трубки. Скорость нагрева между 135°С и 285°С должна составлять от 185 до 215°С/мин.

Рисунок 4

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Рисунок 4. Продолжение.

Рис. 4в Ударное устройство для веществ в порошкообразной или пастообразной форме

Рис. 4г Ударное устройство для жидких веществ

(1) стальные цилиндры

(2) направляющее кольцо для стальных цилиндров

(3) фиксирующее кольцо с отверстиями

а) вертикальный разрез

(б) план

(4) резиновое кольцо

(5) жидкое вещество (40 мм3)

(6) пространство, свободное от жидкости

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Рис. 4д Молот (масса падения 5 кг)

(1) патрубок подвески

(2) маркер высоты

(3) позиционирующий паз

(4) цилиндрическая ударная головка

(5) захват отскока

Рисунок 5

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Аппарат чувствительности к трению

Рис. 5а Аппарат трения; фасад и вид сверху

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Рис. 5б. Исходное положение штифта на образце.

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

А.15. ТЕМПЕРАТУРА САМОВОСПЛАМЕНЕНИЯ (ЖИДКОСТЕЙ И ГАЗОВ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Взрывчатые вещества и вещества, которые самовозгораются при контакте с воздухом при температуре окружающей среды, не должны подвергаться этому испытанию. Процедура испытания применима к газам, жидкостям и парам, которые в присутствии воздуха могут воспламениться от горячей поверхности.

Температура самовоспламенения может быть значительно снижена за счет присутствия каталитических примесей, материала поверхности или увеличения объема испытательного сосуда.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Степень самовоспламенения выражается через температуру самовоспламенения. Температура самовоспламенения — это самая низкая температура, при которой испытуемое вещество воспламеняется при смешивании с воздухом в условиях, определенных в методе испытаний.

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонные вещества приводятся в стандартах (см. 1.6.3). Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечения возможности сравнения с результатами других методов.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод определяет минимальную температуру внутренней поверхности оболочки, при которой произойдет воспламенение газа, пара или жидкости, впрыскиваемой в оболочку.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Повторяемость варьируется в зависимости от диапазона температур самовоспламенения и используемого метода испытаний.

Чувствительность и специфичность зависят от используемого метода тестирования.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Аппарат

Устройство описано в методе, указанном в 1.6.3.

1.6.2. Условия испытаний

Образец испытуемого вещества испытывают по методу, указанному в 1.6.3.

1.6.3. Производительность теста

См. МЭК 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. ДАННЫЕ

Запишите температуру испытания, атмосферное давление, количество использованного образца и время до воспламенения.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- точная спецификация вещества (идентификация и примеси),

- количество используемой пробы, атмосферное давление,

- используемый аппарат,

- результаты измерений (температуры испытаний, результаты воспламенения, соответствующие временные задержки),

- все дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

Никто.

А.16. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ТЕМПЕРАТУРА САМОВОСПЛАМЕНЕНИЯ ТВЕРДЫХ ВЕЩЕСТВ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Взрывчатые вещества и вещества, которые самовозгораются при контакте с воздухом при температуре окружающей среды, не должны подвергаться этому испытанию.

Целью этого испытания является предоставление предварительной информации о самовоспламеняемости твердых веществ при повышенных температурах.

Если тепло, выделяемое либо в результате реакции вещества с кислородом, либо в результате экзотермического разложения, не отдается достаточно быстро в окружающую среду, происходит саморазогрев, приводящий к самовозгоранию. Таким образом, самовозгорание происходит, когда скорость выделения тепла превышает скорость потери тепла.

Процедура испытания полезна в качестве предварительного проверочного теста на наличие твердых веществ. Ввиду сложного характера воспламенения и горения твердых веществ температуру самовоспламенения, определенную в соответствии с данным методом испытаний, следует использовать только в целях сравнения.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Температура самовоспламенения, полученная этим методом, представляет собой минимальную температуру окружающей среды, выраженную в градусах Цельсия, при которой определенный объем вещества воспламеняется при определенных условиях.

1.3. ЭТАЛОННОЕ ВЕЩЕСТВО

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Определенный объем испытуемого вещества помещают в печь при комнатной температуре; кривую зависимости температуры от времени, относящуюся к условиям в центре образца, записывают при повышении температуры печи до 400°С или до температуры плавления, если она ниже, со скоростью 0,5°С/мин. Для целей данного испытания температура печи, при которой температура образца достигает 400°С в результате саморазогрева, называется температурой самовоспламенения.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Аппарат

1.6.1.1. Печь

Лабораторная печь с программируемой температурой (объем около 2 литров), оснащенная естественной циркуляцией воздуха и защитой от взрыва. Во избежание потенциального риска взрыва нельзя допускать попадания газов разложения на электрические нагревательные элементы.

1.6.1.2. Куб из проволочной сетки

Кусок проволочной сетки из нержавеющей стали с отверстиями 0,045 мм следует вырезать в соответствии с рисунком, показанным на рисунке 1. Сетку следует сложить и закрепить проволокой в ​​виде куба с открытым верхом.

1.6.1.3. Термопары

Подходящие термопары.

1.6.1.4. Регистратор

Любой двухканальный регистратор с калибровкой от 0 до 600 С или соответствующего напряжения.

1.6.2. Условия испытаний

Вещества проверяются в том виде, в котором они получены.

1.6.3. Производительность теста

Куб наполняют тестируемым веществом и осторожно постукивают, добавляя больше вещества до тех пор, пока куб не заполнится полностью. Затем куб подвешивают в центре духовки при комнатной температуре. Одну термопару помещают в центр куба, а другую — между кубом и стенкой печи для регистрации температуры печи.

Температуру печи и образца непрерывно регистрируют, пока температура печи повышается до 400°С или до температуры плавления, если она ниже, со скоростью 0,5°С/мин.

При воспламенении вещества термопара образца покажет очень резкий подъем температуры выше температуры печи.

2. ДАННЫЕ

Для оценки важна температура печи, при которой температура образца достигает 400°С в результате саморазогрева (см. рисунок 2).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- описание вещества, подлежащего испытанию,

- результаты измерений, включая кривую температура/время,

- все дополнительные замечания, имеющие значение для интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

(1) НФ Т 20-036 (сентябрь 85). Химическая продукция промышленного назначения. Определение относительной температуры самовозгорания твердых тел.

Рисунок 1

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Образец тестового кубика диаметром 20 мм

фигура 2

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Типичная кривая температуры/времени

А.17. ОКИСЛЯЮЩИЕ СВОЙСТВА (ТВЕРДЫЕ ВЕЩЕСТВА)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Перед проведением этого испытания полезно получить предварительную информацию о любых потенциально взрывоопасных свойствах вещества.

Это испытание не применимо к жидкостям, газам, взрывоопасным или легковоспламеняющимся веществам, а также к органическим пероксидам.

Это испытание не требуется проводить, если исследование структурной формулы устанавливает вне всякого разумного сомнения, что вещество неспособно вступать в экзотермическую реакцию с горючим материалом.

Чтобы определить, следует ли проводить испытание с особыми мерами предосторожности, следует провести предварительное испытание.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ЕДИНИЦЫ

Время горения: время реакции, в секундах, необходимое для перемещения зоны реакции вдоль штабеля в соответствии с процедурой, описанной в 1.6.

Скорость горения: выражается в миллиметрах в секунду.

Максимальная скорость горения: наибольшее значение скорости горения, полученное для смесей, содержащих от 10 до 90 % по массе окислителя.

1.3. ЭТАЛОННОЕ ВЕЩЕСТВО

Нитрат бария (ч.д.а.) используется в качестве эталонного вещества для теста и предварительного теста.

Эталонной смесью является та смесь нитрата бария с порошкообразной целлюлозой, приготовленная по 1.6, которая имеет максимальную скорость горения (обычно смесь с 60 % нитрата бария по массе).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА

Предварительное испытание проводится в целях безопасности. Дальнейшие испытания необходимы, если предварительные испытания ясно показывают, что испытуемое вещество обладает окислительными свойствами. Если это не так, вещество должно быть подвергнуто полному испытанию.

В ходе полного испытания испытуемое вещество и определенное горючее вещество смешиваются в различных соотношениях. Затем каждая смесь формируется в кучу, и куча поджигается с одного конца. Определенную максимальную скорость горения сравнивают с максимальной скоростью горения эталонной смеси.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

При необходимости допускается любой способ измельчения и смешивания при условии, что разница максимальной скорости горения в шести отдельных испытаниях отличается от среднеарифметического значения не более чем на 10 %.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.6.1. Подготовка

1.6.1.1. Тестируемое вещество

Уменьшите тестовый образец до размера частиц. НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Форма и принадлежности для подготовки сваи (Все размеры в миллиметрах)

ЧАСТЬ B: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ: ЧАСТЬ B

А. ВВЕДЕНИЕ

См. Общее введение.

Б. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

(i) Острая токсичность включает в себя побочные эффекты, возникающие в течение определенного времени (обычно 14 дней) после введения однократной дозы вещества.

(ii) LD50 (средняя смертельная доза) представляет собой статистически полученную разовую дозу вещества, которая, как можно ожидать, вызовет смерть у 50 % животных, получивших дозу. Значение LD50 выражается в весе тестируемого вещества на единицу веса подопытного животного (миллиграммы на килограмм).

(iii) LC50 (средняя летальная концентрация) представляет собой статистически полученную концентрацию вещества, которая, как ожидается, может вызвать смерть во время воздействия или в течение определенного времени после воздействия у 50 % животных, подвергшихся воздействию в течение определенного времени. Значение LC50 выражается как масса испытуемого вещества на стандартный объем воздуха (миллиграммы на литр).

(iv) Уровень неблагоприятного воздействия N – это максимальная доза или уровень воздействия, использованный в испытании, который не вызывает обнаруживаемых признаков токсичности.

(v) Подострая/подхроническая токсичность включает побочные эффекты, возникающие у экспериментальных животных в результате многократного ежедневного введения или воздействия химического вещества в течение короткого периода их ожидаемой продолжительности жизни.

(vi) Максимально переносимая доза (MTD) – это самый высокий уровень дозы, вызывающий признаки токсичности у животных, не оказывающий существенного влияния на выживаемость по сравнению с тестом, в котором он используется.

(vii) Раздражение кожи – это возникновение обратимых воспалительных изменений в коже после нанесения тестируемого вещества.

(viii) Раздражение глаз – это возникновение обратимых изменений в глазу после нанесения тестируемого вещества на переднюю поверхность глаза.

(ix) Сенсибилизация кожи (аллергический контактный дерматит) представляет собой иммунологически опосредованную кожную реакцию на вещество.

Конкретные определения ингаляционной токсичности

- аэрозоль определяется как частицы (твердые и/или жидкие), однородно диспергированные в воздухе.

- аэродинамический диаметр – это диаметр сферы единичной плотности (1 г см 3 ), имеющей ту же конечную скорость осаждения, что и рассматриваемая частица.

- массовый медианный аэродинамический диаметр (MMAD) – это расчетный аэродинамический диаметр, который делит распределение аэрозоля по размерам пополам при измерении по массе.

- геометрическое стандартное отклонение (GSD) представляет собой отношение расчетного 84-го процентиля к 50-му процентилю и указывает наклон кумулятивной кривой распределения частиц по размерам, при условии, что распределение размеров является логарифмически нормальным.

Конкретные определения процедуры с фиксированной дозой при определении острой пероральной токсичности

- Явная токсичность относится к токсическим эффектам, наблюдаемым после введения тестируемого вещества, которые настолько серьезны, что введение следующей более высокой дозы может привести к смертности.

- Дискриминирующая доза – это высшая из четырех фиксированных доз, которую можно вводить, не вызывая смертности, связанной с соединением (включая гуманные убийства).

C. МУТАГЕННОСТЬ (включая предварительный скрининговый тест на канцерогенность)

Для предварительной оценки мутагенного потенциала вещества необходимо получить информацию о двух категориях конечных точек: генной мутации и хромосомных аберрациях.

Эти две конечные точки оцениваются с помощью следующих тестов:

(i) Тесты на возникновение генных (точечных) мутаций в прокариотических клетках, таких как Salmonella typhimurium; также приемлемы тесты с использованием Escherichia coli. Выбор между этими двумя тест-организмами может определяться природой тестируемого химического вещества.

(ii) Испытания по возникновению хромосомных аберраций в клетках млекопитающих, выращенных in vitro; также приемлема процедура in vivo (микроядерный тест или метафазный анализ клеток костного мозга). Однако при отсутствии каких-либо противопоказаний предпочтение отдается методам in vitro.

D. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Существуют ограничения в степени, в которой результаты испытаний на животных и in vitro могут быть экстраполированы непосредственно на человека, и это необходимо иметь в виду при оценке и интерпретации испытаний.

Если таковые имеются, данные о неблагоприятном воздействии на человека могут иметь значение для определения потенциального воздействия химических веществ на человеческую популяцию.

Д. ССЫЛКИ НА ЛИТЕРАТУРУ

Токсикология — развивающаяся экспериментальная наука, и по каждой теме существует множество литературы. Соответствующую информацию можно найти в Руководстве по тестированию ОЭСР.

Дополнительные замечания

Забота о животных

Строгий контроль условий окружающей среды и надлежащие методы ухода за животными имеют важное значение при проведении испытаний на токсичность.

(i) Жилищные условия

Условия окружающей среды в помещениях или вольерах для экспериментальных животных должны соответствовать испытуемым видам. Для крыс, мышей и морских свинок подходящими условиями являются комнатная температура 22±3°С и относительная влажность воздуха от 30 до 70 %; для кроликов температура должна быть 20 ± 3 С при относительной влажности от 30 до 70 %.

Некоторые экспериментальные методы особенно чувствительны к температурным воздействиям, и в этих случаях подробности соответствующих условий включаются в описание метода испытаний. Во всех исследованиях токсических эффектов температуру и влажность следует контролировать, фиксировать и включать в окончательный отчет исследования.

При искусственном освещении последовательность обычно должна составлять 12 часов света и 12 часов темноты. Подробности режима освещения должны быть записаны и включены в окончательный отчет исследования.

В отчетах об экспериментах на животных важно указывать тип используемых клеток и количество животных, содержащихся в каждой клетке как во время воздействия химического вещества, так и в любой последующий период наблюдения.

(ii) Условия кормления

Рационы должны отвечать всем потребностям в питании исследуемых видов. Если тестируемые вещества вводятся животным в их рацион, их пищевая ценность может быть снижена из-за взаимодействия между веществом и компонентом рациона.

Возможность такой реакции следует учитывать при интерпретации результатов анализов.

Пищевые примеси, которые, как известно, влияют на токсичность, не должны присутствовать в мешающих концентрациях.

Забота о животных

При разработке методов испытаний должное внимание уделялось благополучию животных. Ниже кратко приведены некоторые примеры, этот список не является исчерпывающим. Точные формулировки и/или условия следует читать в тексте методов:

- Для определения острой пероральной токсичности введён альтернативный метод — «Процедура с фиксированной дозой». Эта процедура не использует смерть в качестве конкретной конечной точки. При этом используется меньше животных, и он вызывает меньше боли и страданий, чем классическое определение острой пероральной токсичности.

- Количество используемых животных сокращается до научно приемлемого минимума: только 5 животных одного пола тестируются на один уровень дозы для методов В.1 и В.3; только 10 животных (и только 5 для группы отрицательного контроля) используют для определения сенсибилизации кожи с помощью теста максимизации на морских свинках (метод В.6); количество животных, необходимое для положительного контроля при тестировании мутагенности in vivo, также снижается (методы В.11 и В.12)

- Боль и страдания животных во время испытаний сведены к минимуму: животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом; дозирование испытуемых веществ способом, который, как известно, вызывает сильную боль и страдания из-за разъедающих или раздражающих свойств, не требуется (методы В.1, В.2 и В.3).

- Испытаний с неоправданно высокими дозами можно избежать путем введения предельных тестов не только при испытаниях на острую токсичность (методы В.1, В.2 и В.3), но также и в испытаниях на мутагенность in vivo (методы В.11). и Б.12).

- Стратегия тестирования на раздражающее действие теперь позволяет не проводить тест или свести его к одному исследованию на животных, когда могут быть предоставлены достаточные научные доказательства.

Такие научные доказательства могут быть основаны на физико-химических свойствах вещества, результатах других уже проведенных испытаний или результатах хорошо проверенных испытаний in vitro. Например, если исследование острой токсичности при попадании через кожу было проведено при предельной испытательной дозе вещества (метод В.3) и не наблюдалось раздражения кожи, можно провести дальнейшее тестирование на раздражение кожи (метод В.4). ненужный; материалы, которые продемонстрировали явную коррозию или сильное раздражение кожи в исследовании раздражения кожи (метод В.4), не должны подвергаться дальнейшим испытаниям на раздражение глаз (метод В.5).

B.1 ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ПЕРОРАЛЬНАЯ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Испытуемое вещество вводят перорально через зонд в градуированных дозах нескольким группам экспериментальных животных, причем на каждую группу используют одну дозу. Выбранные дозы могут быть основаны на результатах теста определения диапазона. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных. Этот метод направлен, прежде всего, на исследования на видах грызунов.

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом. Дозирование тестируемых веществ способом, который, как известно, вызывает сильную боль и дискомфорт из-за разъедающих или раздражающих свойств, не требуется.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых взрослых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. При необходимости испытуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем носителе. Рекомендуется, где это возможно, сначала рассмотреть возможность использования водного раствора, затем рассмотреть возможность применения раствора в растительном масле, а затем возможного раствора в других транспортных средствах или в суспензии. Для неводных транспортных средств соответствующие токсичные характеристики транспортного средства должны быть известны или должны быть определены до или во время испытания. У грызунов объем обычно не должен превышать 10 мл/кг массы тела, за исключением водных растворов, где можно использовать 20 мл/кг. Вариабельность исследуемого объема следует свести к минимуму путем корректировки концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы.

Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола в начале испытания диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

На каждом уровне дозы используют не менее пяти грызунов. Все они должны быть одного пола. Если используются самки, они должны быть нерожавшими и небеременными. Если имеется информация, демонстрирующая, что тот или иной пол значительно более чувствителен, животным этого пола следует давать дозу.

Примечание. При испытаниях на острую токсичность на животных более высокого порядка, чем на грызунах, следует рассмотреть возможность использования меньших количеств. Дозы следует тщательно подбирать и прилагать все усилия, чтобы не превышать умеренно токсичные дозы.

При таких испытаниях следует избегать введения смертельных доз испытуемого вещества.

1.6.2.3. Уровни доз

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. Данных должно быть достаточно для построения кривой «доза/реакция» и, где это возможно, для приемлемого определения LD50.

1.6.2.4. Предельный тест

При использовании грызунов предельное испытание при одном уровне дозы, составляющем не менее 2000 мг/кг массы тела, можно провести в группе из пяти самцов и пяти самок с использованием процедур, описанных выше. Если будет получена информация о смертности, связанной с соединением, возможно, потребуется рассмотреть возможность проведения полного исследования.

1.6.2.5. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Следует определять токсические реакции, скорость их возникновения и длительность восстановительного периода; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, а также время смерти, особенно если существует тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3 Процедура

Перед введением вещества животные должны быть голодными. Крысе следует отказаться от еды на ночь; для животных с более высоким уровнем метаболизма подходит более короткий период голодания; вода не ограничена. На следующий день животных следует взвесить, а затем однократно ввести через зонд тестируемое вещество. Если однократное введение невозможно, дозу можно вводить меньшими порциями в течение периода, не превышающего 24 часов. После введения вещества можно отказаться от еды еще на три-четыре часа.

Если дозу вводят дробно в течение определенного периода, может возникнуть необходимость обеспечить животных пищей и водой в зависимости от продолжительности периода. После введения проводят наблюдения и систематически регистрируют, индивидуальные записи следует вести для каждого животного. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня.

Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры, чтобы свести к минимуму потери животных для исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных. Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделять наблюдению тремора, судорог, слюнотечения, диареи, летаргии, сна и комы. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее.

Животных, погибших во время испытания и выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

Оценка токсичности у представителей другого пола

После завершения исследования у одного пола, по крайней мере, одной группе из пяти животных другого пола вводят дозу, чтобы установить, что животные этого пола не являются заметно более чувствительными к тестируемому веществу. Использование меньшего количества животных может быть оправдано в индивидуальных обстоятельствах. При наличии достаточной информации, подтверждающей, что животные испытуемого пола заметно более чувствительны, можно обойтись без тестирования на животных другого пола.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, указав для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Индивидуальный вес животных следует определять и фиксировать незадолго до введения тестируемого вещества, затем еженедельно и в случае смерти. Изменения веса следует рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. Животные, убитые гуманным способом из-за страданий и боли, связанных с соединением, регистрируются как смерть, связанная с соединением. LD50 можно определить признанным методом. Оценка данных должна включать взаимосвязь, если таковая имеется, между воздействием на животных испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсикологические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний,

- уровни доз (в зависимости от носителя, если он используется, и концентрации),

- пол дозируемых животных,

- табулирование данных ответа по полу и уровню дозы (т. е. количество животных, погибших или убитых во время испытания, количество животных, проявляющих признаки токсичности, количество животных, подвергшихся воздействию),

- время смерти после введения дозы, причины и критерии, используемые для гуманного умерщвления животных,

- все наблюдения,

- Значение ЛД50 для пола, подвергнутого полному исследованию, определенное через 14 дней (методом

определение указано),

- 95 % доверительный интервал для LD50 (если это возможно),

- кривая дозы/смертности и наклон (если это допускается методом определения),

- результаты вскрытия,

- любые гистопатологические находки,

- результаты любого теста на другой пол,

- обсуждение результатов (особое внимание следует уделить тому, какое влияние может оказать гуманное умерщвление животных в ходе испытания на рассчитанное значение ЛД50),

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

B.1 bis ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ПЕРОРАЛЬНО) – МЕТОД С ФИКСИРОВАННОЙ ДОЗОЙ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Тест на острую пероральную токсичность дает информацию о побочных эффектах, которые могут возникнуть в течение короткого периода времени после приема однократной дозы тестируемого вещества.

Метод фиксированной дозы проводится в два этапа.

В предварительном прицельном исследовании последовательно исследуются эффекты различных доз, вводимых перорально через зонд отдельным животным одного пола. Прицельное исследование дает информацию о взаимосвязи дозы и токсичности, включая оценку минимальной смертельной дозы. Обычно на первом этапе используют не более пяти животных.

В основном исследовании вещество вводят перорально через зонд группам из пяти самцов и пяти самок животных в одном из заранее установленных уровней дозы (5, 50, 500 или 2000 мг/кг). Используемая доза получена на основе визуального исследования и представляет собой дозу, которая может вызвать «очевидную токсичность» (см. 1.2. Определения), но не приведет к летальному исходу.

После введения проводятся наблюдения за эффектами.

Если выбранный первоначальный уровень дозы вызывает очевидную токсичность, но не вызывает смертности, связанной с соединением, дальнейшее тестирование не требуется.

Если при выбранном уровне дозы не наблюдается очевидной токсичности, вещество следует повторно протестировать при следующем, более высоком уровне дозы. В случае гибели животных или тяжелой токсической реакции, требующей гуманного умерщвления животных, вещество следует повторно протестировать на следующем более низком уровне дозы.

Эта процедура позволяет идентифицировать «дискриминационную дозу» (см. 1.2. Определения), которая является наивысшим из заранее установленных уровней дозы, которую можно ввести, не вызывая смертности (включая гуманные убийства).

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом. Дозирование тестируемых веществ способом, который, как известно, вызывает сильную боль и дискомфорт из-за разъедающих или раздражающих свойств, не требуется.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

1.6.1.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы.

Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола в начале испытания диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых взрослых животных рандомизируют и распределяют в группы прицельного исследования и основной группы исследуемого лечения. На практике для основного исследования может потребоваться только одна группа каждого пола.

1.6.1.2. Приготовление и введение дозы

При необходимости испытуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем носителе. Рекомендуется, где это возможно, сначала рассмотреть возможность использования водного раствора, затем рассмотреть возможность применения раствора в растительном масле, а затем возможного раствора в других транспортных средствах или в суспензии. Для неводных транспортных средств соответствующие токсичные характеристики транспортного средства должны быть известны или должны быть определены до или во время испытания. У грызунов объем обычно не должен превышать 10 мл/кг массы тела, за исключением водных растворов, где можно использовать 20 мл/кг. Вариабельность исследуемого объема следует свести к минимуму путем корректировки концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

Перед введением вещества животные должны быть голодными. Крысе следует отказаться от еды на ночь; вода не ограничена. На следующий день животных следует взвесить, а затем однократно ввести через зонд тестируемое вещество. Если однократное введение невозможно, дозу можно вводить меньшими порциями в течение периода, не превышающего 24 часов. После введения вещества можно отказаться от еды еще на три-четыре часа. Если дозу вводят дробно в течение определенного периода, может оказаться необходимым обеспечить животных пищей и водой в зависимости от продолжительности периода.

1.6.2. Процедура

1.6.2.1. Прицельное исследование

Эффекты различных доз исследуются на отдельных животных. Обычно используются самки животных при отсутствии информации, указывающей на то, что самцы будут более чувствительным полом. Дозирование является последовательным, с выдержкой не менее 24 часов до введения дозы следующему животному. За всеми животными тщательно наблюдают на предмет признаков токсичности в течение как минимум семи дней; если признаки умеренной токсичности сохраняются в течение семи дней, животное следует наблюдать еще в течение семи дней. Рассматриваются следующие начальные уровни доз: 5, 50, 500 и 2000 мг/кг. Если выбранная первоначальная доза не вызывает тяжелой токсичности, а следующий более высокий уровень приводит к смертности, тогда необходимо будет исследовать один или несколько промежуточных уровней дозы, в зависимости от ситуации. Таким образом, должна появиться возможность собрать информацию об уровне(ях) дозы, вызывающей(е) некоторые признаки токсичности, и о минимальном уровне дозы, вызывающем смертность.

Следует приложить усилия для выбора начальной дозы, используя данные по родственным химическим веществам. При отсутствии такой информации предлагается в первую очередь использовать дозу 500 мг/кг. Если при начальной дозе не наблюдается никаких признаков токсичности, то исследуют следующий более высокий уровень дозы. Если при дозе 2000 мг/кг смертности не происходит, прицельный тест считается завершенным и основное исследование следует проводить на этом уровне дозы. Если при начальной дозе (например, 500 мг/кг) наблюдаются серьезные эффекты, требующие гуманного умерщвления, следующую более низкую дозу (например, 50 мг/кг) вводят другому животному. Если это животное выживет, следующим животным можно будет вводить соответствующие промежуточные уровни доз между фиксированными дозами. Обычно в этой процедуре не предполагается использовать более пяти животных.

1.6.2.2. Основное исследование

Для каждого исследуемого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными.

Принцип метода фиксированной дозы заключается в том, что в основном исследовании используются только умеренно токсичные дозы. Следует избегать введения смертельных доз тестируемого вещества.

Уровень дозы, который будет использоваться в тесте, должен быть выбран из одного из четырех фиксированных уровней дозы, а именно 5, 50, 500 или 2000 мг/кг массы тела. Выбранный первоначальный уровень дозы должен быть таким, который может вызвать очевидную токсичность, но не вызывать смертности, связанной с соединением (включая убийства, вызванные гуманными действиями; случайные смерти не включены, но должны быть зарегистрированы). Дальнейшее тестирование необходимо, когда этот уровень дозы вызывает очевидную токсичность, но не вызывает смертности, связанной с соединением.

Если очевидная токсичность не возникает в результате введения выбранного уровня дозы, вещество следует повторно протестировать при следующем более высоком уровне дозы. Однако животных следует продолжать держать под наблюдением до завершения периода наблюдения. Если тяжелая токсическая реакция требует гуманного умерщвления животных или существует смертность, связанная с соединением, вещество следует повторно протестировать при следующем более низком уровне дозы. Опять же, животные, которых не нужно умерщвлять гуманным способом, должны находиться под наблюдением в течение всего периода наблюдения.

После введения производятся и систематически записываются наблюдения. Для каждого животного следует вести индивидуальный учет.

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Следует определять токсические реакции, скорость их возникновения и длительность восстановительного периода; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важны время появления и исчезновения признаков токсичности, а также время смерти, особенно если имеется тенденция к отсрочке появления признаков токсичности.

Тщательное клиническое обследование следует проводить не менее двух раз в день введения дозы и в дальнейшем не реже одного раза в день. Животные, явно испытывающие боль или демонстрирующие серьезные признаки дистресса, должны быть умерщвлены гуманным способом. Дополнительные наблюдения будут необходимы в течение первых нескольких дней после введения дозы, если у животных продолжают проявляться признаки токсичности. Испытание может быть прекращено, если станет очевидно, что выбранный первоначальный уровень дозы был слишком высоким.

Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделить наблюдению за тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой.

Индивидуальный вес животных следует определять незадолго до введения тестируемого вещества, ежедневно в течение следующих трех дней и в дальнейшем еженедельно. Животных, погибших во время испытания, и животных, выживших до окончания испытания, взвешивают и подвергают вскрытию. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

Может потребоваться исследование второго или, в исключительных обстоятельствах, третьего уровня дозы, в зависимости от результатов предыдущего уровня дозы.

В случае, когда вещество вызывает смертность при дозе 5 мг/кг массы тела (или когда наблюдательное исследование показывает, что смертность наступит при таком уровне дозы), возможно, потребуется дальнейшее изучение острой токсичности вещества.

2. ДАННЫЕ

Данные как обзорного исследования, так и основного исследования должны быть обобщены в табличной форме, показывающей для каждого уровня тестируемой дозы количество животных в начале испытания; количество животных с признаками токсичности; количество животных, найденных мертвыми во время испытания или убитых по гуманным соображениям; описание токсических эффектов и, для основного исследования, наблюдалась ли очевидная токсичность, связанная с соединением; течение времени любого токсического воздействия; и результаты вскрытия. Изменения веса следует рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день.

Животные, убитые гуманным способом из-за страданий и боли, связанных с соединением, регистрируются как смерть, связанная с соединением.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию как для обзорного исследования, так и для основного исследования, в зависимости от обстоятельств:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.

- условия испытаний

- уровни доз (в зависимости от носителя, если он используется, и концентрации)

- полные результаты всех исследованных уровней доз

- табулирование данных ответа по полу и уровню дозы (т. е. количество использованных животных; изменения массы тела; если применимо, количество животных, которые умерли или были убиты во время испытания; количество животных, проявляющих признаки токсичности; характер, тяжесть и продолжительность). эффектов)

- время появления признаков токсичности и были ли они обратимы

- когда животные погибли или были забиты, время смерти после введения дозы, причины и критерии, используемые для гуманного умерщвления животных

- результаты вскрытия

- любые гистопатологические находки

- обсуждение результатов

- интерпретация результатов, включая признаки явной токсичности и уровень дискриминирующей дозы, выявленные в ходе испытания.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

>ТАБЛИЦА>

См. также «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

БИ 2. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ВДЫХАНИЕ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Полезно иметь предварительную информацию о гранулометрическом составе, давлении паров, температуре плавления, температуре кипения, температуре вспышки и взрывоопасности (если применимо) вещества.

См. также «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Несколько групп экспериментальных животных в течение определенного периода времени подвергаются воздействию испытуемого вещества в градуированных концентрациях, при этом на группу используется одна концентрация. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом. Дозирование тестируемых веществ способом, который, как известно, вызывает выраженную боль и дискомфорт из-за разъедающих или сильно раздражающих свойств, не требуется.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют на необходимое количество групп. Их не обязательно подвергать моделируемому воздействию, если только это не указано в типе используемого оборудования для воздействия.

Твердые тестируемые вещества, возможно, придется микронизировать для получения частиц подходящего размера.

При необходимости к испытуемому веществу можно добавить подходящий носитель, чтобы обеспечить соответствующую концентрацию испытуемого вещества в атмосфере, после чего следует использовать контрольную группу транспортного средства. Если для облегчения дозирования используются носитель или другие добавки, следует знать, что они не оказывают токсического действия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола в начале испытания диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня концентрации используют не менее 10 грызунов (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными.

Примечание. При испытаниях на острую токсичность на животных более высокого порядка, чем грызуны, следует рассмотреть возможность использования меньших количеств. Дозы следует тщательно подбирать и прилагать все усилия, чтобы не превышать умеренно токсичные дозы. При таких испытаниях следует избегать введения смертельных доз испытуемого вещества.

1.6.2.3. Концентрации воздействия

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. Данных должно быть достаточно для построения концентрационной кривой смертности и, где это возможно, для приемлемого определения ЛК50.

1.6.2.4. Предельный тест

При воздействии на пять подопытных животных-самцов и пяти подопытных самок 5 мг на литр газа или аэрозоля жидкого или твердого вещества (или, если это невозможно из-за физических или химических, в том числе взрывоопасных, свойств испытуемого вещества) , максимально достижимая концентрация) после четырехчасового воздействия не вызывает смертности, связанной с соединением, в течение 14 дней, дальнейшее тестирование может не считаться необходимым.

1.6.2.5. Время контакта

Продолжительность воздействия должна составлять четыре часа.

1.6.2.6. Оборудование

Животных следует тестировать с помощью ингаляционного оборудования, рассчитанного на поддержание динамического потока воздуха со скоростью не менее 12 воздухообменов в час, чтобы обеспечить адекватное содержание кислорода и равномерное распределение атмосферы воздействия. Если используется камера, ее конструкция должна сводить к минимуму скопление подопытных животных и максимизировать воздействие на них испытуемого вещества при вдыхании. Как правило, для обеспечения стабильности атмосферы в камере общий «объем» подопытных животных не должен превышать 5 % объема испытательной камеры. Можно использовать оро-назальную экспозицию, облучение только головы или всего тела в отдельной камере; первые два помогут свести к минимуму попадание тестируемого вещества другими путями.

1.6.2.7. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдений не должна быть жестко фиксирована. Следует определять токсические реакции, скорость их возникновения и длительность восстановительного периода; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, а также время смерти, особенно если существует тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3. Процедура

Незадолго до воздействия животных взвешивают, а затем подвергают воздействию тестируемой концентрации в назначенном аппарате в течение четырех часов после уравновешивания концентрации в камере. Время для уравновешивания должно быть коротким. Температура, при которой проводится испытание, должна поддерживаться на уровне 22 ± 3 C. В идеале относительная влажность должна поддерживаться в пределах от 30 % до 70 %, но в некоторых случаях (например, испытания некоторых аэрозолей) это может оказаться невозможным. Поддержание небольшого отрицательного давления внутри камеры (> 5 мм воды) предотвратит утечку испытуемого вещества в окружающую среду. Во время воздействия следует воздерживаться от еды и воды. Следует использовать подходящие системы для создания и мониторинга испытательной атмосферы. Система должна обеспечивать максимально быстрое достижение стабильных условий воздействия. Камера должна быть спроектирована и эксплуатироваться таким образом, чтобы внутри камеры поддерживалось однородное распределение испытательной атмосферы.

Измерения или мониторинг следует проводить:

а) скорости воздушного потока (постоянно).

(b) фактической концентрации испытуемого вещества, измеренной в зоне дыхания не менее трех раз во время воздействия (в некоторых атмосферах, например, в аэрозолях с высокими концентрациями, может потребоваться более частый контроль). В течение периода воздействия концентрация не должна изменяться более чем на ± 15 % от среднего значения. Однако в случае некоторых аэрозолей такой уровень контроля может оказаться недостижимым, и тогда будет приемлемым более широкий диапазон. Для аэрозолей анализ размера частиц следует проводить так часто, как это необходимо (по крайней мере, один раз на тестируемую группу).

(c) температуры и влажности, по возможности непрерывно.

Во время и после воздействия наблюдения проводятся и систематически записываются; Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня. Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры для минимизации потерь животных в ходе исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных.

Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз, слизистых оболочек, органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервной систем, а также соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделить наблюдению за дыхательным поведением, тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее. Индивидуальный вес животных следует определять еженедельно после заражения и в момент смерти.

Животных, погибших во время испытания, и животных, выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию с особым вниманием к любым изменениям в верхних и нижних дыхательных путях. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

2. ДАННЫЕ

Данные должны быть обобщены в табличной форме, показывающей для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Изменения веса необходимо рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. Животные, убитые гуманным способом из-за страданий и боли, связанных с соединением, регистрируются как смерть, связанная с соединением. LC50 следует определять признанным методом. Оценка данных должна включать взаимосвязь, если таковая имеется, между воздействием на животное испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.;

- условия испытаний: описание аппарата для воздействия, включая конструкцию, тип, размеры, источник воздуха, систему генерации аэрозолей, метод кондиционирования воздуха и метод содержания животных в испытательной камере, когда он используется. Должно быть описано оборудование для измерения температуры, влажности, концентрации аэрозолей и гранулометрического состава.

Данные о воздействии

Они должны быть сведены в таблицу и представлены со средними значениями и мерой изменчивости (например, стандартное отклонение) и должны, если возможно, включать:

(а) скорости потока воздуха через ингаляционное оборудование;

б) температура и влажность воздуха;

(c) номинальные концентрации (общее количество испытуемого вещества, подаваемого в ингаляционное оборудование, разделенное на объем воздуха);

(d) характер транспортного средства, если оно используется;

(д) фактические концентрации в зоне тестового дыхания;

f) массовый медианный аэродинамический диаметр (MMAD) и геометрическое стандартное отклонение (GSD);

(g) период равновесия;

(h) период воздействия;

- табулирование данных реакции по полу и уровню воздействия (т. е. количество животных, погибших или убитых во время испытания; количество животных, проявляющих признаки токсичности; количество животных, подвергшихся воздействию);

- время смерти во время или после воздействия, причины и критерии, использованные для гуманного умерщвления животных;

- все наблюдения;

- Значение ЛК50 для каждого пола, определенное в конце периода наблюдения (методом

расчет указан);

- 95 % доверительный интервал для LC50 (если это возможно);

- кривая дозы/смертности и наклон (если это допускается методом определения);

- результаты вскрытия;

- любые гистопатологические данные;

- обсуждение результатов (особое внимание следует уделить тому, какое влияние может оказать гуманное умерщвление животных во время испытания на рассчитанное значение ЛК50);

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.3. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (КОЖНАЯ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Испытуемое вещество наносят на кожу градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных, по одной дозе на группу. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом. Дозирование тестируемых веществ способом, который, как известно, вызывает сильную боль и дискомфорт из-за разъедающих или раздражающих свойств, не требуется.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных клетках в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых взрослых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. Примерно за 24 часа до исследования шерсть на дорсальной части туловища животных следует удалить путем стрижки или бритья. При стрижке или бритье шерсти необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу, что может привести к изменению ее проницаемости. Не менее 10 % поверхности тела должно быть свободным для нанесения испытуемого вещества. При испытании твердых веществ, которые при необходимости можно измельчить в порошок, испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании носителя следует учитывать влияние носителя на проникновение испытуемого вещества в кожу. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Можно использовать взрослую крысу или кролика. Могут использоваться и другие виды, но их использование потребует обоснования. Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола в начале испытания диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

На каждом уровне дозы используют по меньшей мере 5 животных. Все они должны быть одного пола. Если используются самки, они должны быть нерожавшими и небеременными. Если имеется информация, демонстрирующая, что тот или иной пол значительно более чувствителен, животным этого пола следует давать дозу.

Примечание. При испытаниях на острую токсичность на животных более высокого порядка, чем грызуны, следует рассмотреть возможность использования меньших количеств. Дозы следует тщательно подбирать и прилагать все усилия, чтобы не превышать умеренно токсичные дозы. При таких испытаниях следует избегать введения смертельных доз испытуемого вещества.

1.6.2.3. Уровни доз

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. При принятии решения об уровне дозы следует учитывать любые раздражающие или разъедающие эффекты. Данных должно быть достаточно для построения кривой «доза/реакция» и, где это возможно, для приемлемого определения LD50.

1.6.2.4. Предельный тест

Предельное испытание при одном уровне дозы, составляющем по меньшей мере 2000 мг/кг массы тела, может быть проведено на группе из 5 самцов и 5 самок животных с использованием описанных выше процедур. Если будет получена информация о смертности, связанной с соединением, возможно, потребуется рассмотреть возможность проведения полного исследования.

1.6.2.5. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Следует определять токсические реакции, скорость их возникновения и длительность восстановительного периода; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, их продолжительность и время наступления смерти, особенно если имеется тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Испытуемое вещество следует наносить равномерно на площадь, составляющую примерно 10 % общей площади поверхности тела. В случае высокотоксичных веществ площадь покрытия может быть меньше, но большая часть площади должна быть покрыта как можно более тонким и равномерным слоем.

Исследуемые вещества следует удерживать в контакте с кожей с помощью пористой марлевой повязки и нераздражающей ленты в течение 24-часового периода воздействия. Место проведения испытаний должно быть дополнительно накрыто соответствующим образом, чтобы сохранить марлевую повязку и испытуемое вещество и гарантировать, что животные не смогут проглотить испытуемое вещество. Для предотвращения проглатывания тестируемого вещества можно использовать ограничители, но полная иммобилизация не является рекомендуемым методом.

В конце периода воздействия остатки испытуемого вещества следует удалить, если это практически возможно, с помощью воды или другого подходящего метода очистки кожи.

Наблюдения следует систематически фиксировать по мере их проведения. Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня. Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры, чтобы свести к минимуму потери животных для исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных.

Наблюдения должны включать изменения шерсти, обработанной кожи, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, а также соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделить наблюдениям за тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее. Животных, погибших во время испытания и выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

Оценка токсичности у представителей другого пола

После завершения исследования у одного пола, по крайней мере, одной группе из 5 животных другого пола вводят дозу, чтобы установить, что животные этого пола не являются заметно более чувствительными к тестируемому веществу. Использование меньшего количества животных может быть оправдано в индивидуальных обстоятельствах. При наличии достаточной информации, подтверждающей, что животные испытуемого пола заметно более чувствительны, можно обойтись без тестирования на животных другого пола.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, указав для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Индивидуальный вес животных следует определять и фиксировать незадолго до применения тестируемого вещества, затем еженедельно и в случае смерти; изменения веса следует рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. Животные

которые были гуманно убиты из-за страданий и боли, связанных с соединениями, регистрируются как смерти, связанные с соединениями. LD50 следует определять признанным методом.

Оценка данных должна включать оценку взаимосвязей, если таковые имеются, между воздействием на животное испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсикологические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.;

- условия проведения испытаний (в том числе способ очистки кожи и тип повязки: окклюзионная или неокклюзионная);

- уровни доз (в зависимости от носителя, если он используется, и концентрации),

- пол дозируемых животных;

- табулирование данных ответа по полу и уровню дозы (т. е. количество животных, погибших или убитых во время испытания; количество животных, проявляющих признаки токсичности; количество животных, подвергшихся воздействию);

- время смерти после введения дозы, причины и критерии гуманного умерщвления животных;

- все наблюдения;

- значение ЛД50 для пола, подвергнутого полному исследованию, определенное через 14 дней с указанным методом определения;

- 95 % доверительный интервал для LD50 (если это возможно);

- кривая дозы/смертности и наклон, если это допускается методом определения;

- результаты вскрытия;

- любые гистопатологические данные;

- результаты любого теста на другой пол;

- обсуждение результатов (особое внимание следует уделить тому, какое влияние может оказать гуманное умерщвление животных в ходе испытания на рассчитанное значение ЛД50);

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.4. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (РАЗДРАЖЕНИЕ КОЖИ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Первоначальные соображения

Необходимо тщательно рассмотреть всю доступную информацию о веществе, чтобы свести к минимуму тестирование веществ в условиях, которые могут вызвать серьезные реакции. Следующая информация может быть полезна при рассмотрении вопроса о целесообразности проведения полного теста, исследования на одном животном или отказа от дальнейшего тестирования.

и) Физико-химические свойства и химическая реакционная способность. Сильнокислые или щелочные вещества (например, с pH 2 или менее или 11,5 или выше) могут не требовать тестирования на первичное раздражение кожи, если можно ожидать коррозионных свойств. Также следует учитывать щелочной или кислотный резерв.

ii) Если имеются убедительные доказательства тяжелых эффектов в хорошо валидированных тестах in vitro, полное исследование может не потребоваться.

iii) Результаты исследований острой токсичности. Если испытание на острую токсичность кожным путем проводилось с веществом в предельной испытательной дозе (2000 мг/кг массы тела) и не наблюдалось раздражения кожи, дальнейшее тестирование на раздражение кожи может быть ненужным. Кроме того, нет необходимости в тестировании материалов, которые оказались высокотоксичными при попадании через кожу.

Испытуемое вещество наносят однократно на кожу нескольких экспериментальных животных, причем каждое животное служит своим контролем. Степень раздражения считывается и оценивается через определенный интервал, а затем описывается для полной оценки эффектов. Продолжительность наблюдений должна быть достаточной, чтобы полностью оценить обратимость наблюдаемых эффектов.

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Примерно за 24 часа до тестирования следует удалить шерсть со спинной части туловища животного путем стрижки или бритья.

При стрижке или бритье шерсти следует соблюдать осторожность, чтобы не поцарапать кожу. Следует использовать только животных со здоровой неповрежденной кожей.

Некоторые породы кроликов имеют густые островки волос, которые более заметны в определенное время года. Тестируемые вещества не следует наносить на эти зоны густого роста волос.

При испытании твердых веществ (которые при необходимости можно измельчить в порошок) испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании транспортных средств следует учитывать влияние транспортного средства на раздражение кожи испытуемым веществом. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Хотя можно использовать несколько видов млекопитающих, предпочтительным видом является кролик-альбинос.

1.6.2.2. Количество животных

Если на основе результатов скрининга in vitro или других соображений есть подозрение, что вещество может вызывать некроз (т. е. быть коррозионным), следует рассмотреть возможность проведения испытания на одном животном. Если результаты этого испытания не указывают на коррозионную активность, испытание следует завершить с использованием как минимум двух дополнительных животных.

Для полного испытания используют не менее трех здоровых взрослых животных. Для необработанной контрольной группы отдельные животные не требуются. Для уточнения двусмысленных ответов могут потребоваться дополнительные животные.

1.6.2.3. Уровень дозы

При отсутствии противопоказаний на место исследования наносят 0,5 мл жидкости или 0,5 г твердого или полутвердого вещества. Соседние участки необработанной кожи каждого животного служат контролем в тесте.

1.6.2.4. Период наблюдения

Продолжительность периода наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Этого должно быть достаточно, чтобы полностью оценить обратимость или необратимость наблюдаемых эффектов, но обычно не требуется более 14 дней после применения.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Тестируемое вещество следует нанести на небольшой участок кожи (около 6 см2) и накрыть марлевым пластырем, который удерживается нераздражающей лентой. В случае жидкостей или некоторых паст может оказаться необходимым нанести испытуемое вещество на марлевый пластырь, а затем нанести его на кожу. Пластырь должен свободно прилегать к коже с помощью подходящей окклюзионной или полуокклюзионной повязки на протяжении всего периода воздействия. Следует предотвратить доступ животного к пластырю и последующее проглатывание/вдыхание тестируемого вещества.

В конце периода воздействия остаточное испытуемое вещество следует удалить, если это практически возможно, с использованием воды или соответствующего растворителя, не изменяя существующую реакцию или целостность эпидермиса.

Продолжительность воздействия обычно составляет четыре часа. Если есть подозрение, что вещество может вызывать некроз (т.е. быть коррозионным), продолжительность воздействия следует сократить (например, до одного часа или трех минут). В таком тестировании в первую очередь можно также использовать одно животное, и, если не препятствует острая кожная токсичность тестируемого соединения, на это животное можно одновременно наносить три пластыря. Первый пластырь удаляется через три минуты. Если серьезной кожной реакции не наблюдается, второй пластырь удаляют через час. Если наблюдения на этом этапе показывают, что четырехчасовое воздействие необходимо и может быть проведено гуманно, третий пластырь удаляется через четыре часа и реакции оцениваются. В этом случае (т. е. когда возможно четырехчасовое воздействие) испытание следует завершить с использованием как минимум двух дополнительных животных, если только это не считается гуманным (например, если после четырехчасового воздействия наблюдается некроз) .

Если через три минуты или через час наблюдается серьезная кожная реакция (например, некроз), тест немедленно прекращают.

Более длительная экспозиция может быть показана при определенных условиях, например. ожидаемый характер использования и воздействия на человека.

1.6.3.1. Наблюдение и оценка

За животными следует наблюдать на предмет появления признаков эритемы и отека, а степень реакции оценивать через 60 минут, а затем через 24, 48 и 72 часа после удаления пластыря. Раздражение кожи классифицируют и регистрируют в соответствии с системой, приведенной в таблице 1. Могут потребоваться дальнейшие наблюдения, если обратимость не будет полностью установлена ​​в течение 72 часов. Помимо наблюдения за раздражением, необходимо подробно описать любые серьезные поражения, такие как коррозия (необратимое разрушение тканей кожи) и другие токсические эффекты.

Такие методы, как гистопатологическое исследование или измерение толщины кожных складок, могут использоваться для уточнения сомнительных реакций или ответов, маскируемых окрашиванием кожи тестируемым веществом.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого отдельного животного степень раздражения эритемы и отека на протяжении всего периода наблюдения. Следует фиксировать любые серьезные повреждения, описание степени и характера раздражения, обратимости или коррозии, а также любого другого наблюдаемого токсического эффекта.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.;

- условия проведения испытаний (в том числе соответствующие физико-химические свойства химического вещества, методика подготовки и очистки кожи, тип повязки: окклюзионная или полуокклюзионная);

- табулирование данных реакции раздражения для каждого отдельного животного для каждого периода наблюдения (например, 1, 24, 48 и 72 часа и т. д. после удаления пластыря);

- описание любых обнаруженных серьезных повреждений, включая коррозию;

- описание степени и характера наблюдаемого раздражения и любых гистопатологических данных;

- описание любых токсических эффектов, кроме раздражения кожи;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Приложение

Б.5. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (РАЗДРАЖЕНИЕ ГЛАЗ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Первоначальные соображения

Необходимо тщательно рассмотреть всю доступную информацию о веществе, чтобы свести к минимуму тестирование веществ в условиях, которые могут вызвать серьезные реакции. В этом отношении может оказаться полезной следующая информация.

и) Физико-химические свойства и химическая реакционная способность. Сильнокислые или щелочные вещества, которые, например, могут привести к повышению pH в глазу до 2 или менее или 11,5 или выше, могут не требовать тестирования, если можно ожидать серьезных поражений. Также следует учитывать щелочной или кислотный резерв.

ii) Результаты хорошо проверенных альтернативных исследований; материалы, которые, как было доказано, обладают потенциальными коррозионными или сильными раздражающими свойствами, не должны подвергаться дальнейшим испытаниям на раздражение глаз, поскольку предполагается, что такие вещества окажут серьезное воздействие на глаза при испытании с использованием этого метода.

iii) Результаты исследований раздражения кожи. Материалы, которые продемонстрировали явное разъедающее или сильное раздражение кожи в ходе исследования раздражения кожи, не должны подвергаться дальнейшим испытаниям на предмет раздражения глаз, поскольку предполагается, что такие вещества могут оказывать серьезное воздействие на глаза.

Испытуемое вещество наносят однократно на один из глаз каждому из нескольких подопытных животных; необработанный глаз используется для предоставления контрольной информации. Степень раздражения оценивается и классифицируется через определенные промежутки времени и далее описывается для обеспечения полной оценки эффектов. Продолжительность наблюдений должна быть достаточной, чтобы полностью оценить обратимость или необратимость наблюдаемых эффектов.

Животных, демонстрирующих серьезные и стойкие признаки страдания и боли, возможно, придется умертвить гуманным способом.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Оба глаза каждого экспериментального животного, предварительно отобранного для тестирования, должны быть осмотрены в течение 24 часов до начала тестирования. Не следует использовать животных с раздражением глаз, дефектами глаз или уже имеющимся повреждением роговицы.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Хотя использовались различные экспериментальные животные, рекомендуется проводить тестирование на здоровых взрослых кроликах-альбиносах.

1.6.2.2. Количество животных

Если ожидаются заметные эффекты, следует рассмотреть возможность проведения испытаний на одном животном. Если результаты этого теста на одном кролике свидетельствуют о том, что вещество оказывает сильное раздражающее (обратимое действие) или разъедающее (необратимое действие) глаз при использовании описанной процедуры, дальнейшее тестирование на раздражающее действие на глаза у последующих животных может не потребоваться. Иногда для изучения конкретных аспектов может оказаться целесообразным дальнейшее тестирование на дополнительных животных.

В других случаях, кроме испытания на одном животном, следует использовать как минимум 3 животных. Для уточнения двусмысленных ответов могут потребоваться дополнительные животные.

1.6.2.3. Уровень дозы

Для тестирования жидкостей используют дозу 0,1 мл. При тестировании твердых веществ, паст и твердых частиц объем используемого вещества должен составлять 0,1 мл или весить примерно 0,1 г (вес всегда должен записываться). Если испытуемый материал твердый или гранулированный, его следует измельчить до мелкой пыли. Объем частиц следует измерять после их осторожного уплотнения, например постукивая по мерному контейнеру.

Для веществ, содержащихся в помповых спреях или аэрозольных контейнерах под давлением, жидкость следует вытеснить, собрать 0,1 мл и закапать в глаз, как описано для жидкостей.

1.6.2.4. Период наблюдения

Продолжительность периода наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Этого должно быть достаточно для оценки обратимости или необратимости наблюдаемых эффектов, но обычно не требуется более 21 дня после закапывания.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Тестируемое вещество следует поместить в конъюнктивальный мешок одного глаза каждого животного, осторожно оттянув нижнее веко от глазного яблока. Затем крышки осторожно удерживают вместе в течение примерно одной секунды, чтобы предотвратить потерю материала. Другой глаз, который остается необработанным, служит контролем.

Если предполагается, что вещество может вызвать необоснованную боль, перед закапыванием испытуемого вещества можно использовать местный анестетик. Тип, концентрацию и время применения местного анестетика следует выбирать тщательно, чтобы гарантировать отсутствие существенных различий в реакции на испытуемое вещество в результате его использования. Контрольный глаз должен быть подвергнут аналогичной анестезии.

Глаза подопытных животных не следует промывать в течение 24 часов после закапывания тестируемого вещества. Если это будет сочтено целесообразным, через 24 часа можно использовать промывание.

Для некоторых веществ, которые, как показал этот тест, вызывают раздражение, могут быть показаны дополнительные испытания на кроликах с промытыми глазами вскоре после закапывания вещества. В этих случаях рекомендуется использовать трех кроликов. Через полминуты после закапывания глаза кроликам в течение полуминуты промывают с таким объемом и скоростью потока, которые не вызывают травм.

1.6.3.1. Наблюдение и оценка

Глаза следует осматривать через 1, 24, 48 и 72 часа. Если через 72 часа нет признаков поражения глаз, исследование можно прекратить.

Расширенное наблюдение может быть необходимо, если наблюдается стойкое поражение роговицы или другое раздражение глаз, чтобы определить прогресс поражений и их обратимость или необратимость. В дополнение к наблюдениям за роговицей, радужной оболочкой и конъюнктивой следует регистрировать и сообщать о любых других выявленных поражениях. При каждом осмотре следует фиксировать степень глазной реакции (таблица). (Оценка реакции глаз может интерпретироваться по-разному. В помощь испытательным лабораториям и лицам, участвующим в проведении и интерпретации наблюдений, можно использовать иллюстрированное руководство по раздражению глаз.)

Исследование реакций можно облегчить с помощью бинокулярной лупы, ручной щелевой лампы, биомикроскопа или другого подходящего устройства. После записи наблюдений через 24 часа глаза любого или всех кроликов можно дополнительно обследовать с помощью флуоресцеина.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого отдельного животного степень раздражения в назначенное время наблюдения. Необходимо сообщить описание степени и характера раздражения, наличия серьезных поражений и любых наблюдавшихся эффектов, кроме глазных.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- данные о животных (вид, порода, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.);

- условия испытаний (включая соответствующие физико-химические свойства испытуемого вещества);

- табулирование данных о раздражающей/разъедающей реакции для каждого отдельного животного в каждый момент времени наблюдения (например, 1, 24, 48 и 72 часа);

- описание любых обнаруженных серьезных поражений;

- описательное описание степени и характера наблюдаемого раздражения или коррозии, включая пораженную область роговицы, а также обратимость;

- описание метода, используемого для оценки раздражения через 1, 24, 48 и 72 часа (например, ручная щелевая лампа, биомикроскоп, флуоресцеин);

- описание любых отмеченных неглазных местных эффектов;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Приложение

Б.6. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КОЖИ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Примечания:

Чувствительность и способность тестов выявлять потенциальные сенсибилизаторы кожи человека считаются важными в системе классификации токсичности, имеющей отношение к общественному здравоохранению.

Не существует единого метода испытаний, который бы адекватно идентифицировал все вещества, способные вызывать сенсибилизацию кожи человека, и который был бы применим ко всем веществам.

При выборе теста необходимо учитывать такие факторы, как физические характеристики вещества, включая его способность проникать через кожу.

Тесты с использованием морских свинок можно подразделить на тесты адъювантного типа, в которых аллергическое состояние усиливается путем растворения или суспендирования тестируемого вещества в полном адъюванте Фрейнда (FCA), и неадъювантные тесты.

Тесты адъювантного типа, вероятно, будут более точными в прогнозировании вероятного сенсибилизирующего эффекта вещества на кожу у людей, чем те методы, в которых не используется полный адъювант Фрейнда, и поэтому являются предпочтительными методами.

Максимизационный тест на морских свинках (GPMT) представляет собой широко используемый тест адъювантного типа. Хотя для обнаружения способности вещества провоцировать реакцию сенсибилизации кожи можно использовать несколько других методов, предпочтительным адъювантным методом считается GPMT.

Для многих химических классов неадъювантные тесты (предпочтительным является тест Бюлера) считаются менее чувствительными.

В некоторых случаях могут быть веские причины для выбора теста Бюлера, включающего местное применение, а не внутрикожную инъекцию, используемую в тесте максимизации на морских свинках. При использовании теста Бюлера должно быть дано научное обоснование.

В этом методе описаны тест максимизации морских свинок (GPMT) и тест Бюлера. Могут использоваться и другие методы при условии, что они проверены и имеют научное обоснование.

Независимо от используемых методов, чувствительность штамма морских свинок, используемого для тестирования кожной сенсибилизации, необходимо проверять через регулярные промежутки времени (шесть месяцев) с использованием известного сенсибилизатора от легкой до умеренной степени и при достаточном количестве полученных положительных ответов.

См. также «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Рекомендуются следующие вещества, разбавленные при необходимости, а также любое другое сенсибилизирующее вещество, известное из литературы или принадлежащее к группе испытуемого вещества.

- п-фенилендиамин CAS N 106-50-3

- 2,4-динитрохлорбензолCAS N 97-00-7

- дихромат калия CAS NO 7778-50-9

- неомицина сульфат CAS NO 1405-10-3

- сульфат никеля CAS N 7786-81-4

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

После первоначального воздействия тестируемого вещества (период «индукции») животных подвергают примерно через две недели после последнего индукционного воздействия «пробному» воздействию тестируемого вещества, чтобы установить, было ли вызвано состояние гиперчувствительности. Сенсибилизацию определяют путем изучения реакции кожи на воздействие возбудителя.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ ИСПЫТАНИЙ

1.6.1. Максимизационный тест на морских свинках (GPMT)

1.6.1.1. Препараты

Здоровых молодых морских свинок-альбиносов рандомизируют и распределяют в экспериментальную и контрольную группы. Перед введением дозы волосы удаляют путем стрижки или бритья в области плеч. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу.

1.6.1.2. Условия испытаний

1.6.1.2.1. Экспериментальные животные

Используются обычно используемые лабораторные линии морских свинок-альбиносов массой менее 500 г.

1.6.1.2.2. Число и пол

Могут быть использованы самцы и/или самки животных. Если используются самки, они должны быть нерожавшими и небеременными. В обработанной группе используют минимум 10 животных и в контрольной группе минимум 5 животных. Использование меньшего количества животных должно быть оправдано. В случае сомнительных результатов гистопатологическое исследование может помочь решить, следует ли повторить тест с использованием другой группы животных.

Если невозможно сделать окончательный вывод о том, является ли испытуемое вещество сенсибилизатором или нет, рекомендуется провести тестирование на дополнительных животных, чтобы в общей сложности получить не менее 20 тестируемых и 10 контрольных животных.

1.6.1.2.3. Уровни доз

Концентрацию тестируемого вещества доводят до уровня, который вызывает некоторое раздражение кожи, но который хорошо переносится животными на каждой стадии индукции.

Концентрация заражения должна быть максимальной, при которой не возникает признаков раздражения кожи у несенсибилизированных животных.

Эти концентрации могут быть определены в ходе небольшого пилотного исследования (два-три животных).

1.6.1.2.4. Период наблюдения

Во время индукционного периода проводятся наблюдения для выявления возможных раздражающих эффектов. После воздействия заражения кожные реакции регистрируют через 24 и 48 часов после удаления пластыря.

1.6.1.3. Процедура

Животных взвешивают перед началом испытания и в конце испытания. Плечевая область очищается от волос. В процедуре есть два этапа:

1.6.1.3.1. Индукция

День 0 – обработанная группа

В область плеч вводят следующие пары внутрикожных инъекций по 0,1 мл каждая так, чтобы по одной из каждой пары располагались с каждой стороны от средней линии:

Для инъекций 1:0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (FCA), смешанного с водой или физиологическим раствором 1:1,

Введение 2:0,1 мл испытуемого вещества, при необходимости, в соответствующее транспортное средство.

Введение 3:0,1 мл испытуемого вещества в FCA.

При инъекции 3 водорастворимые вещества растворяют в 0,05 мл воды и 0,05 мл неразбавленного FCA. Если необходимо исследовать жирорастворимые или нерастворимые вещества, их смешивают с неразбавленным FCA.

При инъекции 3 конечная концентрация испытуемого вещества должна быть равна концентрации при инъекции 2.

Инъекции 1 и 2 вводятся близко друг к другу и ближе к голове, а 3 — в каудальную часть тестовой зоны.

День 0 – контрольная группа

Следующие пары внутрикожных инъекций вводятся в те же места, что и выше:

Для инъекций 1:0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (FCA), смешанного с водой или физиологическим раствором 1:1,

Инъекция 2:0,1 мл одного носителя,

Введение 3:0,1 мл раствора в FCA.

День 6. Контрольная и обработанная группы.

Если вещество не вызывает раздражения кожи, исследуемый участок после стрижки и/или бритья окрашивают 0,5 мл 10%-ного раствора лаурилсульфата натрия в вазелине, чтобы вызвать местное раздражение.

День 7 – обработанная группа

Тестируемая зона снова очищается от волос. Испытуемое вещество в подходящем носителе (выбор носителя должен быть обоснован; твердые вещества мелко измельчаются и помещаются в подходящий носитель; жидкости, если необходимо, можно наносить непосредственно) наносят на фильтровальную бумагу (2 × 4 см) и наносят. в зону тестирования и удерживали в контакте с окклюзионной повязкой в ​​течение 48 часов.

День 7 – контрольная группа

Тестируемая зона снова очищается от волос. Только носитель наносится аналогичным образом на тестовую зону и удерживается в контакте с помощью окклюзионной повязки в течение 48 часов.

1.6.1.3.2. Испытание

День 21

Бока обработанных и контрольных животных очищают от шерсти. Пластырь или камеру, содержащую тестируемое вещество, наносят на один бок обработанных животных, а пластырь или камеру с носителем только на другой бок.

Пластыри удерживаются в контакте с помощью окклюзионной повязки в течение 24 часов.

Контрольная группа подвергается такому же воздействию.

Дни 23 и 24

- через 21 час после снятия пластыря проблемное место очищается и при необходимости очищается от волос;

- через три часа (через 48 часов от начала заражения) наблюдают и регистрируют кожную реакцию,

- Через 24 часа после этого наблюдения проводят и записывают второе наблюдение (72 часа).

Для уточнения результатов, полученных в первой пробе, вторую пробу, если необходимо, с новой контрольной группой транспортного средства, следует рассмотреть примерно через неделю после первой.

1.6.1.3.3. Наблюдение и оценка

Все кожные реакции и любые необычные результаты, возникшие в результате процедур индукции и заражения, следует фиксировать и сообщать.

Такие методы, как гистопатологическое исследование или измерение толщины кожных складок, могут использоваться для уточнения сомнительных реакций или ответов, маскируемых окрашиванием кожи тестируемым веществом.

1.6.2. тест Бюлера

1.6.2.1. Препараты

Здоровых молодых морских свинок-альбиносов рандомизируют и распределяют в экспериментальную и контрольную группы. Перед введением дозы волосы удаляют путем стрижки и/или бритья с одной стороны. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу.

1.6.2.2. Условия испытаний

1.6.2.2.1. Экспериментальные животные

Используются обычно используемые лабораторные линии морских свинок-альбиносов массой менее 500 г.

1.6.2.2.2. Число и пол

Могут быть использованы самцы и/или самки животных. Если используются самки, они должны быть нерожавшими и небеременными. В обработанной группе используют по меньшей мере 20 животных и в контрольной группе по меньшей мере 10 животных. Использование меньшего количества животных должно быть оправдано. В случае сомнительных результатов гистопатологическое исследование может помочь решить, следует ли повторить тест с использованием другой группы животных.

1.6.2.2.3. Уровни доз

Для каждой стадии индукции концентрацию тестируемого вещества доводят до самого высокого уровня, который может хорошо переноситься системно и который, в случае раздражающих веществ, вызывает легкое или умеренное раздражение у большинства подопытных животных. Концентрация заражения должна быть максимальной, при которой не возникает признаков раздражения кожи у несенсибилизированных животных. Эти концентрации могут быть определены путем исследования небольшого масштаба (два-три животных).

1.6.2.2.4. Период наблюдения

Во время индукционного периода проводятся наблюдения за кожей для выявления раздражающих эффектов. После воздействия воздействия кожные реакции регистрируют через 24 и 48 часов после снятия пластыря, т.е. через 30 и 54 часа после начала аппликации.

1.6.2.3. Процедура

Животных взвешивают перед началом испытания и в конце испытания.

В процедуре есть два этапа:

1.6.2.3.1. Индукция

День 0 – обработанная группа

Один бок очищается от волос. 0,5 мл испытуемого вещества в подходящем носителе (выбор носителя должен быть обоснован; при необходимости можно наносить непосредственно жидкости) наносят на ватный диск. Его наносят на исследуемую область и удерживают на коже с помощью окклюзионной накладки или камеры и подходящей повязки в течение 6 часов.

День 0 – контрольная группа

Один бок очищается от волос. Транспортное средство применяется аналогичным образом только на испытательной площадке. Его контакт с кожей удерживается окклюзионной повязкой или подходящей повязкой в ​​течение 6 часов.

Дни 7 и 14

То же нанесение, что и в день 0, проводят на той же тестовой зоне (при необходимости очищенной от волос) в день 7 и в день 14.

1.6.2.3.2. Испытание

День 28

Другой бок обработанных и контрольных животных очищают от шерсти. Окклюзионный пластырь или камеру, содержащую 0,5 мл испытуемого вещества, накладывают в максимальной нераздражающей концентрации на заднюю часть бока обработанных животных. На переднюю часть бока также накладывают окклюзионную заплату или камеру, содержащую только носитель.

Окклюзионные пластыри удерживаются в контакте с помощью подходящей повязки в течение 6 часов.

Контрольная группа подвергается такому же воздействию.

Дни 29 и 30

- через 21 час после снятия пластыря проблемное место очищается и при необходимости очищается от волос;

- через три часа (через 30 часов от начала заражения) наблюдают и регистрируют кожную реакцию,

- Через 24 часа после этого наблюдения проводят и записывают второе наблюдение (54 часа).

1.6.2.3.3. Наблюдение и оценка

Все кожные реакции и любые необычные результаты, возникшие в результате процедур индукции и заражения, следует фиксировать и сообщать.

Такие методы, как гистопатологическое исследование или измерение толщины кожных складок, могут использоваться для уточнения сомнительных реакций или ответов, маскируемых окрашиванием кожи тестируемым веществом.

2. ДАННЫЕ (GPMT и тест Бюлера)

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого животного кожные реакции при каждом наблюдении.

3. ОТЧЕТНОСТЬ (GPMT и тест Бюлера)

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЙ (GPMT и тест Бюлера)

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- использованная линия морской свинки;

- условия испытаний, концентрации носителя и тестируемого вещества, используемые для индукции и провокации;

- количество, возраст и пол животных;

- индивидуальный вес животных в начале и в конце испытания;

- каждое наблюдение, сделанное на каждом животном, включая систему оценок, если она используется;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ (GPMT и тест Бюлера)

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.7. ПОВТОРНАЯ ДОЗА (28 ДНЕЙ) ТОКСИЧНОСТЬ (ПЕРОРАЛЬНО)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Исследуемое вещество вводят перорально, ежедневно, градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных по одной дозе на группу в течение 28 дней. В период введения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. Тестируемое вещество можно вводить с пищей, через зонд, в капсулах или с питьевой водой. Всем животным следует вводить дозы одним и тем же методом в течение всего экспериментального периода. Если для облегчения дозирования используются носитель или другие добавки, следует знать, что они не оказывают токсического действия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых животных, и в идеале введение препарата следует начинать до того, как крысам исполнится шесть недель, и в любом случае не старше восьми недель.

В начале исследования диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, количество животных следует увеличить на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно лечить высокими дозами в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным проявлением токсических эффектов в течение 14 дней после лечения. Также использовали сателлитную группу из 10 контрольных животных (по пять животных каждого пола).

1.6.2.3. Уровни доз

Следует использовать как минимум три уровня дозы и контроль. За исключением обработки испытуемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с субъектами испытуемой группы. Если для облегчения дозирования используется носитель, контрольной группе следует вводить носитель таким же образом, как и группам, получавшим лечение, и получать такое же количество носителя, как и группа с самым высоким уровнем дозы. Самый высокий уровень дозы должен приводить к токсическим эффектам, но приводить к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать каких-либо признаков токсичности.

Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать этот уровень. В идеале средний уровень дозы должен вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной дозы, уровни доз должны быть разнесены так, чтобы обеспечить градацию токсических эффектов. В группах с низким и средним уровнем смертности, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

Когда испытуемое вещество вводят в рацион, можно использовать либо постоянную пищевую концентрацию (млн или мг/кг пищи), либо постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного; должна быть указана используемая альтернатива. Для вещества, вводимого через зонд, дозу следует вводить в одно и то же время каждый день, а уровень дозы следует корректировать через определенные промежутки времени (еженедельно или раз в две недели), чтобы поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного.

1.6.2.4. Предельный тест

Если 28-дневное исследование, проведенное в соответствии с методом, подробно описанным ниже, при одном уровне дозы 1000 мг/кг массы тела в день или более высоком уровне дозы, связанном с возможным воздействием на человека, если это известно, не дает доказательств токсического воздействия , дальнейшее тестирование может не считаться необходимым. Для веществ с низкой токсичностью важно гарантировать, что при введении их в пищу количества и другие свойства исследуемого вещества не мешают нормальным потребностям в питании.

1.6.2.5 Период наблюдения

За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время их содержания.

начало, степень и продолжительность. Время смерти и время появления признаков токсичности и

исчезновение должно быть записано.

1.6.3. Процедура

Животным в идеале вводят тестируемое вещество семь дней в неделю в течение 28 дней. Животных в любой вспомогательной группе, запланированной для последующего наблюдения, следует содержать в течение следующих 14 дней без лечения для выявления выздоровления или сохранения токсических эффектов.

Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Еженедельно следует проводить измерения потребления пищи (и потребления воды, когда тестируемое вещество вводится с питьевой водой), а животных следует взвешивать еженедельно.

Регулярное наблюдение за животными необходимо для того, чтобы гарантировать, что животные, насколько это возможно, не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных и животных, испытывающих сильные страдания или боль, следует удалить, если их заметили, гуманно умертвить и подвергнуть вскрытию.

В конце периода испытаний необходимо провести следующее обследование для всех животных, включая контрольные:

1. гематологические данные, включающие по меньшей мере гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов и показатель свертываемости крови;

2. клиническая биохимия крови, включающая по крайней мере один параметр функции печени и почек: аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамат-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий билирубин и общий сывороточный белок.

Другие определения, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, глюкозу натощак, анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина, активности холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых эффектов.

1.6.3.1. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. По крайней мере, печень, почки, надпочечники и яички следует взвесить влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани (печень, почки, селезенка, яички, надпочечники, сердце и любые органы с грубыми поражениями или изменениями размеров) следует сохранить в подходящей среде для возможного будущего гистопатологического исследования.

1.6.3.2. Гистопатологическое исследование

В группе высоких доз и в контрольной группе гистологическое исследование следует проводить на сохранившихся органах и тканях. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в любой вспомогательной группе следует исследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.;

- условия испытаний;

- уровни доз (включая носитель, если он используется) и концентрации;

- данные о токсической реакции по полу и дозе;

- уровень отсутствия воздействия, если это возможно;

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до прекращения исследования;

- токсическое или иное воздействие;

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующее течение;

- данные о питании и массе тела;

- проведенные гематологические исследования и все результаты;

- проведенные клинические биохимические исследования и все результаты;

- результаты вскрытия;

- подробное описание всех гистопатологических находок;

- статистическая обработка результатов, где это необходимо;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.8. ПОВТОРНАЯ ДОЗА (28 ДНЕЙ) ТОКСИЧНОСТЬ (ИНГАЛЯЦИЯ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Полезно иметь предварительную информацию о гранулометрическом составе, давлении паров, температуре плавления, температуре кипения, температуре вспышки и взрывоопасности (если применимо) вещества. См. также Общее введение, часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Несколько групп экспериментальных животных ежедневно в течение определенного периода времени подвергаются воздействию тестируемого вещества в градуированных концентрациях, при этом на группу используется одна концентрация в течение 28 дней. Если транспортное средство используется для создания соответствующей концентрации испытуемого вещества в атмосфере, следует использовать контрольную группу транспортного средства. В период введения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют на необходимое количество групп. При необходимости к испытуемому веществу можно добавить подходящий носитель, чтобы обеспечить соответствующую концентрацию вещества в атмосфере. Если для облегчения дозирования используется носитель или другая добавка, следует знать, что они не оказывают токсического воздействия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых животных.

В начале исследования диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждой тестовой группы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, их количество должно быть увеличено на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно обрабатывать высокой концентрацией в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным появлением токсических эффектов в течение 14 дней после обработки. Также использовали сателлитную группу из 10 контрольных животных (по пять животных каждого пола).

1.6.2.3. Концентрация воздействия

Требуется как минимум три концентрации: контроль или контроль транспортного средства (соответствует концентрации транспортного средства на самом высоком уровне), если используется транспортное средство. За исключением обработки испытуемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с животными испытуемой группы. Самая высокая концентрация должна приводить к токсическим эффектам, но к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самая низкая концентрация не должна вызывать каких-либо признаков токсичности. Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, минимальная концентрация должна превышать это значение. В идеале промежуточная концентрация должна вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной концентрации, концентрации следует распределять так, чтобы обеспечить градацию токсического воздействия. В группах с низким и средним уровнем смертности, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

1.6.2.4. Время контакта

Продолжительность ежедневного воздействия должна составлять шесть часов, но могут потребоваться и другие периоды для удовлетворения особых требований.

1.6.2.5. Оборудование

Животных следует тестировать в ингаляционном оборудовании, предназначенном для поддержания динамического потока воздуха с частотой не менее 12 воздухообменов в час, чтобы обеспечить адекватное содержание кислорода и равномерное распределение атмосферы воздействия. Если используется камера, ее конструкция должна свести к минимуму скопление подопытных животных и максимально увеличить воздействие на них вдыхания тестируемого вещества. Как правило, для обеспечения стабильности атмосферы в камере общий «объем» подопытных животных не должен превышать 5 % объема испытательной камеры. Можно использовать оро-назальную экспозицию, только голову или индивидуальную экспозицию камеры всего тела; первые два сведут к минимуму использование других маршрутов.

1.6.2.6. Период наблюдения

Экспериментальных животных следует ежедневно наблюдать на предмет признаков токсичности в течение всего периода лечения и восстановления. Следует фиксировать время смерти и время появления и исчезновения признаков токсичности.

1.6.3. Процедура

Животных подвергают воздействию тестируемого вещества ежедневно, пять-семь дней в неделю, в течение 28 дней. Животные в любых вспомогательных группах, запланированных для последующего наблюдения, должны содержаться в течение следующих 14 дней без лечения для выявления восстановления или сохранения токсических эффектов. Температура, при которой проводится испытание, должна поддерживаться на уровне 22 ± 3°С.

В идеале относительная влажность должна поддерживаться в пределах от 30 до 70 %, но в некоторых случаях (например, при испытаниях некоторых аэрозолей) это может оказаться нецелесообразным. Поддержание небольшого отрицательного давления внутри камеры (менее 5 мм воды) предотвратит утечку испытуемого вещества в окружающую среду. Во время воздействия следует воздерживаться от еды и воды.

Следует использовать динамическую систему ингаляции с подходящей аналитической системой контроля концентрации. Для установления подходящих концентраций воздействия рекомендуется провести пробное испытание. Поток воздуха следует отрегулировать так, чтобы условия во всей камере экспонирования были однородными. Система должна обеспечивать максимально быстрое достижение стабильных условий воздействия.

Измерения или мониторинг следует проводить:

а) скорости воздушного потока (постоянно);

(b) фактической концентрации испытуемого вещества, измеренной в зоне дыхания. В течение периода ежедневного воздействия концентрация не должна изменяться более чем на ± 15 % от среднего значения. Однако в случае некоторых аэрозолей такой уровень контроля может оказаться недостижимым, и тогда будет приемлемым более широкий диапазон. В течение всего исследования ежедневные концентрации следует поддерживать настолько постоянными, насколько это практически возможно. Для аэрозолей необходимо проводить по крайней мере один анализ размера частиц для каждой испытуемой группы еженедельно;

(c) температуры и влажности, по возможности непрерывно.

Во время и после воздействия систематически проводятся наблюдения и протоколируются; Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время начала, их степень и продолжительность. Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз, слизистых оболочек, органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервной системы, соматомоторной активности и поведения. Измерения веса животных следует проводить еженедельно. Также рекомендуется еженедельно измерять потребление пищи. Необходимо регулярное наблюдение за животными, чтобы гарантировать, что животные не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных и животных, испытывающих сильные страдания или боль, следует удалить, если их заметили, гуманно умертвить и подвергнуть вскрытию.

В конце испытания всех животных, включая контрольную, необходимо провести следующие исследования:

(i) гематологические данные, включая, по меньшей мере, гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов и показатель свертываемости крови;

(ii) клиническая биохимия крови, включая по крайней мере один параметр функции печени и почек: сывороточная аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамат-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий измерения билирубина и общего белка сыворотки;

Другие определения, которые могут быть необходимы для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, анализ глюкозы натощак, липиды, гормоны, кислотно-щелочной баланс, метгемоглобин и активность холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых токсических эффектов.

1.6.3.1. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. По крайней мере, печень, почки, надпочечники, легкие и яички следует взвешивать влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани (дыхательные пути, печень, почки, селезенка, яички, надпочечники, сердце и любые органы с грубыми поражениями или изменениями размеров) следует сохранить в подходящей среде для возможного будущего гистопатологического исследования. Легкие следует извлечь неповрежденными, взвесить и обработать подходящим фиксатором, чтобы гарантировать сохранение структуры легких.

1.6.3.2. Гистопатологическое исследование

В группе с высокой концентрацией и в контроле(ях) гистологическое исследование следует проводить на сохранившихся органах и тканях. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в любых сателлитных группах следует исследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.;

- условия испытаний:

Описание устройства для воздействия, включая конструкцию, тип, размеры, источник воздуха, систему генерации аэрозолей, метод кондиционирования воздуха, обработку отработанного воздуха и метод содержания животных в испытательной камере, когда он используется. Должно быть описано оборудование для измерения температуры, влажности и, при необходимости, стабильности концентрации аэрозолей или распределения частиц по размерам.

Данные о воздействии:

Они должны быть сведены в таблицу и представлены со средними значениями и мерой изменчивости (например, стандартное отклонение) и должны, если возможно, включать:

а) скорости потока воздуха через ингаляционное оборудование;

б) температура и влажность воздуха;

в) номинальные концентрации (общее количество испытуемого вещества, подаваемого в ингаляционное оборудование, разделенное на объем воздуха);

г) характер транспортного средства, если оно используется;

д) фактические концентрации в зоне тестового дыхания;

f) массовый медианный аэродинамический диаметр (MMAD) и геометрическое стандартное отклонение (GSD);

- данные о токсической реакции по полу и концентрации;

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до прекращения исследования;

- описание токсических или иных эффектов; уровень отсутствия эффекта;

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующее течение;

- данные о питании и массе тела;

- проведенные гематологические исследования и их результаты;

- проведенные клинические биохимические исследования и их результаты;

- результаты вскрытия;

- подробное описание всех гистопатологических находок;

- статистическая обработка результатов, где это возможно;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.9. ПОВТОРНАЯ ДОЗА (28 ДНЕЙ) ТОКСИЧНОСТЬ (КОЖНАЯ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Испытуемое вещество наносят ежедневно на кожу градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных, по одной дозе на группу, в течение 28 дней. В период применения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют в экспериментальную и контрольную группы. Незадолго до тестирования у испытуемых животных состригают шерсть со спинной части туловища. Можно бриться, но его следует проводить примерно за 24 часа до исследования. Повторная стрижка или бритье обычно необходимы примерно с еженедельными интервалами. При стрижке или бритье шерсти следует соблюдать осторожность, чтобы не поцарапать кожу. Не менее 10 % площади поверхности тела должно быть свободным для нанесения испытуемого вещества. При определении площади, подлежащей очистке, и размеров укрытия следует учитывать вес животного. При испытании твердых веществ, которые при необходимости можно измельчить в порошок, испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными. Используется ежедневное применение пять-семь дней в неделю.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Можно использовать взрослую крысу, кролика или морскую свинку. Могут использоваться и другие виды, но их использование потребует обоснования.

В начале исследования диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов) со здоровой кожей. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, их количество должно быть увеличено на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно лечить высокими дозами в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным проявлением токсических эффектов в течение 14 дней после лечения. Также использовали сателлитную группу из 10 контрольных животных (по пять животных каждого пола).

1.6.2.3. Уровни доз

Требуется как минимум три уровня дозы для контроля или для контроля транспортного средства, если используется транспортное средство. Продолжительность воздействия должна составлять не менее шести часов в день. Применение тестируемого вещества следует производить в одно и то же время каждый день и корректировать с интервалами (еженедельно или раз в две недели), чтобы поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного. За исключением лечения тестируемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с субъектами тестируемой группы. Если для облегчения дозирования используется носитель, контрольная группа носителя должна получать дозу таким же образом, как и группы, получавшие лечение, и получать то же количество, что и группа с самым высоким уровнем дозы. Самый высокий уровень дозы должен приводить к токсическим эффектам, но приводить к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать каких-либо доказательств или токсичности. Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать этот уровень. В идеале промежуточный уровень дозы должен вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной дозы, уровни доз должны быть разнесены так, чтобы обеспечить градацию токсических эффектов. В группах низкой и средней тяжести, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

Если нанесение испытуемого вещества вызывает сильное раздражение кожи, его концентрацию следует снизить, что может привести к уменьшению или отсутствию других токсических эффектов при высоких дозах. Более того, если кожа сильно повреждена, может возникнуть необходимость прекратить исследование и провести новое исследование с более низкими концентрациями.

1.6.2.4. Предельный тест

Если предварительное исследование при уровне дозы 1000 мг/кг или более высоком уровне дозы, связанном с возможным воздействием на человека, если это известно, не оказывает токсических эффектов, дальнейшее тестирование может не считаться необходимым.

1.6.2.5. Период наблюдения

Экспериментальных животных следует ежедневно наблюдать на предмет признаков токсичности. Следует фиксировать время смерти и время появления и исчезновения признаков токсичности.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Животных обрабатывают тестируемым веществом, в идеале, семь дней в неделю в течение 28 дней. Животные в любых вспомогательных группах, запланированных для последующего наблюдения, должны содержаться в течение следующих 14 дней без лечения для выявления выздоровления или сохранения токсических эффектов. Время воздействия должно составлять не менее шести часов в день.

Испытуемое вещество следует наносить равномерно на площадь, составляющую примерно 10 % общей площади поверхности тела. В случае высокотоксичных веществ площадь покрытия может быть меньше, но как можно большая часть площади должна быть покрыта как можно более тонким и равномерным слоем.

Во время воздействия испытуемое вещество удерживается в контакте с кожей с помощью пористой марлевой повязки и нераздражающей ленты. Место проведения испытаний должно быть дополнительно накрыто соответствующим образом, чтобы сохранить марлевую повязку и испытуемое вещество и гарантировать, что животные не смогут проглотить испытуемое вещество. Для предотвращения проглатывания тестируемого вещества можно использовать ограничители, но полная иммобилизация не является рекомендуемым методом. В качестве альтернативы можно использовать «защитное устройство ошейника».

В конце периода воздействия остатки испытуемого вещества следует удалить, если это практически возможно, с помощью воды или другого подходящего метода очистки кожи.

За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время начала, их степень и продолжительность. Наблюдения должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Измерения веса животных следует проводить еженедельно. Также рекомендуется еженедельно измерять потребление пищи. Необходимо регулярное наблюдение за животными, чтобы гарантировать, что животные не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных и животных, испытывающих сильные страдания или боль, следует удалить, если их заметили, гуманно умертвить и подвергнуть вскрытию.

В конце испытания всех животных, включая контрольную, необходимо провести следующие исследования:

1) гематологические данные, включая, по меньшей мере, гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов и показатель свертываемости крови;

2) клиническая биохимия крови, включающая по крайней мере один параметр функции печени и почек: сывороточная аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамат-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий билирубин. и общий сывороточный белок;

Другие определения, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, глюкозу натощак, анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина и активности холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых эффектов.

1.6.4. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. По крайней мере, печень, почки, надпочечники и яички следует взвесить влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани, т. е. нормальная и обработанная кожа, печень, почки, селезенка, яички, надпочечники, сердце и органы-мишени (то есть те органы, в которых наблюдаются грубые повреждения или изменения в размерах), должны быть сохранены в подходящей среде для возможных будущих гистопатологических исследований. обследование.

1.6.5. Гистопатологическое исследование

В группе высоких доз и в контрольной группе следует проводить гистологическое исследование сохранившихся органов и тканей. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в вспомогательной группе следует обследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- данные о животных (вид, порода, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.);

- условия проведения исследования (в том числе вид повязки: окклюзионная или неокклюзионная);

- уровни доз (включая носитель, если он используется) и концентрации;

- уровень отсутствия воздействия, где это возможно;

- данные о токсической реакции по полу и дозе;

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до прекращения исследования;

- токсическое или иное воздействие;

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующее течение;

- данные о питании и массе тела;

- проведенные гематологические исследования и их результаты;

- проведенные клинические биохимические исследования и их результаты;

- результаты вскрытия;

- подробное описание всех гистопатологических находок;

- статистическая обработка результатов, где это возможно;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.10. МУТАГЕННОСТЬ (ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ТЕСТ «IN VITRO» НА МЛЕКОПИТАЮЩИХ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (C).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Цитогенетический тест in vitro представляет собой краткосрочный тест на мутагенность для выявления структурных хромосомных аберраций в культивируемых клетках млекопитающих. Могут быть использованы культуры установленных клеточных линий, а также первичные клеточные культуры. После воздействия тестируемых химикатов с соответствующей системой метаболической активации или без нее клеточные культуры обрабатывают ингибиторами веретена, такими как колхицин, для накопления клеток в метафазной стадии митоза (с-метафаза). Клетки собирают в подходящее время и готовят препараты хромосом. Препараты окрашивают и метафазные клетки анализируют на наличие хромосомных аномалий.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

1.6.1.1. Клетки

Используют устоявшиеся клеточные линии или культуры первичных клеток, например. Клетки китайского хомячка и лимфоциты человека. Тестируемые химикаты готовят в культуральной среде или растворяют в соответствующих носителях перед обработкой клеток.

1.6.1.2. Система метаболической активации

Клетки должны подвергаться воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора, полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты.

1.6.2. Условия испытаний

Количество культур:

Для каждой экспериментальной точки используют как минимум дублирующие культуры.

Использование отрицательного и положительного контроля:

Растворитель (если растворителем не является культуральная среда или вода), смесь для активации ферментов печени, смесь для активации ферментов печени и растворитель, а также необработанные контроли используются в качестве отрицательных контролей.

В каждый эксперимент включен положительный контроль; когда для активации тестируемого химического вещества используется смесь для активации ферментов печени, в качестве положительного контроля необходимо использовать соединение, о котором известно, что оно требует метаболической активации.

Уровень дозы:

Используют по меньшей мере три дозы тестируемого соединения в по меньшей мере одном логарифмическом диапазоне доз. Самая высокая доза должна подавлять митотическую активность примерно на 50 % или проявлять другие признаки цитотоксичности. Если испытуемое вещество не токсично, его следует протестировать до предела растворимости или до максимальной концентрации 5 мг/мл.

Условия культивирования:

Используются подходящая культуральная среда и условия инкубации (например, температура, используемые культуральные сосуды, концентрация CO2 и влажность).

1.6.3. Процедура

1.6.3.1. Подготовка культур

Установленные клеточные линии: Клетки получают из исходных культур (например, путем трипсинизации или стряхивания), высеивают в культуральные сосуды с соответствующей плотностью и инкубируют при 37°С.

Лимфоциты человека: гепаринизированную цельную кровь добавляют к культуральной среде, содержащей фитогемагглютинин, фетальную телячью сыворотку и антибиотики, и инкубируют при 37°С.

1.6.3.2. Обработка культур тестируемым соединением

(i) Лечение без смеси, активирующей ферменты печени

Все обработки должны, по возможности, охватывать как минимум период одного целого клеточного цикла, а схемы фиксации должны обеспечивать анализ первых после обработки митозов клеток, обработанных на разных стадиях цикла.

Когда обработка не охватывает длину одного целого клеточного цикла, время фиксации выбирают для отбора проб клеток, которые находятся на разных стадиях клеточного цикла во время лечения, то есть G1, S и G2.

Тестируемое химическое вещество добавляется в культуры устоявшихся клеточных линий, когда они находятся на экспоненциальной стадии роста. Культуры лимфоцитов человека обрабатывают, пока они находятся в полусинхронном состоянии.

(ii) Лечение смесью для активации ферментов печени. Для лечения тестируемое соединение в сочетании с системой активации должно присутствовать как можно дольше, не оказывая токсического воздействия на клетки. Если по причинам токсичности эта обработка не охватывает длину всего клеточного цикла, время фиксации выбирают для отбора проб клеток, которые находятся на разных стадиях клеточного цикла во время обработки, то есть G1, S и G2.

Сбор клеток:

Культуры клеток обрабатывают ингибитором веретена в течение соответствующего времени перед сбором. Каждую культуру собирают и обрабатывают отдельно для получения хромосом.

Необходимо как минимум два периода сбора урожая. Рекомендуется, чтобы один находился примерно на одном клеточном цикле, а другой позже. Это необходимо для того, чтобы охватить все стадии клеточного цикла и обеспечить задержку клеточного цикла.

1.6.3.3. Подготовка хромосом

Препараты хромосом включают гипотоническую обработку клеток, фиксацию, нанесение на предметные стекла и окрашивание.

Анализ:

На предмет хромосомных аберраций анализируют не менее 100 широко распространённых метафаз на культуру. Слайды кодируются перед анализом. В лимфоцитах человека анализируются только метафазы, содержащие 46 центромер.

В устоявшихся клеточных линиях анализируют только метафазы, содержащие ± 2 центромеры модального числа.

Кроме того, во время теста для каждого уровня дозы следует оценивать митотический индекс или, при необходимости, другие признаки цитотоксичности.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. Аберрации хроматидного типа (пробелы, разрывы, обмены), аберрации хромосомного типа (например, пробелы, разрывы, минуты, кольца, дицентрики, полицентрики) и количество аберрантных метафаз (включая пробелы и исключая их) перечислены отдельно для всех обработанных и контрольных групп. культуры.

Данные оцениваются соответствующими статистическими методами.

Результаты испытаний необходимо сравнить с одновременными отрицательными контролями.

Проводят как минимум два независимых эксперимента. Однако, если это может быть научно обосновано, одного эксперимента может быть достаточно. Второй эксперимент не обязательно проводить так же, как и первоначальный. Действительно, может быть предпочтительнее изменить определенные условия испытаний, чтобы получить более полезные данные.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- используемые клетки;

- условия испытаний: состав среды, концентрация CO2, температура инкубации, время инкубации, уровни доз, время обработки, продолжительность обработки и концентрация используемого ингибитора веретена, тип используемой смеси для активации ферментов печени, положительные и отрицательные контроли;

- количество клеточных культур;

- количество проанализированных метафаз (данные приводятся отдельно для каждой культуры);

- митотический индекс или другой признак цитотоксичности;

- тип и количество аберраций, приведенные отдельно для каждой обработанной и контрольной культуры, модальное число хромосом в используемых установленных клеточных линиях;

- статистическая оценка;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.11. МУТАГЕННОСТЬ (ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ТЕСТ «IN VIVO» КОСТНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ХРОМОСОМНЫЙ АНАЛИЗ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (C).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Этот цитогенетический тест in vivo представляет собой краткосрочный тест на мутагенность для выявления структурных хромосомных аберраций. Хромосомные аберрации обычно оцениваются в первых митозах после лечения. При химических мутагенах большинство вызываемых аберраций относятся к хроматидному типу.

В этом методе используются клетки костного мозга млекопитающих, которые подвергаются воздействию тестируемых химикатов соответствующими путями и умерщвляются через последовательные промежутки времени. Перед умерщвлением животных дополнительно обрабатывают ингибитором веретена, таким как колхицин, для накопления клеток на метафазоподобной стадии митоза (с-метафаза). Из клеток изготавливают высушенные на воздухе препараты хромосом, окрашивают их, а метафазы анализируют микроскопически на наличие хромосомных аберраций.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Испытуемые химикаты растворяются в физиологическом растворе. Если они нерастворимы, их растворяют или суспендируют в соответствующих носителях.

Используют свежеприготовленные растворы испытуемого соединения. Если для облегчения дозирования используется носитель, он не должен мешать тестируемому соединению или оказывать токсическое воздействие.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Используются виды грызунов, такие как крысы, мыши или китайские хомяки. Здоровые молодые взрослые животные рандомизируются и распределяются на экспериментальную и контрольную группы.

1.6.2.2. Число и пол

Используют не менее пяти самок и пяти самцов на экспериментальную и контрольную группы. Таким образом, 10 животных будут умерщвляться за период времени на группу, если в график экспериментов будет включено несколько испытаний после лечения.

Для группы положительного контроля достаточно одного времени отбора проб.

1.6.2.3. Путь введения

Тестируемые соединения обычно следует вводить только один раз. На основании токсикологической информации можно использовать повторную схему лечения. Однако схему повторного лечения можно применять только в том случае, если тестируемое соединение не оказывает цитотоксического действия на костный мозг. Обычными путями введения являются пероральные и внутрибрюшинные инъекции. Другие пути введения могут быть подходящими.

1.6.2.4. Использование отрицательного и положительного контроля.

Соединение, которое, как известно, вызывает хромосомные аберрации in vivo, используется в качестве положительного контроля, а группа отрицательного контроля (растворитель) также включается в план каждого эксперимента.

1.6.2.5. Уровень дозы

Для базового набора используют одну дозу тестируемого соединения, при этом доза представляет собой максимально переносимую дозу или дозу, вызывающую некоторые признаки цитотоксичности (например, частичное ингибирование митоза).

Для «нетоксичных» соединений максимальная (предельная) доза, которую необходимо изучить после однократного введения, составляет 2000 мг/кг массы тела.

Если применяется схема повторных доз, предельная доза составляет 1000 мг/кг массы тела в день.

Дополнительные уровни дозы могут использоваться, если это указано по научным соображениям.

Если тест используется в качестве метода проверки, необходимо использовать как минимум два дополнительных уровня дозы.

использоваться.

1.6.3. Процедура

Тест может быть выполнен двумя способами:

(i) Животных обрабатывают тестируемым соединением один раз в максимально переносимой дозе. В первом случае образцы берутся через 24 часа после обработки. Если на этом этапе результаты явно положительные, дальнейший отбор проб может не потребоваться. Однако, если результаты отрицательны или сомнительны, поскольку тестируемое химическое вещество может влиять на кинетику клеточного цикла, применяются один более ранний и один более поздний интервал отбора проб, равномерно распределенный в диапазоне от шести до 48 часов.

При использовании дополнительных уровней дозы образцы следует брать через особо чувствительные интервалы или, если это неизвестно, через 24 часа после лечения.

(ii) Если фармакокинетические и метаболические данные указывают на необходимость повторного лечения, можно использовать повторную дозировку, а образцы следует взять через шесть и 24 часа после последнего лечения.

Препарат костного мозга:

Перед умерщвлением животным внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу ингибитора веретена для получения адекватного количества клеток в c-метафазе. Костный мозг получают из обоих бедер свежеубитых животных путем промывания изотоническим раствором. После соответствующей гипотонической обработки клетки фиксируют, а затем распределяют по предметным стеклам. После высыхания на воздухе предметные стекла окрашиваются.

Анализ:

Слайды кодируются перед микроскопическим анализом. На одно животное анализируют не менее 50 хорошо распределенных метафаз с полным числом центромер на наличие структурных хромосомных аберраций. Дополнительно для каждого животного могут быть установлены митотические индексы.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. Аберрации типа хроматид и изохроматид (пробелы, разрывы, обмены) и митотические индексы, если они установлены, указаны отдельно для всех обработанных и контрольных животных. Также указаны средние числа и стандартные отклонения для каждой экспериментальной и контрольной группы. Данные оцениваются соответствующими статистическими методами.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, порода и возраст используемых животных;

- количество животных каждого пола в опытных и контрольных группах;

- условия испытаний: подробное описание лечения и графика отбора проб, уровни доз, продолжительность лечения и концентрация используемого ингибитора веретена;

- количество проанализированных метафаз на животное;

- митотические индексы, если они установлены;

- тип и количество отклонений указывают отдельно для каждого обработанного и контрольного животного;

- признаки токсичности в ходе исследования;

- статистическая оценка;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКА

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.12. МУТАГЕННОСТЬ (МИКРОНЯДЕРНЫЙ ТЕСТ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (C).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Микроядерный тест — это кратковременный тест in vivo на млекопитающих для выявления хромосомных повреждений или повреждения митотического аппарата химическими веществами. В основе этого анализа лежит увеличение количества микроядер в полихроматических эритроцитах обработанных животных по сравнению с контрольной группой.

Микроядра образуются из хромосомных фрагментов или целых хромосом, отстающих в митозе. Когда эритробласты превращаются в эритроциты, главное ядро ​​выбрасывается, а микроядро может сохраняться в цитоплазме. В этом тесте используются молодые полихроматические эритроциты костного мозга лабораторных млекопитающих, подвергшихся воздействию тестируемых веществ соответствующими путями. Костный мозг извлекают, готовят и окрашивают мазки. Полихроматические эритроциты оценивают по микроядрам под микроскопом и устанавливают соотношение полихроматических и нормохроматических эритроцитов.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

Испытуемые химикаты растворяют в изотоническом растворе. Если они нерастворимы, их растворяют или суспендируют в соответствующих носителях. Если используется носитель, он не должен мешать тестируемому соединению или оказывать токсическое воздействие. Обычно используют свежеприготовленные растворы тестируемого соединения.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Экспериментальные животные

Рекомендуется использовать мышей, но можно использовать и других млекопитающих. Здоровые молодые взрослые животные рандомизируются и распределяются на экспериментальную и контрольную группы.

1.6.2.2. Число и пол

Используют не менее пяти самок и пяти самцов на экспериментальную и контрольную группы. Таким образом, 10 животных будут умерщвляться за период времени на группу, если в график экспериментов будет включено несколько испытаний после лечения. Для группы положительного контроля достаточно одного времени отбора проб.

1.6.2.3. Путь введения

Тестируемые соединения обычно следует вводить только один раз. На основании токсикологической информации можно использовать повторную схему лечения. Однако схему повторного лечения можно применять только в том случае, если тестируемое соединение не оказывает цитотоксического действия на костный мозг. Обычными путями введения являются пероральные и внутрибрюшинные инъекции. Другие пути введения могут быть подходящими.

1.6.2.4. Использование отрицательного и положительного контроля.

В каждом эксперименте следует использовать как положительный, так и отрицательный (растворяющий) контроль.

1.6.2.5. Уровень дозы

В качестве базового набора используют одну дозу тестируемого соединения, при этом доза представляет собой максимально переносимую дозу или дозу, вызывающую некоторые признаки цитотоксичности, например изменением соотношения полихроматических и нормохроматических эритроцитов.

Для «нетоксичных» соединений максимальная (предельная) доза, которую необходимо изучить после однократного введения, составляет 2000 мг/кг массы тела.

Если применяется схема повторных доз, предельная доза составляет 1000 мг/кг массы тела в день.

Дополнительные уровни дозы могут использоваться, если это указано по научным соображениям.

Если тест используется в качестве метода проверки, следует использовать как минимум два дополнительных уровня дозы.

1.6.3. Процедура

Тест может быть выполнен двумя способами:

(i) Животных обрабатывают тестируемым соединением один раз. Время отбора проб должно совпадать с максимальным ответом анализа, который варьируется в зависимости от тестируемого соединения. Поэтому образцы костного мозга берут не менее двух раз, начиная не ранее, чем через 12 часов после лечения и не позднее 48 часов.

При использовании дополнительных уровней доз образцы следует брать в период максимальной чувствительности или, если это неизвестно, через 24 часа после лечения.

(ii) Если фармакокинетические и метаболические данные указывают на повторный график лечения, можно использовать повторную дозировку, а образцы следует взять один раз, не ранее, чем через 12 часов после последнего лечения.

Препарат костного мозга

Костный мозг получают из обеих бедренных костей свежеубитых животных путем промывки эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки осаждают центрифугированием и супернатант отбрасывают. Капли гомогенной клеточной суспензии наносят на предметные стекла и распределяют в виде мазка. После высыхания на воздухе предметные стекла окрашиваются.

Анализ:

Слайды кодируются перед микроскопическим анализом. На наличие микроядер подсчитывают не менее 1000 полихроматических эритроцитов на животное.

Соотношение нормохромных и полихромных эритроцитов определяют для каждого животного путем подсчета всего 1000 эритроцитов.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. При этом количество подсчитанных полихроматических эритроцитов, количество полихроматических эритроцитов с микроядрами и процент микроядерных клеток указаны отдельно для каждого подопытного и контрольного животного, а также соотношение нормохроматических и полихроматических эритроцитов. Также указаны средние числа и стандартные отклонения для каждой экспериментальной и контрольной группы. Перечисленные данные оценены соответствующими статистическими методами.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- вид, порода и возраст используемых животных;

- количество животных каждого пола в опытных и контрольных группах;

- условия испытаний: подробное описание режима обработки и графика отбора проб, уровни доз, данные о токсичности, отрицательный и положительный контроль;

- критерии оценки микроядер;

- взаимосвязь доза/эффект, когда это возможно;

- признаки токсичности в ходе исследования;

- статистическая оценка;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.13. МУТАГЕННОСТЬ (ESCHERICHIA COLI – АНАЛИЗ ОБРАТНОЙ МУТАЦИИ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (C).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИПЫ МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Система реверсии триптофана (trp) Escherichia coli представляет собой микробный анализ, измеряющий trp. реверсия trp+ химическими веществами, которые вызывают базовые изменения в геноме организма.

Бактерии подвергаются воздействию тестируемых химических веществ с метаболической активацией и без нее. После соответствующего периода инкубации на минимальной среде ревертантные колонии подсчитывают и сравнивают с количеством спонтанных ревертантов в необработанной контрольной культуре и/или контрольной культуре с растворителем.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

Для проведения анализа можно использовать следующие методы: (1) метод преинкубации; и (2) метод прямого включения, при котором бактерии и тестируемый агент смешивают в верхнем агаре и выливают на поверхность пластинки с селективным агаром.

1.6.1. Подготовка

1.6.1.1. Бактерии

Бактерии выращивают при 37°С до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста. Приблизительная плотность клеток должна составлять 108-109 клеток на миллилитр.

1.6.1.2. Метаболическая активация

Бактерии следует подвергать воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора, полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты.

1.6.2. Условия испытания

1.6.2.1. Тестовые штаммы

Следует использовать три штамма: WP2, WP2 uvr A и WP2 uvr A pKM 101. Должны использоваться признанные методы приготовления и хранения маточных культур. Необходимо проверить ростовые требования и генетическую идентичность штаммов, их чувствительность к УФ-излучению или митомицину С и устойчивость к ампициллину у штамма WP2 uvr A pKM 101. Штаммы также должны давать спонтанные ревертанты в ожидаемых диапазонах частот.

1.6.2.2. СМИ

Подходящую среду для экспрессии и отбора мутантов используют с соответствующим верхним агаром.

1.6.2.3. Использование отрицательного и положительного контроля.

Необходимо проводить одновременный контроль необработанных веществ и растворителей. Положительный контроль должен проводиться также для двух целей:

(i) Подтвердить чувствительность бактериальных штаммов.

Метилметансульфонат, оксид 4-нитрохинолина или этилнитрозомочевина могут использоваться в качестве положительного контроля для тестов без метаболической активации.

(ii) Обеспечить активность соответствующих метаболизирующих систем.

Положительным контролем активности одной метаболизирующей системы для всех штаммов является 2-аминоантрацен. Если возможно, следует использовать положительный контроль того же химического класса, что и испытуемое химическое вещество.

1.6.2.4. Количество тестируемого вещества на чашку

Испытывают не менее пяти различных количеств тестируемого химиката с полулогарифмическими интервалами между чашками. Вещества проверяются до предела растворимости или токсичности. О токсичности свидетельствует уменьшение количества спонтанных ревертантов, очистка фонового газона или степень выживаемости обработанных культур. Нетоксичные химические вещества следует проверять в концентрации 5 мг на чашку, прежде чем считать испытуемое вещество отрицательным.

1.6.2.5. Условия инкубации

Чашки инкубируют от 48 до 72 часов при 37°С.

1.6.3. Процедура

При методе прямого внесения в чашку без активации фермента к 2 мл верхнего агара добавляют химическое вещество и 0,1 мл свежей бактериальной культуры. Для тестов с метаболической активацией к агару после добавления тестируемого химиката и бактерий добавляют 0,5 мл смеси для активации ферментов печени, содержащей достаточное количество постмитохондриальной фракции. Содержимое каждой пробирки перемешивают и выливают на поверхность чашки с селективным агаром. Наложенному агару дают затвердеть и чашки инкубируют при 37°C в течение 48-72 часов. В конце инкубационного периода подсчитывают ревертантные колонии на чашке.

Для метода преинкубации смесь тестируемого химиката, 0,1 мл свежей бактериальной культуры и достаточного количества смеси для активации ферментов печени или такого же количества буфера предварительно инкубируют перед добавлением 2 мл верхнего агара. Все остальные процедуры такие же, как и для метода включения.

Все посевы для обоих методов выполняются как минимум в трех экземплярах.

2. ДАННЫЕ

Количество ревертантных колоний на чашку указывается как для контрольной, так и для обработанной серии. Необходимо представить подсчет отдельных чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартные отклонения для тестируемого химического вещества и контроля.

Данные следует оценивать с использованием соответствующих статистических методов.

Проводят как минимум два независимых эксперимента. Второй эксперимент не обязательно проводить так же, как и первоначальный. Действительно, может быть предпочтительнее изменить определенные условия испытаний, чтобы получить более полезные данные.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- бактерии, используемый штамм;

- условия испытаний: уровни доз, токсичность, состав сред; лечебные процедуры (преинкубация

инкубация); система метаболической активации; эталонные вещества, отрицательный контроль;

- индивидуальный подсчет чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку, стандартное отклонение, соотношение доза/эффект, если это возможно;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

Б.14. МУТАГЕННОСТЬ (SALMONELLA TYPHIMURIUM – АНАЛИЗ ОБРАТНОЙ МУТАЦИИ)

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

См. «Общее введение», часть B (C).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Никто.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Система реверсии гистидина Salmonella typhimurium (его) представляет собой микробный анализ, который измеряет его . his+ реверсия химическими веществами, которые вызывают замены оснований или мутации сдвига рамки считывания в геноме этого организма.

Бактерии подвергают воздействию тестируемых химикатов с метаболической активацией и без нее и высеивают на минимальную среду. После соответствующего периода инкубации ревертантные колонии подсчитывают и сравнивают с количеством спонтанных ревертантов в необработанной культуре и/или контрольной культуре с растворителем.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Никто.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Препараты

1.6.1.1. Бактерии

Свежие культуры бактерий выращивают при 37°С до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста. Приблизительная плотность клеток должна составлять от 108 до 109 клеток на миллилитр.

1.6.1.2. Метаболическая активация

Бактерии следует подвергать воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора, полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты.

1.6.2. Условия испытаний

1.6.2.1. Тестовые штаммы

Необходимо использовать как минимум четыре штамма ТА 1535, ТА 1537 или ТА 97, ТА 98 и ТА 100; Кроме того, можно использовать другие штаммы, такие как ТА 1538 и ТА 102. Должны использоваться признанные методы приготовления и хранения маточных культур. Необходимо проверить ростовые требования и генетическую идентичность штаммов, их чувствительность к УФ-излучению и кристаллическому фиолетовому, а также устойчивость к ампициллину. Штаммы также должны давать спонтанные ревертанты в ожидаемых диапазонах частот.

1.6.2.2. СМИ

Подходящую селективную среду используют с соответствующим верхним агаром.

1.6.2.3. Использование отрицательного и положительного контроля.

Необходимо проводить одновременный контроль необработанных веществ и растворителей. Положительный контроль должен проводиться также для двух целей:

(i) Подтвердить чувствительность бактериальных штаммов.

Следующие соединения могут использоваться для тестов без метаболической активации:

ШтаммыВозвращаются с

ТА 1535, ТА 100 Азид натрия

ТА 1538, ТА 98, ТА 972-нитрофлуорен

TA 15379-аминоакридины

ТА 102 гидропероксид кумола

(ii) Обеспечить активность соответствующей метаболизирующей системы.

Положительным контролем активности одной метаболизирующей системы для всех штаммов является 2-аминоантрацен. Если доступен положительный контроль того же химического класса, что и испытуемое химическое вещество, следует использовать его.

1.6.2.4. Количество испытуемого вещества на чашку Испытывают не менее пяти различных количеств испытуемого вещества с полулогарифмическими интервалами между чашками. Вещества проверяются до предела растворимости или токсичности. О токсичности свидетельствует уменьшение количества спонтанных ревертантов, очистка фонового газона или степень выживаемости обработанных культур. Нетоксичные химические вещества следует проверять в концентрации 5 мг на чашку, прежде чем считать испытуемое вещество отрицательным.

1.6.2.5. Условия инкубации

Планшеты инкубируют от 48 до 72 часов при температуре 37°С.

1.6.3. Процедура

Для метода прямого включения в чашку без активации фермента тестируемое вещество и 0,1 мл свежей бактериальной культуры добавляют к 2 мл агара верхнего слоя. Для тестов с метаболической активацией 0,5 мл смеси для активации ферментов печени, содержащей достаточное количество постмитохондриальной фракции, добавляют к агару после добавления тестируемого химиката и бактерий. Содержимое каждой пробирки перемешивают и выливают на поверхность чашки с селективным агаром. Наложенному агару дают затвердеть и чашки инкубируют при 37°C в течение 48–72 часов. В конце инкубационного периода подсчитывают ревертантные колонии на чашке. Для метода преинкубации смесь тестируемого химиката, 0,1 мл свежей бактериальной культуры и достаточного количества смеси для активации ферментов печени или такого же количества буфера предварительно инкубируют перед добавлением 2 мл агара верхнего слоя. Все остальные процедуры такие же, как и для метода прямого включения пластины.

Все посевы для обоих методов выполняются как минимум в трех экземплярах.

2. ДАННЫЕ

Количество ревертантных колоний на чашку указывается как для контрольной, так и для обработанной серии.

Необходимо представить подсчет отдельных чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение для тестируемого химического вещества и контроля.

Данные следует оценивать с использованием соответствующих статистических методов.

Проводят как минимум два независимых эксперимента. Второй эксперимент не обязательно проводить так же, как и первоначальный. Действительно, может быть предпочтительнее изменить определенные условия испытаний, чтобы получить более полезные данные.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

3.1. ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- бактерии, используемый штамм;

- условия испытаний: уровни доз, токсичность, состав сред, процедуры обработки.

(преинкубация, инкубация) система метаболической активации, вещества сравнения, отрицательный контроль;

- индивидуальный подсчет чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку, стандартное отклонение, соотношение доза/эффект, если это возможно;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (D).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (E).

ЧАСТЬ C: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИЧНОСТИ

С.1. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ДЛЯ РЫБ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью этого испытания является определение острой летальной токсичности вещества для рыб в пресной воде. Желательно иметь, насколько это возможно, информацию о растворимости в воде, давлении паров, химической стабильности, константах диссоциации и биоразлагаемости вещества, чтобы помочь в выборе наиболее подходящего метода испытаний (статического, полустатического или проточного). до) для обеспечения удовлетворительно постоянных концентраций испытуемого вещества в течение всего периода испытания.

Дополнительную информацию (например, структурную формулу, степень чистоты, природу и процентное содержание существенных примесей, наличие и количество добавок, а также коэффициент распределения н-октанол/вода) следует принимать во внимание как при планировании испытания, так и при интерпретации результатов. Результаты.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Острая токсичность – это заметное неблагоприятное воздействие, возникающее в организме в течение короткого времени (дней) воздействия вещества. В настоящем испытании острая токсичность выражается как медианная летальная концентрация (LC50), то есть концентрация в воде, при которой погибает 50 % исследуемой партии рыбы в течение непрерывного периода воздействия, который необходимо указать.

Все концентрации испытуемого вещества указаны по объему (миллиграммы на литр). Они также могут быть выражены в виде веса по весу (мг/кг 1).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонное вещество может быть протестировано как средство демонстрации того, что в условиях лабораторных испытаний реакция тестируемых видов существенно не изменилась.

Для этого теста указаны N эталонных веществ.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Предельное испытание может быть проведено при концентрации 100 мг на литр, чтобы продемонстрировать, что LC50 превышает эту концентрацию.

Рыб подвергают воздействию тестируемого вещества, добавляемого в воду в различных концентрациях, в течение 96 часов. Смертность регистрируется не реже, чем через 24-часовые интервалы, и там, где это возможно, рассчитываются концентрации, вызывающие гибель 50 % рыбы (LC50) в каждый момент наблюдения.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Критерии качества должны применяться как к предельному испытанию, так и к полному методу испытаний.

Смертность контрольных особей не должна превышать 10 % (или одной рыбы, если используется менее десяти особей) к концу испытания.

Концентрация растворенного кислорода должна была составлять более 60 % от значения насыщения воздуха.

Концентрации испытуемого вещества должны поддерживаться в пределах 80 % от первоначальных концентраций на протяжении всего испытания.

Для веществ, которые легко растворяются в испытательной среде, образуя стабильные растворы, т.е. такие, которые не будут в значительной степени улетучиваться, разлагаться, гидролизоваться или адсорбироваться, начальную концентрацию можно принять эквивалентной номинальной концентрации. Должны быть представлены доказательства того, что концентрации поддерживались на протяжении всего испытания и что критерии качества были удовлетворены.

Для веществ, которые:

(i) плохо растворяется в тестовой среде,

или

(ii) способны образовывать стабильные эмульсии или дисперсии,

или

(iii) нестабилен в водных растворах, за начальную концентрацию следует принимать концентрацию, измеренную в растворе (или, если это технически невозможно, измеренную в толще воды) в начале испытания. Концентрацию определяют после периода уравновешивания, но до помещения подопытной рыбы.

В любом из этих случаев во время испытания необходимо провести дополнительные измерения для подтверждения фактических концентраций воздействия или соответствия критериям качества.

Уровень pH не должен изменяться более чем на 1 единицу.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

Можно использовать три типа процедуры:

Статический тест:

Испытание на токсичность, при котором не происходит вытекания тестируемого раствора. (Решения остаются неизменными на протяжении всего теста.)

Полустатический тест:

Тестируйте без подачи тест-раствора, но с регулярным периодическим обновлением тест-растворов после длительных периодов времени (например, 24 часа).

Тест на проток:

Испытание на токсичность, при котором вода постоянно обновляется в испытательных камерах, при этом испытуемое химическое вещество транспортируется вместе с водой, используемой для обновления испытательной среды.

1.6.1. Реагенты

1.6.1.1. Растворы тестируемых веществ

Маточные растворы необходимой концентрации готовят растворением вещества в деионизированной воде или воде по 1.6.1.2.

Выбранные тестовые концентрации готовят путем разбавления исходного раствора. Если тестируются высокие концентрации, вещество можно растворить непосредственно в воде для разбавления.

Вещества обычно следует тестировать только до предела растворимости. Для некоторых веществ (например, веществ, имеющих низкую растворимость в воде или высокую Pow, или тех, которые образуют стабильную дисперсию, а не настоящий раствор в воде) допустимо проводить испытание в концентрации выше предела растворимости вещества, чтобы гарантировать, что максимально растворимый / получена стабильная концентрация. Однако важно, чтобы эта концентрация не нарушала работу тест-системы (например, пленка вещества на поверхности воды, препятствующая насыщению воды кислородом и т. д.).

Ультразвуковое диспергирование, органические растворители, эмульгаторы или диспергаторы могут использоваться в качестве вспомогательного средства для приготовления исходных растворов веществ с низкой растворимостью в воде или для диспергирования этих веществ в испытательной среде. При использовании таких вспомогательных веществ все тестовые концентрации должны содержать одинаковое количество вспомогательного вещества, а дополнительные контрольные рыбы должны подвергаться воздействию той же концентрации вспомогательного вещества, которая использовалась в серии испытаний. Концентрация таких вспомогательных веществ должна быть сведена к минимуму, но ни в коем случае не должна превышать 100 мг на литр исследуемой среды.

Тест следует проводить без корректировки pH. Если есть признаки заметного изменения pH, рекомендуется повторить тест с корректировкой pH и сообщить о результатах. В этом случае значение pH исходного раствора следует привести в соответствие со значением pH воды для разбавления, если только нет особых причин не делать этого. Для этой цели предпочтительны HCl и NaOH. Корректировку pH следует производить таким образом, чтобы концентрация испытуемого вещества в исходном растворе не менялась в сколько-нибудь существенной степени. Если корректировка вызвана какой-либо химической реакцией или физическим осаждением испытуемого соединения, об этом следует сообщить.

1.6.1.2. Вода для хранения и разбавления

Можно использовать питьевую воду (не загрязненную потенциально вредными концентрациями хлора, тяжелых металлов или других веществ), природную воду хорошего качества или восстановленную воду (см. Приложение I). Предпочтительны воды с общей жесткостью от 10 до 250 мг/л (по CaCO3) и pH от 6,0 до 8,5.

1.6.2. Аппарат

Вся аппаратура должна быть изготовлена ​​из химически инертного материала.

- автоматическая система разбавления (для проточного теста),

- кислородный метр,

- оборудование для определения жесткости воды,

- соответствующее оборудование для контроля температуры,

- pH-метр.

1.6.3. Тестовая рыба

Рыба должна быть здоровой и не иметь каких-либо видимых пороков развития.

Используемые виды следует выбирать на основе практических критериев, таких как их доступность в течение всего года, простота содержания, удобство проведения испытаний, относительная чувствительность к химикатам, а также любые экономические, биологические или экологические факторы, имеющие какое-либо значение. При выборе видов рыб также следует учитывать необходимость сопоставимости полученных данных и существующей международной гармонизации (ссылка 1).

Перечень видов рыб, рекомендуемых для проведения этого испытания, приведен в Приложении 2; Предпочтительными видами являются рыба-зебра и радужная форель.

1.6.3.1. Держа

Желательно, чтобы подопытная рыба происходила из одной популяции одинаковой длины и возраста. Рыбу необходимо содержать не менее 12 дней при следующих условиях:

загрузка: соответствует системе (рециркуляция или проточная) и виду рыбы, вода: см. 1.6.1.2,

свет: от 12 до 16 часов освещения ежедневно,

концентрация растворенного кислорода:

не менее 80 % значения воздухонасыщения,

кормление: три раза в неделю или ежедневно, прекращая за 24 часа до начала теста.

1.6.3.2. Смертность

После 48-часового периода адаптации регистрируются случаи смертности и применяются следующие критерии:

- более 10 % населения за семь дней:

отказ от всей партии,

- от 5 до 10 % населения:

период удержания продлился еще семь дней. Если новых случаев смертности не происходит, партия приемлема, в противном случае она должна быть забракована.

- менее 5 % населения:

прием партии.

1.6.4. Приспособление

Вся рыба должна подвергаться воздействию воды того качества и температуры, которые используются в тесте, в течение как минимум семи дней, прежде чем ее использовать.

1.6.5. Тестовая процедура

Тест по определению диапазона может предшествовать окончательному тесту, чтобы получить информацию о диапазоне концентраций, которые будут использоваться в основном тесте.

В дополнение к серии испытаний проводят один контроль без испытуемого вещества и, если необходимо, также один контроль, содержащий вспомогательное вещество.

В зависимости от физических и химических свойств испытуемого соединения следует выбирать статическое, полустатическое или проточное испытание, чтобы оно соответствовало критериям качества.

Рыбы подвергаются воздействию этого вещества, как описано ниже:

- продолжительность: 96 часов

- количество животных: не менее 7 на концентрацию,

- цистерны: подходящей вместимости в соответствии с рекомендуемой загрузкой,

- загрузка: рекомендуется максимальная загрузка 1 г на литр для статических и полустатических испытаний; для проточных систем допустима более высокая нагрузка,

- тестовая концентрация: не менее пяти концентраций, отличающихся постоянным коэффициентом, не превышающим 2,2, и, насколько это возможно, охватывающих диапазон от 0 до 100 % смертности,

- вода: см. 1.6.1.2,

- свет: от 12 до 16 часов освещения ежедневно,

- температура: соответствует виду (Приложение 2), но в пределах ± 1°С в рамках любого конкретного испытания,

- концентрация растворенного кислорода: не менее 60 % значения насыщения воздуха при выбранной температуре,

- кормление: нет.

Рыбу осматривают через первые 2–4 часа и не реже, чем через 24 часа. Рыбу считают мертвой, если прикосновение к хвостовому стеблю не вызывает реакции и не видно дыхательных движений. Мертвую рыбу удаляют при наблюдении и регистрируют смертность.

Ведутся записи о видимых отклонениях (например, потеря равновесия, изменения в плавательном поведении, дыхательной функции, пигментации и т. д.).

Измерения pH, растворенного кислорода и температуры необходимо проводить ежедневно.

Предельный тест

Используя процедуры, описанные в этом методе испытаний, можно провести предельное испытание при дозе 100 мг на

литр, чтобы продемонстрировать, что LC50 превышает эту концентрацию.

Если природа вещества такова, что концентрация 100 мг на литр в исследуемой воде не может быть достигнута, предельное испытание следует проводить при концентрации, равной растворимости вещества (или максимальной концентрации, образующей стабильную дисперсию). в используемой среде (см. также пункт 1.6.1.1).

Лимитный тест следует проводить с использованием от 7 до 10 рыб, и такое же количество в контроле(ах). (Биномиальная теория утверждает, что при использовании 10 рыб с нулевой смертностью существует 99,9% уверенность в том, что ЛК50 превышает концентрацию, использованную в предельном тесте. При использовании 7, 8 или 9 рыб отсутствие смертности обеспечивает не менее 99 % уверенности в том, что LC50 превышает используемую концентрацию.)

В случае смертности необходимо провести полное исследование. Если наблюдаются сублетальные эффекты, их следует зарегистрировать.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Для каждого периода, в течение которого записывались наблюдения (24, 48, 72 и 96 часов), нанесите на график логарифмической вероятности процентную смертность для каждого рекомендуемого периода воздействия в зависимости от концентрации.

Когда это возможно и для каждого времени наблюдения, LC50 и доверительные пределы (p = 0,05) следует оценивать с использованием стандартных процедур; эти значения следует округлить до одной, максимум до двух значащих цифр (примеры округления до двух цифр: 170 для 173,5; 0,13 для 0,127; 1,2 для 1,21).

В тех случаях, когда наклон кривой реакции концентрация/процент слишком крутой, чтобы можно было рассчитать LC50, графической оценки этого значения достаточно.

Когда две последовательные концентрации при соотношении 2,2 дают только 0 и 100% смертности, этих двух значений достаточно, чтобы указать диапазон, в пределах которого находится LC50.

Если замечено, что стабильность или гомогенность испытуемого вещества не могут быть сохранены, об этом следует сообщить и соблюдать осторожность при интерпретации результатов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- информация об исследуемой рыбе (научное название, штамм, поставщик, любая предварительная обработка, размер и количество, использованное в каждой тестируемой концентрации);

- источник разбавляющей воды и основные химические характеристики (pH, жесткость, температура);

- в случае вещества с низкой растворимостью в воде - метод приготовления исходного и испытуемого растворов;

- концентрация любых вспомогательных веществ;

- перечень использованных концентраций и любую имеющуюся информацию о стабильности концентраций испытуемого химического вещества в испытуемом растворе;

- если проводятся химические анализы, использованные методы и полученные результаты;

- результаты предельного испытания, если оно проводилось;

- причины выбора и подробности используемой процедуры испытания (например, статическая, полустатическая, скорость дозирования, скорость потока, аэрация, загрузка рыбы и т. д.);

- описание испытательного оборудования;

- режим освещения;

- концентрации растворенного кислорода, значения pH и температуры тестируемых растворов каждые 24 часа;

- доказательства того, что критерии качества были выполнены;

- таблица, показывающая кумулятивную смертность при каждой концентрации и контроль (и контроль со вспомогательным веществом, если необходимо) в каждый из рекомендуемых сроков наблюдения;

- график кривой реакции концентрация/процент в конце теста;

- если возможно, значения LC50 в каждый из рекомендуемых периодов наблюдения (с доверительным интервалом 95 %);

- статистические процедуры, используемые для определения значений ЛК50;

- если используется эталонное вещество, полученные результаты,

- самая высокая тестируемая концентрация, не вызывающая смертности в течение периода тестирования;

- самая низкая тестируемая концентрация, вызывающая 100 % смертность в течение периода тестирования.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 203, Решение Совета C(81) 30 окончательное и обновленные версии.

(2) AFNOR - Определение острой токсичности вещества для Brachydanio rerio - Статические и проточные методы - NFT 90-303, июнь 1985 г.

(3) AFNOR – Определение острой токсичности вещества для Salmo gairdneri – Статика и поток

- Сквозные методы - NFT 90-305, июнь 1985 г.

(4) ISO 7346/1, /2 и /3 - Качество воды. Определение острой летальной токсичности веществ для пресноводных рыб (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Часть 1: Статический метод. Часть 2: Полустатический метод. Часть 3: Проточный метод.

(5) Федеральный департамент внутренних дел Швейцарии: Руководство по отбору проб и стандартизации методов анализа воды – Часть II, 1974 г.

(6) Методы испытаний DIN с водными организмами, 38 412 (L1) и L (15).

(7) JIS K 0102, Испытание на острую токсичность для рыбы.

(8) NEN 6506 – Вода – Определение острой токсичности с использованием Poecilia reticulata, 1980.

(9) Агентство по охране окружающей среды, Методы испытаний на острую токсичность для рыб, макробеспозвоночных и амфибий. Комитет по методам испытаний на токсичность водных организмов, серия экологических исследований EPA-660-75-009, 1975.

(10) Агентство по охране окружающей среды, Лаборатория экологического мониторинга и поддержки, Управление исследований и разработок, EPA-600/4-78-012, январь 1978 г.

(11) Агентство по охране окружающей среды, Контроль токсичных веществ, Часть IV, 16 марта 1979 г.

(12) Стандартные методы исследования воды и сточных вод, четырнадцатое издание, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Комиссия Европейских Сообществ, Программа межлабораторных испытаний по изучению экотоксичности химического вещества по отношению к рыбам. Исследование ЕЭК D.8368, 22 марта 1979 г.

(14) Процедурное предложение Федерального агентства по охране окружающей среды для испытания на острую рыбу. Рудольф П. и Бойе Р. Экотоксикология, основы экотоксикологической оценки химических веществ в окружающей среде в соответствии с Законом о химических веществах, Ecomed 1986.

(15) Личфилд, Дж.Т. и Уилкоксон Ф., Упрощенный метод оценки экспериментов по эффекту дозы, J. Pharm, Exp. Терапия., 1949, вып. 96, 99.

(16) Финни, Д.Дж. Статистические методы в биологических анализах. Гриффин, Уэйкомб, Великобритания, 1978 г.

(17) Спрэг, Дж. Б. Измерение токсичности загрязняющих веществ для рыб. Методы биоанализа острой токсичности. Водные ресурсы., 1969, вып. 3, 793-821.

(18) Спрэг, Дж. Б. Измерение токсичности загрязняющих веществ для рыб. II Использование и применение результатов биоанализа. Вода Рес. 1970, вып. 4, 3-32.

(19) Стефан, К.Э. Методы расчета LC50. В книге «Водная токсикология и оценка опасностей» (под редакцией Ф.И. Майера и Дж.Л. Хамелинка). Американское общество по испытаниям и материалам, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Стефан К.Э., Буш К.А., Смит Р., Берк Дж. и Эндрюс Р.В. Компьютерная программа для расчета LC50. Агентство по охране окружающей среды США.

Приложение 1

Восстановленная вода

Пример подходящей воды для разбавления

Все химические вещества должны быть аналитической степени чистоты.

Вода должна быть дистиллированной или деионизированной водой хорошего качества с проводимостью менее 5 мксм 1 .

Аппарат для перегонки воды не должен содержать деталей из меди.

Стандартные решения

СаСl2. 2H2O (дигидрат хлорида кальция): 11,76 г Растворить и довести до 1 л водой.

MgSO4. 7H2O (гептагидрат сульфата магния): 4,93 г Растворить и довести до 1 литра водой.

NaHCO3 (гидрокарбонат натрия): 2,59 г Растворить и довести до 1 литра водой.

KCl (хлорид калия): 0,23 г растворить и довести до 1 л воды.

Восстановленная вода для разбавления

Смешайте по 25 мл каждого из четырех исходных растворов и доведите до 1 литра водой.

Аэрируйте до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не сравняется со значением насыщения воздуха.

Уровень pH должен составлять 7,8±0,2.

При необходимости отрегулируйте pH с помощью NaOH (гидроксида натрия) или HCl (соляной кислоты).

Приготовленную таким образом воду для разбавления оставляют примерно на 12 часов и не подлежат дальнейшей аэрации.

Сумма ионов Ca и Mg в этом растворе составляет 2,5 ммоль на литр. Соотношение ионов Ca:Mg составляет 4:1, а ионов Na:K — 10:1. Общая щелочность этого раствора составляет 0,8 ммоль на литр.

Любые отклонения в приготовлении воды для разбавления не должны изменять состав или свойства воды.

Приложение 2

Коллекция

Перечисленные выше рыбы легко выращивать и/или они широко доступны в течение всего года. Их можно разводить и выращивать либо на рыбных фермах, либо в лаборатории в условиях контроля над болезнями и паразитами, так что подопытное животное будет здоровым и известного происхождения. Эти рыбы доступны во многих частях мира.

Приложение 3

Пример концентрации: процент смертности. Пример

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

определение LC50 с использованием лог-пробитной бумаги

С.2. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ДЛЯ ДАФНИИ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью этого теста является определение средней эффективной концентрации для иммобилизации (EC50) вещества для дафний в пресной воде. Перед началом испытания желательно иметь, насколько это возможно, информацию о растворимости в воде, давлении паров, химической стабильности, константах диссоциации и биоразлагаемости вещества.

Дополнительную информацию (например, структурную формулу, степень чистоты, природу и процентное содержание существенных примесей, наличие и количество добавок, а также коэффициент распределения н-октанол/вода) следует принимать во внимание как при планировании испытания, так и при интерпретации результатов. Результаты.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Требование Директивы к LC50 для дафний считается выполненным путем определения EC50, как описано в этом методе испытаний.

Острая токсичность выражается в этом тесте как медианная эффективная концентрация (EC50) для иммобилизации. Это концентрация, выраженная в исходных значениях, которая иммобилизует 50 % дафний в тестовой партии в течение непрерывного периода воздействия, который должен быть указан.

Иммобилизация:

Неподвижными считаются животные, которые не способны плавать в течение 15 секунд после легкого встряхивания тест-контейнера.

Все концентрации испытуемого вещества указаны по объему (миллиграммы на литр). Они также могут быть выражены в виде веса по весу (мг/кг 1).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонное вещество может быть протестировано как средство демонстрации того, что в условиях лабораторных испытаний чувствительность тестируемых видов существенно не изменилась.

Сводка результатов кольцевого теста ЕЕС с использованием четырех различных веществ приведена в Приложении 2.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Предельное испытание может быть проведено при концентрации 100 мг на литр, чтобы продемонстрировать, что EC50 превышает эту концентрацию.

Дафнии подвергаются воздействию тестируемого вещества, добавленного в воду в различных концентрациях, в течение 48 часов. Если используется более короткое испытание, обоснование должно быть приведено в протоколе испытания.

При идентичных условиях испытаний и адекватном диапазоне концентраций испытуемого вещества разные концентрации испытуемого вещества оказывают разную среднюю степень влияния на способность дафний к плаванию. Различные концентрации приводят к разному проценту дафний, которые больше не способны плавать в конце теста. Концентрации, вызывающие нулевую или 100% иммобилизацию, выводятся непосредственно из результатов испытаний, тогда как 48-часовая EC50, если возможно, определяется расчетным путем.

Для этого метода используется статическая система, поэтому тестовые растворы не обновляются в течение периода воздействия.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Критерии качества должны применяться как к предельному испытанию, так и к полному методу испытаний.

Иммобилизация в контрольной группе не должна превышать 10 % в конце испытания.

Испытуемые дафнии в контрольных группах не должны были попасть в ловушку на поверхности воды.

Желательно, чтобы концентрация растворенного кислорода в испытательных сосудах оставалась выше 3 мг/л на протяжении всего испытания. Однако ни при каких обстоятельствах концентрация растворенного кислорода не должна опускаться ниже 2 мг/л.

Концентрация испытуемого вещества должна поддерживаться в пределах 80 % от первоначальной концентрации на протяжении всего испытания.

Для веществ, которые легко растворяются в испытательной среде, образуя стабильные растворы, т.е. такие, которые не будут в значительной степени улетучиваться, разлагаться, гидролизоваться или адсорбироваться, начальную концентрацию можно принять эквивалентной номинальной концентрации. Должны быть представлены доказательства того, что концентрации поддерживались на протяжении всего испытания и что критерии качества были удовлетворены.

Для веществ, которые:

(i) плохо растворяется в тестовой среде,

или

(ii) способны образовывать стабильные эмульсии или дисперсии,

или

(iii) нестабилен в водных растворах,

за первоначальную концентрацию следует принимать концентрацию, измеренную в растворе (или, если это технически невозможно, измеренную в толще воды) в начале испытания. Концентрацию определяют после периода уравновешивания, но до введения тест-организмов.

В любом из этих случаев во время испытания необходимо провести дополнительные измерения для подтверждения фактических концентраций воздействия или соответствия критериям качества.

Уровень pH не должен изменяться более чем на 1 единицу.

1.6. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Реагенты

1.6.1.1. Растворы тестируемых веществ

Маточные растворы необходимой концентрации готовят растворением вещества в деионизированной воде или воде по 1.6.1.2.

Выбранные тестовые концентрации готовят путем разбавления исходного раствора. Если тестируются высокие концентрации, вещество можно растворить непосредственно в воде для разбавления.

Вещества обычно следует тестировать только до предела растворимости. Для некоторых веществ (например, веществ, имеющих низкую растворимость в воде или высокую Pow, или тех, которые образуют стабильную дисперсию, а не настоящий раствор в воде) допустимо проводить испытание с концентрацией выше предела растворимости вещества, чтобы гарантировать, что максимально растворимый / получена стабильная концентрация. Однако важно, чтобы эта концентрация не нарушала работу тест-системы (например, пленка вещества на поверхности воды, препятствующая насыщению воды кислородом и т. д.).

Ультразвуковое диспергирование, органические растворители, эмульгаторы или диспергаторы могут использоваться в качестве вспомогательного средства для приготовления исходных растворов веществ с низкой растворимостью в воде или для диспергирования этих веществ в испытательной среде. При использовании таких вспомогательных веществ все тестовые концентрации должны содержать одинаковое количество вспомогательных веществ, а дополнительная контрольная дафния должна подвергаться воздействию той же концентрации вспомогательного вещества, что и использованная в серии испытаний. Концентрация таких вспомогательных веществ должна быть сведена к минимуму, но ни в коем случае не должна превышать 100 мг на литр исследуемой среды.

Тест следует проводить без корректировки pH. Если есть признаки заметного изменения pH, рекомендуется повторить тест с корректировкой pH и сообщить о результатах. В этом случае значение pH исходного раствора следует привести в соответствие со значением pH растворенной воды, если только нет особых причин не делать этого. Для этой цели предпочтительны HCl и NaOH. Корректировку pH следует производить таким образом, чтобы концентрация испытуемого вещества в исходном растворе не менялась в сколько-нибудь существенной степени. Если корректировка вызвана какой-либо химической реакцией или физическим осаждением испытуемого соединения, об этом следует сообщить.

1.6.1.2. Тестовая вода

В этом испытании используется восстановленная вода (см. Приложение 1 и ссылку (2): ISO 6341). Чтобы избежать необходимости акклиматизации перед тестом, рекомендуется, чтобы культуральная вода была того же качества (рН, жесткость), что и вода, используемая для теста.

1.6.2. Аппарат

Следует использовать обычные лабораторные приборы и оборудование. Оборудование, которое будет контактировать с испытательными растворами, предпочтительно должно быть полностью изготовлено из стекла:

- Кислородомер (с микроэлектродом или другим подходящим оборудованием для измерения растворенного кислорода в пробах небольшого объема),

- соответствующее оборудование для контроля температуры,

- pH-метр,

- оборудование для определения жесткости воды.

1.6.3. Тестовый организм

Предпочтительным тестовым видом является Daphnia magna, хотя допускается также использование Daphnia pulex. Испытуемые животные должны быть моложе 24 часов на момент начала испытания, выращены в лаборатории, свободны от явных заболеваний и с известной историей (например, разведение - любая предварительная обработка и т. д.).

1.6.4. Тестовая процедура

Тест по определению диапазона может предшествовать окончательному тесту, чтобы получить информацию о диапазоне концентраций, которые будут использоваться в основном тесте.

Проводят один контроль без испытуемого вещества и, если необходимо, в дополнение к серии испытаний также проводят один контроль, содержащий вспомогательное вещество.

Дафнии подвергаются воздействию вещества, как описано ниже:

- продолжительность: желательно 48 часов,

- количество животных: не менее 20 животных для каждой тестируемой концентрации, предпочтительно разделенных на четыре партии по пять животных в каждой или две партии по 10 животных,

- загрузка: на каждое животное должно быть предоставлено не менее 2 мл тест-растворов,

- тестовая концентрация: тест-раствор следует готовить непосредственно перед введением дафнии, желательно без использования какого-либо растворителя, кроме воды. Концентрации составляют в геометрическом ряду, при соотношении концентраций не более 2,2. Концентрации, достаточные для обеспечения 0 и 100% иммобилизации через 48 часов, а также диапазон промежуточных степеней иммобилизации, позволяющий рассчитать 48-часовую ЕС50, следует тестировать вместе с контролем.

- вода: см. 1.6.1.2,

- свет: цикл свет-темнота не является обязательным,

- температура: температура испытания должна составлять от 18 до 22°С, но для каждого отдельного испытания

должно быть постоянным в пределах ± 1 С,

- аэрация: тестовые растворы не должны аэрироваться пузырьками,

- кормление: нет.

В конце испытания следует измерить pH и концентрацию кислорода в контрольных образцах и во всех тестируемых концентрациях; pH тестируемых растворов не следует изменять.

Летучие соединения следует тестировать в полностью заполненных закрытых контейнерах, достаточно больших, чтобы предотвратить недостаток кислорода.

Дафний осматривают не менее чем через 24 часа воздействия и повторно через 48 часов.

Предельный тест

Используя процедуры, описанные в этом методе, можно провести предельное испытание при концентрации 100 мг на литр, чтобы продемонстрировать, что EC50 превышает эту концентрацию.

Если природа вещества такова, что концентрация 100 мг на литр в исследуемой воде не может быть достигнута, предельное испытание следует проводить при концентрации, равной растворимости вещества (или максимальной концентрации, образующей стабильную дисперсию). в используемой среде (см. также пункт 1.6.1.1).

Предельный тест следует проводить с использованием 20 дафний, разделенных на две или четыре партии, с тем же количеством в контроле(ях). При возникновении иммобилизаций необходимо провести полное исследование.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Для каждого периода регистрации наблюдений (24 и 48 часов) процент смертности отображается в зависимости от концентрации на бумаге с логарифмической вероятностью.

По возможности и для каждого времени наблюдения EC50 и доверительные пределы (p = 0,05) следует оценивать с использованием стандартных процедур; эти значения следует округлить до одной или максимум до двух значащих цифр (примеры округления до двух цифр: 170 для 173,5; 0,13 для 0,127; 1,2 для 1,21).

В тех случаях, когда наклон кривой реакции концентрации/процента слишком крутой, чтобы можно было рассчитать EC50, графической оценки этого значения достаточно.

Когда две последовательные концентрации при соотношении 2,2 дают только 0 и 100% иммобилизацию, этих двух значений достаточно, чтобы указать диапазон, в который попадает EC50.

Если обнаружено, что стабильность или гомогенность испытуемого вещества не могут быть сохранены, об этом следует сообщить и принять меры предосторожности при интерпретации результатов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- информация об тестируемом организме (научное название, штамм, поставщик или источник, любая предварительная обработка, метод разведения, включая источник, вид и количество пищи, частота кормления);

- источник разбавляющей воды и основные химические характеристики (например, pH, температура, жесткость);

- в случае веществ с низкой растворимостью в воде - метод приготовления исходного и испытуемого раствора;

- концентрация любых вспомогательных веществ;

- перечень использованных концентраций и любую имеющуюся информацию о стабильности концентраций испытуемого химического вещества в испытуемых растворах;

- если проводятся химические анализы, использованные методы и полученные результаты;

- результаты предельного испытания, если оно проводилось;

- описание испытательного оборудования;

- режим освещения;

- концентрации растворенного кислорода, значения pH и температуры тестируемых растворов;

- доказательства того, что критерии качества были выполнены;

- таблица, показывающая кумулятивную иммобилизацию при каждой концентрации и контроль (и контроль со вспомогательным веществом, если необходимо) в каждое из рекомендуемых сроков наблюдения (24 и 48 часов);

- график кривой реакции концентрация/процент в конце теста;

- если возможно, значения EC50 в каждый из рекомендуемых периодов наблюдения (с доверительным интервалом 95 %);

- статистические процедуры, используемые для определения значений EC50;

- если используется эталонное вещество, полученные результаты;

- наивысшая тестируемая концентрация, не вызывающая иммобилизации в течение периода испытания;

- наименьшая тестируемая концентрация, вызывающая 100 % иммобилизацию в течение периода испытания.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 202, Решение Совета C(81) 30 окончательное и обновленные версии.

(2) Международный стандарт ISO, Качество воды. Определение ингибирования подвижности Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Ингибирование подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera - ракообразные) NFT 90 301 (январь 1983 г.).

(4) Процедурное предложение Федерального агентства по охране окружающей среды для теста на острую дафнию. Рудольф П. и Бойе Р. Экотоксикология, основы экотоксикологической оценки химических веществ в окружающей среде в соответствии с Законом о химических веществах, Ecomed 1986.

(5) Процедуры испытаний DIN с водными организмами 38412 (L1) и (L11).

(6) Финни, Д.Дж. Статистические методы в биологических анализах. Гриффин, Уэйкомб, Великобритания, 1978 г.

(7) Личфилд, Дж.Т. и Уилкоксон Ф. Упрощенный метод оценки экспериментов по зависимости эффекта дозы. Дж. Фармакол. и Экспер. Тер., 1949, вып. 96, 99-113.

(8) Спраг, Дж. Б. Измерение токсичности загрязняющих веществ для рыб. I Методы биоанализа острой токсичности. Водные ресурсы., 1969, вып. 3, 793-821.

(9) Спраг, Дж. Б. Измерение токсичности загрязняющих веществ для рыб. II Использование и применение результатов биоанализа. Вода Рес. 1970, вып. 4, 3-32.

(10) Стефан, К.Е. Методы расчета LC50. В книге «Водная токсикология и оценка опасностей» (под редакцией Ф.И. Майера и Дж.Л. Хамелинка). Американское общество испытаний и материалов. АСТМ, 1977, СТП 634, 65-84.

(11) Стефан К.Э., Буш К.А., Смит Р., Берк Дж. и Эндрюс Р.В. Компьютерная программа для расчета LC50. Агентство по охране окружающей среды США.

Приложение 1

Восстановленная вода

Пример подходящей воды для разбавления (согласно ISO 6341)

Все химические вещества должны быть аналитической степени чистоты.

Вода должна быть дистиллированной или деионизированной водой хорошего качества с проводимостью менее 5 мксм 1 .

Аппарат для перегонки воды не должен содержать деталей из меди.

Стандартные решения

CaCl2.2H2O (дигидрат хлорида кальция): 11,76 г растворить и довести до 1 л водой.

MgSO4.7H2O (гептагидрат сульфата магния): 4,93 г растворяют и доводят до 1 литра водой.

NaHCO3 (гидрокарбонат натрия): 2,59 г растворить и довести до 1 литра водой.

KCl (хлорид калия): растворить 0,23 г и довести до 1 л воды.

Восстановленная вода для разбавления

Смешайте по 25 мл каждого из четырех исходных растворов и доведите до 1 литра водой.

Аэрируйте до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не сравняется со значением насыщения воздуха.

Уровень pH должен составлять 7,8±0,2.

При необходимости отрегулируйте pH с помощью NaOH (гидроксида натрия) или HCl (соляной кислоты).

Приготовленную таким образом воду для разбавления оставляют примерно на 12 часов, и ее дальнейшая аэрация не требуется.

Сумма ионов Ca и Mg в этом растворе составляет 2,5 ммоль на литр. Соотношение ионов Ca:Mg составляет

4:1, а ионов Na:K – 10:1. Общая щелочность этого раствора составляет 0,8 ммоль на литр.

Любые отклонения в приготовлении воды для разбавления не должны изменять состав или свойства воды.

Приложение 2

Краткое изложение результатов кольцевого испытания EEC, проведенного в 1978 г. (также цитируется в ссылке 2)

Внимание: целью этого кольцевого теста было определение EC50 в течение 24 часов.

Используемые вещества:

1) Бихромат калия

2) Тетрапропилбензолсульфокислота

3) Тетрапропилбензолсульфокислота, натриевая соль

4) Трихлор-2,4,5-феноксиуксусная кислота, калиевая соль

>ТАБЛИЦА>

Приложение 3

Пример концентрации: процентная иммобилизация

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

Пример определения ЕС50 с использованием логарифмической бумаги. Иммобилизация 10 %.

С.3. ТЕСТ НА ИНГИБИРОВАНИЕ ВОДОРОСЛЕЙ

1. МЕТОД

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью этого теста является определение влияния вещества на рост одноклеточных видов зеленых водорослей. Относительно короткие (72 часа) тесты позволяют оценить влияние на несколько поколений. Этот метод можно адаптировать для использования с несколькими видами одноклеточных водорослей, и в этом случае описание используемого метода должно быть приложено к отчету об испытаниях.

Этот метод легче всего применить к водорастворимым веществам, которые в условиях испытания, скорее всего, останутся в воде.

Этот метод можно использовать для веществ, которые не мешают непосредственно измерению роста водорослей.

Перед началом испытания желательно иметь, насколько это возможно, информацию о растворимости в воде, давлении паров, химической стабильности, константах диссоциации и биоразлагаемости вещества.

Дополнительную информацию (например, структурную формулу, степень чистоты, природу и процентное содержание существенных примесей, наличие и количество добавок, а также коэффициент распределения н-октанол/вода) следует принимать во внимание как при планировании испытания, так и при интерпретации результатов. Результаты.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ

Плотность клеток: количество клеток на миллилитр;

Рост: увеличение плотности клеток за период тестирования;

Скорость роста: увеличение плотности клеток в единицу времени;

ЕС50: в этом методе такая концентрация испытуемого вещества, которая приводит к 50% снижению либо роста (EbC50), либо скорости роста (ErC50) по сравнению с контролем;

NOEC (концентрация, не оказывающая наблюдаемого эффекта): в этом методе самая высокая протестированная концентрация, при которой не наблюдается значительного ингибирования роста по сравнению с контролем.

Все концентрации испытуемого вещества указаны по объему (миллиграммы на литр). Они также могут быть выражены в виде веса по весу (мг/кг 1).

1.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Эталонное вещество может быть протестировано как средство демонстрации того, что в условиях лабораторных испытаний чувствительность тестируемых видов существенно не изменилась.

Если используется эталонное вещество, результаты должны быть представлены в протоколе испытаний. Дихромат калия можно использовать в качестве эталонного вещества, но его цвет может влиять на качество и интенсивность света, доступного клеткам, а также на спектрофотометрические определения, если он используется. Дихромат калия использовался в международных межлабораторных испытаниях (см. ссылку (3) и Приложение 2).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Предельное испытание может быть проведено при концентрации 100 мг на литр, чтобы продемонстрировать, что EC50 превышает эту концентрацию.

Экспоненциально растущие культуры выбранных зеленых водорослей подвергаются воздействию различных концентраций тестируемого вещества в течение нескольких поколений в определенных условиях.

Тестируемые растворы инкубируют в течение 72 часов, в течение которых плотность клеток в каждом растворе измеряют по меньшей мере каждые 24 часа. Определяют ингибирование роста по отношению к контрольной культуре.

1,5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

Критерии качества должны применяться как к предельному испытанию, так и к полному методу испытаний.

Плотность клеток в контрольных культурах должна была увеличиться как минимум в 16 раз в течение трех дней.

Концентрации испытуемого вещества должны поддерживаться в пределах 80 % от первоначальных концентраций в течение времени, соответствующего продолжительности испытания.

Для веществ, которые легко растворяются в испытательной среде, образуя стабильные растворы, т.е. такие, которые не будут в значительной степени улетучиваться, разлагаться, гидролизоваться или адсорбироваться, начальную концентрацию можно принять эквивалентной номинальной концентрации. Должны быть представлены доказательства того, что концентрации поддерживались на протяжении всего испытания и что критерии качества были удовлетворены.

Для веществ, которые:

(i) плохо растворяется в тестовой среде,

или

(ii) способны образовывать стабильные эмульсии или дисперсии,

или

(iii) нестабилен в водных растворах, первоначальную концентрацию принимают за концентрацию, измеренную в начале испытания. Концентрацию определяют после периода уравновешивания.

В любом из этих случаев во время испытания необходимо провести дополнительные измерения для подтверждения фактических концентраций воздействия или соответствия критериям качества.

Признано, что значительные количества испытуемого вещества могут быть включены в биомассу водорослей в течение периода испытания. Поэтому с целью демонстрации соответствия вышеуказанным критериям качества следует учитывать как количество вещества, включенного в биомассу водорослей, так и количество вещества в растворе (или, если это технически невозможно, измерение в толще воды). Однако, поскольку определение концентрации вещества в биомассе водорослей может вызвать серьезные технические проблемы, соответствие критериям качества можно продемонстрировать, запустив испытательный сосуд при самой высокой концентрации вещества, но без водорослей, и измерив концентрации в растворе (или, если это технически невозможно, возможно в толще воды) в начале и в конце периода испытаний.

1.6. ОПИСАНИЕ ПРОЦЕДУРЫ ИСПЫТАНИЯ

1.6.1. Реагенты

1.6.1.1. Растворы тестируемых веществ

Маточные растворы необходимой концентрации готовят растворением вещества в деионизированной воде или воде по 1.6.1.2.

Выбранные тестовые концентрации готовят путем добавления подходящих аликвот к прекультурам водорослей (см. Приложение 1). Вещества обычно следует тестировать только до предела растворимости. Для некоторых веществ (например, веществ, имеющих низкую растворимость в воде или высокую Pow, или тех, которые образуют стабильную дисперсию, а не настоящий раствор в воде) допустимо проводить испытание в концентрации выше предела растворимости вещества, чтобы гарантировать, что максимально растворимый / получена стабильная концентрация. Однако важно, чтобы эта концентрация не нарушала работу тест-системы (например, пленка вещества на поверхности воды, препятствующая насыщению воды кислородом и т. д.).

Ультразвуковое диспергирование, органические растворители, эмульгаторы или диспергаторы могут использоваться в качестве вспомогательного средства для приготовления исходных растворов веществ с низкой растворимостью в воде или для диспергирования этих веществ в испытательной среде. При использовании таких вспомогательных веществ все тестовые концентрации должны содержать одинаковое количество вспомогательных веществ, а дополнительные контроли должны подвергаться воздействию той же концентрации вспомогательного вещества, которая использовалась в серии испытаний. Концентрация таких вспомогательных веществ должна быть сведена к минимуму, но ни в коем случае не должна превышать 100 мг на литр исследуемой среды.

Тест следует проводить без корректировки pH. Если есть признаки заметного изменения pH, рекомендуется повторить тест с корректировкой pH и сообщить о результатах. В этом случае значение pH исходного раствора следует привести в соответствие со значением pH растворенной воды, если только нет особых причин не делать этого. Для этой цели предпочтительны HCl и NaOH. Корректировку pH следует производить таким образом, чтобы концентрация испытуемого вещества в исходном растворе не менялась в сколько-нибудь существенной степени. Если корректировка вызвана какой-либо химической реакцией или физическим осаждением испытуемого соединения, об этом следует сообщить.

1.6.1.2. Тестовая среда

Вода должна быть дистиллированной или деионизированной водой хорошего качества с проводимостью менее 5 мкСм.см 1 . Аппарат для дистилляции воды не должен содержать деталей из меди.

Рекомендуется следующая среда.

В соответствии со следующей таблицей готовят четыре исходных раствора. Маточные растворы стерилизуют мембранной фильтрацией или автоклавированием и хранят в темноте при температуре 4°С. 4 следует стерилизовать только мембранной фильтрацией. Эти маточные растворы разбавляют для достижения конечной концентрации питательных веществ в тестируемых растворах.

>ТАБЛИЦА>

рН среды после уравновешивания воздухом составляет примерно 8.

1.6.2. Аппарат

- Обычное лабораторное оборудование,

- Тестовые колбы подходящего объема (например, конические колбы емкостью 250 мл подходят, если объем тестируемого раствора составляет 100 мл). Все испытательные колбы должны быть идентичными по материалу и размерам.

- Аппарат для культивирования: шкаф или камера, в которой можно поддерживать температуру в диапазоне от 21°С до 25°С на уровне ±2°С и обеспечить непрерывное равномерное освещение в спектральном диапазоне от 400 до 700 нм. Если водоросли в контрольных культурах достигли рекомендуемых темпов роста, можно предположить, что условия для роста, включая интенсивность освещения, были адекватными.

При среднем уровне тестируемых растворов рекомендуется использовать интенсивность света в диапазоне от 60 до 120 мкЭ.м 2.с 1 (от 35 до 70 × 1018 фотон.м 2.с 1) при измерении в диапазоне от 400 до 700 нм с использованием соответствующего рецептора. Для светоизмерительных приборов, калиброванных в люксах, приемлемым эквивалентным диапазоном является диапазон от 6 000 до 10 000 люкс.

Интенсивность света можно было получить с помощью четырех-семи люминесцентных ламп универсального белого типа мощностью 30 Вт (цветовая температура около 4300 К) на расстоянии 0,35 м от культуры водорослей.

- Измерения плотности клеток следует проводить с использованием метода прямого подсчета живых клеток, например микроскоп со счетными камерами. Однако можно использовать и другие методы (фотометрию, турбидиметрию и т. д.), если они достаточно чувствительны и достаточно хорошо коррелируют с плотностью клеток.

1.6.3. Тестовые организмы

Предполагается, что используемые виды зеленых водорослей должны быть быстрорастущими, удобными для культивирования и тестирования. Предпочтение отдается следующим видам:

- Selenastrum capricornutum, например. АТСС 22662 или ССАР 278/4,

- Незаметная сцена, напр. 86,81 провисание

Примечание:

ATCC = Коллекция американских типовых культур (США)

CCAP = Центр культуры водорослей и простейших (Великобритания)

SAG = Коллекция культур водорослей (Геттинген, ФРГ)

Если используются другие виды, необходимо указать штамм.

1.6.4. Тестовая процедура

Диапазон концентраций, в которых могут возникнуть эффекты, определяется на основе результатов испытаний по определению диапазона.

Два показателя роста (биомасса и скорость роста) могут привести к совершенно разным показателям ингибирования роста; оба должны использоваться в тесте определения диапазона, чтобы гарантировать, что геометрическая прогрессия концентраций позволит оценить как EbC50, так и ErC50.

Начальная плотность клеток

Рекомендуется, чтобы начальная плотность клеток в тест-культурах составляла примерно 104 клеток/мл для Selenastrum capricornutum и Scenedesmus subspicatus. При использовании других видов биомасса должна быть сопоставимой.

Концентрации тестируемого вещества

Для испытания составляют не менее пяти концентраций в геометрическом ряду при соотношении концентраций не более 2,2. Самая низкая протестированная концентрация не должна оказывать наблюдаемого влияния на рост водорослей. Самая высокая протестированная концентрация должна ингибировать рост как минимум на 50 % по сравнению с контролем и, предпочтительно, полностью останавливать рост.

Репликации и контроль

Дизайн теста должен включать три повтора для каждой тестируемой концентрации. Проводят три контроля без тестируемого вещества и, при необходимости, также три контроля, содержащие вспомогательное вещество. Если это оправдано, дизайн теста может быть изменен, чтобы увеличить количество концентраций и уменьшить количество повторов на одну концентрацию.

Производительность теста

Тестовые культуры, содержащие желаемые концентрации тестируемого вещества и желаемое количество инокулята водорослей, готовят путем добавления аликвот исходных растворов тестируемого вещества к подходящим количествам предварительных культур водорослей (см. Приложение 1).

Культуральные колбы встряхивают и помещают в аппарат для культивирования. Клетки водорослей держат во взвешенном состоянии путем встряхивания, перемешивания или барботирования воздухом, чтобы улучшить газообмен и уменьшить колебания pH в тестируемых растворах. Культуры следует хранить при температуре от 21 до 25°С, контролируемой на уровне ±2°С.

Плотность клеток в каждой колбе определяют не менее чем через 24, 48 и 72 часа после начала теста. Фильтрованная водорослевая среда, содержащая соответствующую концентрацию тестируемого химиката, используется для определения фона при использовании измерений плотности клеток, отличных от методов прямого подсчета.

pH измеряют в начале теста и через 72 часа.

Во время испытания pH контролей обычно не должен отклоняться более чем на 1,5 единицы.

Тестирование летучих веществ

На сегодняшний день не существует общепринятого способа тестирования летучих веществ. Если известно, что вещество имеет склонность к испарению, можно использовать закрытые испытательные колбы с увеличенным свободным пространством. При расчете свободного пространства закрытых колб следует учитывать возможность нехватки CO2. Были предложены варианты этого метода (см. ссылку (4)).

Следует предпринять попытки определить количество вещества, которое остается в растворе, и следует проявлять особую осторожность при интерпретации результатов испытаний летучих химических веществ с использованием закрытых систем.

Предельный тест

Используя процедуры, описанные в этом методе, можно провести предельное испытание при концентрации 100 мг на литр, чтобы продемонстрировать, что EC50 превышает эту концентрацию.

Если природа вещества такова, что концентрация 100 мг на литр в исследуемой воде не может быть достигнута, предельное испытание следует проводить при концентрации, равной растворимости вещества (или максимальной концентрации, образующей стабильную дисперсию). в используемой среде (см. также пункт 1.6.1.1).

Предельный тест следует проводить не менее трех раз с одинаковым количеством контролей. Для предельного теста следует использовать два показателя роста (биомасса и скорость роста).

Если в ходе предельного испытания обнаруживается среднее снижение биомассы или скорости роста на 25 % или более между предельным испытанием и контролем, следует провести полное испытание.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Измеренную плотность клеток в тестовых культурах и контролях заносят в таблицу вместе с концентрациями тестируемого вещества и временем измерений. Среднее значение плотности клеток для каждой концентрации тестируемого вещества и для контроля наносят на график в зависимости от времени (0-72 часа) для получения кривых роста.

Чтобы определить взаимосвязь концентрация/эффект, следует использовать два следующих подхода. Некоторые вещества могут стимулировать рост в низких концентрациях. Следует учитывать только точки данных, указывающие на ингибирование в диапазоне от 0 до 100 %.

2.1. СРАВНЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ПОД КРИВЫМИ РОСТА

Площадь между кривыми роста и горизонтальной линией N = N0 можно рассчитать по формуле:

А =N1N02×t1 +N1 + N22N02×(t2t1) + +Nn 1 + Nn 2N02× (tn tn 1)

где

А = площадь,

N0 = количество клеток/мл в момент времени t0 (начало теста), 0,

N1 = измеренное количество клеток/мл в момент времени 1,

Nn = измеренное количество клеток/мл в момент времени tn,

t1 = время первого измерения после начала испытания,

tn = время n-го измерения после начала испытания.

n = количество измерений, выполненных после начала испытания.

Процент ингибирования роста клеток при каждой концентрации тестируемого вещества (IA) рассчитывают по формуле:

IA = Ac AtAc × 100

где

Ac = площадь между кривой роста управления и горизонтальной линией N = N0.

At = площадь между кривой роста при концентрации t и горизонтальной линией N = N0.

Значения IA наносят на полулогарифмическую бумагу или на полулогарифмическую бумагу с пробитом в зависимости от соответствующих концентраций. При нанесении на пробитную бумагу точки аппроксимируются прямой линией либо на глаз, либо с помощью расчетной регрессии.

EC50 оценивают по линии регрессии путем считывания концентрации, эквивалентной 50 % ингибированию (IA = 50 %). Для однозначного обозначения этой величины применительно к данному методу расчета предлагается использовать обозначение EbC50. Очень важно, чтобы EbC50 был указан с соответствующим периодом воздействия, например. EbC50(0-72ч).

2.2. СРАВНЕНИЕ ТЕМПОВ РОСТА

Среднюю удельную скорость роста (ì) для экспоненциально растущих культур можно рассчитать как

m = ln Nn ln N0tn t0

где t0 — время в начале теста.

Альтернативно, средняя удельная скорость роста может быть получена из наклона линии регрессии на графике зависимости ln N от времени.

Процент ингибирования удельной скорости роста при каждой концентрации тестируемого вещества (Iìt) рассчитывают по формуле:

Imt = mc mtmc × 100

где

ìc = средняя скорость роста в контроле

ìt = средняя удельная скорость роста тестовой концентрации t

Процентное снижение средней удельной скорости роста при каждой концентрации тестируемого вещества по сравнению с контрольным значением отображается как логарифм концентрации. EC50 можно прочитать по полученному графику. Для однозначного обозначения EC50, полученного этим методом, предлагается использовать обозначение ErC50. Необходимо указать время измерения, например: если значение относится к временам 0 и 72 часа, символ становится ErC50 (0–72 часа).

Примечание: удельная скорость роста представляет собой логарифмический термин, и небольшие изменения скорости роста могут привести к большим изменениям биомассы. Поэтому значения EbC и ErC несопоставимы численно.

2.3. РАСЧЕТ NOEC

Концентрация наблюдаемого эффекта N определяется с помощью подходящей статистической процедуры для сравнения нескольких образцов (например, дисперсионного анализа и критерия Даннетта) с использованием индивидуальных повторных значений площадей под кривыми роста A (см. пункт 2.1) или конкретных темпов роста ì ( см. пункт 2.2).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Протокол испытаний должен, если возможно, включать следующую информацию:

- испытуемое вещество: данные химической идентификации;

- тест-организмы: происхождение, лабораторная культура, номер штамма, метод культивирования;

- условия испытаний:

- дата начала и окончания испытания и его продолжительность,

- температура,

- состав среды,

- аппарат для культивирования,

- pH растворов в начале и конце испытания (при обнаружении отклонений pH более 1,5 единиц должно быть дано объяснение),

- носитель и метод, используемые для растворения испытуемого вещества и концентрации носителя в испытуемых растворах,

- интенсивность и качество света,

- проверенные концентрации (измеренные или номинальные).

- Результаты:

- плотность клеток для каждой колбы в каждой точке измерения и метод измерения плотности клеток,

- средние значения плотности клеток,

- кривые роста,

- графическое представление зависимости эффекта концентрации,

- Значения ЕС и метод расчета,

- НОЭК,

- другие наблюдаемые эффекты.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 201, Решение Совета C(81) 30 Final.

(2) Федеральное агентство по охране окружающей среды, Берлин, 1984 г., технологическое предложение «Ингибирование пролиферации клеток зеленой водоросли Scenedes¹us subspicatus», в: Рудольф/Бойе: Экотоксикология, экомед, Ландсберг, 1986 г.

(3) ISO 8692 — Качество воды. Испытание на ингибирование роста водорослей в пресной воде с использованием Scenedesmus subspicatus и Selenastrum capricornutum.

(4) С.Галасси и М.Виги - Хемосфера, 1981, т.10, 1123-1126.

Приложение 1

Пример процедуры культивирования водорослей

Общие замечания

Целью культивирования на основе следующей процедуры является получение культур водорослей для испытаний на токсичность.

Следует использовать подходящие методы, чтобы гарантировать, что культуры водорослей не заражены бактериями (ISO 4833). Аксенические культуры могут быть желательны, но необходимы униалгальные культуры.

Все операции следует проводить в стерильных условиях во избежание заражения бактериями и другими водорослями. Загрязненные культуры следует отвергнуть.

Методика получения культур водорослей

Приготовление питательных растворов (сред):

Среду можно приготовить путем разбавления концентрированных исходных растворов питательных веществ. В твердую среду добавляют 0,8 % агара. Используемая среда должна быть стерильной. Стерилизация автоклавированием может привести к потере NH3.

Фондовая культура:

Исходные культуры представляют собой небольшие культуры водорослей, которые регулярно переносят в свежую среду в качестве исходного тестового материала. Если культуры не используются регулярно, их наносят штрихами на наклонные пробирки с агаром. Их переносят на свежую среду не реже одного раза в два месяца.

Исходные культуры выращивают в конических колбах, содержащих соответствующую среду (объем около 100 мл). При инкубации водорослей при температуре 20°С и постоянном освещении требуется еженедельный перенос.

Во время переноса некоторое количество «старой» культуры переносят стерильными пипетками в колбу с

свежей среде, так что у быстрорастущих видов исходная концентрация примерно в 100 раз меньше, чем в старой культуре.

Скорость роста вида можно определить по кривой роста. Если это известно, можно оценить плотность, при которой культуру следует перенести на новую среду. Это необходимо сделать до того, как культура достигнет фазы гибели.

Прекультура:

Предварительная культура предназначена для получения количества водорослей, подходящего для инокуляции тестовых культур. Предварительную культуру инкубируют в условиях теста и используют, пока она еще растет в геометрической прогрессии, обычно после инкубационного периода продолжительностью около трех дней. Если культуры водорослей содержат деформированные или аномальные клетки, их необходимо выбросить.

Приложение 2

В стандарте ISO 8692 — Качество воды — Испытание на ингибирование роста водорослей в пресной воде с использованием Scenedesmus subspicatus и Selenastrum capricornutum представлены следующие результаты межлабораторного испытания, проведенного в 16 лабораториях по тестированию дихромата калия:

>ТАБЛИЦА>

С.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ «ГОТОВОЙ» БИОРАЗЛАГАЕМОСТИ

ЧАСТЬ I. ОБЩИЕ СООБРАЖЕНИЯ

И.1. ВВЕДЕНИЕ

Описаны шесть методов испытаний, которые позволяют проверять химические вещества на их полную биоразлагаемость в аэробной водной среде:

(a) Вымирание растворенного органического углерода (DOC) (метод C.4-A)

(b) Модифицированный скрининг ОЭСР – DOC Die-Away (метод C.4-B)

(c) Выделение углекислого газа (CO2) (Модифицированный тест Штурма) (Метод C.4-C)

(d) Манометрическая респирометрия (Метод C.4-D)

(д) Закрытая бутыль (Метод С.4-Е)

(f) MITI (Министерство международной торговли и промышленности – Япония) (Метод C.4-F)

Общие и общие соображения по всем шести испытаниям приведены в части I метода. Элементы, специфичные для отдельных методов, приведены в частях II–VII. В приложениях содержатся определения, формулы и инструктивный материал.

Межлабораторное сравнение ОЭСР, проведенное в 1988 году, показало, что эти методы дают последовательные результаты. Однако в зависимости от физических характеристик испытуемого вещества может быть предпочтительным тот или иной метод.

И.2. ВЫБОР ПОДХОДЯЩЕГО МЕТОДА

Для выбора наиболее подходящего метода необходима информация о растворимости химического вещества, давлении пара и характеристиках адсорбции. Химическая структура или формула должны быть известны для расчета теоретических значений и/или проверки измеренных значений параметров, например: ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (см. Приложения I и II).

Испытательные химические вещества, растворимые в воде в концентрации не менее 100 мг/л, можно оценивать всеми методами при условии, что они нелетучи и неадсорбируются. Для тех химических веществ, которые плохо растворяются в воде, летучих или адсорбирующихся, подходящие методы указаны в Таблице 1. Способы борьбы с плохо растворимыми в воде химическими веществами и летучими химическими веществами описаны в Приложении III. Умеренно летучие химические вещества можно тестировать методом DOC Die-Away, если в испытательных сосудах достаточно газового пространства (которые должны быть закупорены соответствующим образом). В этом случае необходимо установить абиотический контроль, чтобы учесть любые физические потери.

>ТАБЛИЦА>

Информация о чистоте или относительных пропорциях основных компонентов испытуемого материала необходима для интерпретации полученных результатов, особенно когда результаты низкие или пограничные.

Информация о токсичности тестируемого химического вещества для бактерий (Приложение IV) может быть очень полезной для выбора соответствующих тестовых концентраций и может иметь важное значение для правильной интерпретации низких значений биоразложения.

И.3. ЭТАЛОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

Для проверки процедуры эталонные химические вещества, которые соответствуют критериям полной биоразлагаемости, проверяются путем установки соответствующей колбы параллельно с обычными испытаниями.

Подходящими химикатами являются анилин (свежеперегнанный), ацетат натрия и бензоат натрия. Все эти эталонные химические вещества разлагаются в этих методах, даже если инокулят не добавляется намеренно.

Было предложено найти эталонное химическое вещество, которое легко биоразлагаемо, но требует добавления инокулята. Был предложен гидрофталат калия, но необходимо получить больше доказательств в отношении этого вещества, прежде чем его можно будет принять в качестве эталонного вещества.

При респирометрических тестах азотсодержащие соединения могут влиять на поглощение кислорода из-за нитрификации (см. Приложения II и V).

И.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Раствор или суспензию испытуемого вещества в минеральной среде инокулируют и инкубируют в аэробных условиях в темноте или при рассеянном свете. Количество РОУ в испытуемом растворе, обусловленное инокулятом, должно быть как можно более низким по сравнению с количеством РОУ, образующегося в результате испытуемого вещества. Учитывают эндогенную активность инокулята путем проведения параллельных холостых тестов с инокулятом, но без тестируемого вещества, хотя эндогенная активность клеток в присутствии вещества не будет точно соответствовать таковой в эндогенном контроле. Параллельно тестируется эталонное вещество для проверки эффективности процедур.

Как правило, за разложением следует определение таких параметров, как DOC, производство CO2 и поглощение кислорода, а измерения проводятся через достаточно частые интервалы, чтобы можно было идентифицировать начало и конец биоразложения. При использовании автоматических респирометров измерение происходит непрерывно. DOC иногда измеряется в дополнение к другому параметру, но обычно это делается только в начале и в конце испытания. Специальный химический анализ также может использоваться для оценки первичного разложения испытуемого вещества и определения концентрации любых образовавшихся промежуточных веществ (обязательно при тесте MITI).

Обычно тест длится 28 дней. Однако испытания могут быть завершены до истечения 28 дней, т.е. как только кривая биоразложения выйдет на плато по крайней мере для 3 определений. Испытания также могут быть продлены на срок более 28 дней, если кривая показывает, что биоразложение началось, но плато еще не достигнуто к 28-му дню.

И.5. КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА

I.5.1. Воспроизводимость

Из-за характера биоразложения и смешанных популяций бактерий, используемых в качестве инокулята, определения следует проводить как минимум в двух экземплярах.

Общеизвестно, что чем выше концентрация микроорганизмов, первоначально добавленных в тестовую среду, тем меньше будет разница между повторами. Кольцевые испытания также показали, что между результатами, полученными в разных лабораториях, могут быть большие различия, но хорошее согласие обычно достигается для легко биоразлагаемых соединений.

I.5.2. Валидность теста

Испытание считается действительным, если разница между крайними значениями повторных значений удаления испытуемого химического вещества на плато, в конце испытания или в конце 10-дневного окна, в зависимости от обстоятельств, составляет менее 20 % и если процентная деградация эталонного вещества достигла уровня полной биоразлагаемости к 14 дням. Если какое-либо из этих условий не выполнено, испытание следует повторить. Из-за строгости методов низкие значения не обязательно означают, что испытуемое вещество не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывают на то, что для установления биоразлагаемости потребуется дополнительная работа.

Если при испытании на токсичность, содержащем как испытуемое вещество, так и эталонное химическое вещество, за 14 дней произошло разложение менее 35 % (на основе DOC) или менее 25 % (на основе ThOD или ThCO2), можно предположить, что испытуемые химические вещества быть ингибирующим (см. также Приложение IV). Серию испытаний следует повторить, если возможно, с использованием более низкой концентрации тестируемого химиката и/или более высокой концентрации инокулята, но не более 30 мг твердых веществ/литр.

И.6. ОБЩИЕ ПРОЦЕДУРЫ И ПОДГОТОВКИ

Общие условия, применимые к испытаниям, суммированы в Таблице 2. Оборудование и другие экспериментальные условия, относящиеся конкретно к отдельному испытанию, описаны ниже под заголовком этого испытания.

>ТАБЛИЦА>

I.6.1. Разбавляющая вода

Используется деионизированная или дистиллированная вода, свободная от ингибирующих концентраций токсичных веществ (например, ионов Cu++). Он должен содержать не более 10 % содержания органического углерода, вносимого испытуемым материалом. Высокая чистота тестируемой воды необходима для исключения высоких холостых значений.

Загрязнение может быть вызвано собственными примесями, а также ионообменными смолами и лизированным материалом бактерий и водорослей. Для каждой серии испытаний используют только одну партию воды, предварительно проверенную анализом DOC. Такая проверка не обязательна для теста в закрытой бутылке, но потребление кислорода в воде должно быть низким.

I.6.2. Маточные растворы минеральных компонентов

Для приготовления тест-растворов готовят маточные растворы соответствующей концентрации минеральных компонентов. Следующие исходные растворы могут использоваться (с различными коэффициентами разведения) для методов DOC Die-Away, модифицированного скрининга OECD, выделения CO2, манометрической респирометрии, теста в закрытой бутылке.

Коэффициенты разбавления, а для теста MITI, конкретная подготовка минеральной среды приведены в разделах специальных тестов.

Стандартные решения:

Приготовьте следующие исходные растворы, используя реагенты аналитической чистоты.

(а) Монокалий дигидроортофосфат, KH2PO4 8,50 г

Дикалий моногидроортофосфат, K2HPO4 21,75 г

Дигидрат моногидроортофосфата натрия Na2HPO4. 2 H2O 33,40 г

Хлорид аммония, NH4Cl 0,50 г

Растворить в воде и довести до 1 л. pH раствора должен быть 7,4.

(б) Хлорид кальция, безводный, CaCl2 27,50 г

или дигидрат хлорида кальция, CaCl2. 2 H2O 36,40 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

(c) Гептагидрат сульфата магния, MgSO4. 7 H2O 22,50 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

(г) гексагидрат хлорида железа (III), FeCl3. 6 H2O 0,25 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

Примечание: чтобы не готовить раствор непосредственно перед применением, добавьте одну каплю конц. HCL или 0,4 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на литр.

I.6.3. Маточные растворы химикатов

Например, растворите 1–10 г испытуемого или эталонного химического вещества в деионизированной воде и доведите до 1 литра, если растворимость превышает 1 г/л. В противном случае приготовьте исходные растворы в минеральной среде или добавьте химикат непосредственно в минеральную среду. Информацию об обращении с менее растворимыми химикатами см. в Приложении III, но при испытании MITI (метод C.4-F) не следует использовать ни растворители, ни эмульгаторы.

I.6.4. Инокуля

Инокулят может быть получен из различных источников: активного ила, сточных вод (нехлорированных), поверхностных вод и почв или из их смеси. Для DOC Die-Away, CO2

Анализы на эволюцию и манометрическую респирометрию. Если используется активный ил, его следует брать с очистных сооружений или лабораторных установок, получающих преимущественно бытовые сточные воды. Было обнаружено, что инокуляты из других источников дают более высокий разброс результатов. Для модифицированного скрининга ОЭСР и тестов в закрытой бутылке необходим более разбавленный инокулят без хлопьев осадка, а предпочтительным источником являются вторичные сточные воды с очистных сооружений бытовых сточных вод или установки лабораторного масштаба. Для теста MITI инокулят получают из смеси источников и описываются под заголовком этого конкретного теста.

I.6.4.1. Инокулят из активного ила

Отберите пробу активного ила только что из аэротенка очистной станции или лабораторной установки, обрабатывающей преимущественно бытовые сточные воды. При необходимости удалите крупные частицы путем фильтрации через мелкое сито и после этого сохраняйте осадок аэробным.

Альтернативно, отстой или центрифугирование (например, при 1100 g в течение 10 минут) после удаления крупных частиц. Выбросьте супернатант. Осадок можно промывать в минеральной среде. Концентрированный ил суспендируют в минеральной среде до концентрации взвешенных веществ 3-5 г/л и аэрируют до необходимости.

Шлам следует брать из исправно работающей обычной установки. Если осадок приходится брать с высокопроизводительных очистных сооружений или предполагается, что он содержит ингибиторы, его следует промыть. Ресуспендированный осадок после тщательного перемешивания отстаивают или центрифугируют, надосадочную жидкость сливают и снова ресуспендируют промытый осадок в дополнительном объеме минеральной среды. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока осадок не будет считаться свободным от избытка субстрата или ингибитора.

После достижения полного ресуспендирования или в случае необработанного осадка отберите пробу непосредственно перед использованием для определения сухой массы взвешенных твердых веществ.

Другой альтернативой является гомогенизация активного ила (3-5 г взвешенных веществ/л). Обработка осадка в механическом блендере в течение 2 мин. на средней скорости. Отстой смешанного осадка в течение 30 мин. или дольше, если необходимо, и декантируют жидкость для использования в качестве инокулята из расчета 10 мл/л минеральной среды.

I.6.4.2. Другие источники инокулята

Его можно получить из вторичных сточных вод очистных сооружений или лабораторных установок, куда поступают преимущественно бытовые сточные воды. Соберите свежий образец и сохраняйте его аэробность во время транспортировки. Дать отстояться 1 час. или профильтровать через бумажный фильтр грубой очистки и сохранять декантированные сточные воды или фильтрат в аэробных условиях до тех пор, пока они не потребуются. На литр среды можно использовать до 100 мл этого типа инокулята.

Еще одним источником инокулята являются поверхностные воды. В этом случае отберите пробу соответствующей поверхностной воды, например. река, озеро и сохраняйте аэробную активность до тех пор, пока она не потребуется. При необходимости концентрируют инокулят фильтрованием или центрифугированием.

I.6.5. Предварительное кондиционирование инокулята

Инокулят можно предварительно кондиционировать в условиях эксперимента, но не адаптировать к тестируемому химикату. Предварительное кондиционирование заключается в аэрации активного ила в минеральной среде или вторичных стоках в течение 5-7 суток при температуре испытания. Предварительное кондиционирование иногда повышает точность методов испытаний за счет уменьшения холостых значений. Предварительное кондиционирование инокулята MITI считается ненужным.

I.6.6. Абиотический контроль

При необходимости проверьте возможную абиотическую деградацию испытуемого вещества, определяя удаление DOC, поглощение кислорода или выделение углекислого газа в стерильных контролях, не содержащих инокулята. Стерилизовать фильтрованием через мембрану (0,2–0,45 микрометра) или добавлением подходящего токсичного вещества в соответствующей концентрации. Если используется мембранная фильтрация, отбирайте пробы в асептических условиях для обеспечения стерильности. Если заранее не исключена адсорбция тестируемого химиката, тесты, измеряющие биоразложение как удаление DOC, особенно с инокулятом активированного ила, должны включать абиотический контроль, который инокулируется и отравляется.

I.6.7. Количество колб

Количество колб в типичном цикле указано под заголовками каждого теста.

Можно использовать следующий тип колбы:

Тестовая суспензия: содержит тестируемое вещество и инокулят.

Бланк инокулята: содержит только инокулят.

Контроль процедуры: содержание эталонного вещества и инокулята

Абиотический стерильный контроль: стерильный, содержащий испытуемое вещество (см. I.6.6).

Контроль адсорбции: содержит тестируемое вещество, инокулят и стерилизующий агент.

Контроль токсичности: содержит тестируемое вещество, эталонное вещество и инокулят.

Обязательно параллельное определение в тестируемой суспензии и бланке инокулята. Определения целесообразно производить параллельно и в других колбах.

Однако это не всегда возможно. Убедитесь, что взято достаточное количество проб или показаний, чтобы можно было оценить процент удаления в 10-дневном окне.

И.7. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

При расчете Dt, процентной деградации, используются средние значения повторных измерений параметра как в тестовых сосудах, так и в бланке инокулята. Формулы изложены в разделах ниже, посвященных конкретным тестам. Ход деградации отображается графически и указывается 10-дневное окно. Рассчитайте и сообщите процент удаления, достигнутый в конце 10-дневного окна, и значение на плато или в конце теста, в зависимости от того, что подходит.

При респирометрических исследованиях азотсодержащие соединения могут влиять на поглощение кислорода из-за нитрификации (см. Приложения II и V).

I.7.1. Деградация, измеренная посредством определения DOC

Процент разложения Dt при каждом отборе пробы следует рассчитывать отдельно для колб, содержащих испытуемое вещество, используя средние значения повторных измерений DOC, чтобы можно было оценить достоверность теста (см. I.5.2). Он рассчитывается по следующему уравнению:

Dt = (1CtCbtCoCbo) × 100

где:

Dt = % деградации во время t,

Co = средняя начальная концентрация DOC в инокулированной культуральной среде, содержащей тестируемое вещество (мг DOC/л),

Ct = средняя концентрация DOC в инокулированной культуральной среде, содержащей тестируемое вещество, в момент времени t (мг DOC/л),

Cbo = средняя начальная концентрация DOC в холостой инокулированной минеральной среде (мг DOC/л),

Cbt = средняя концентрация DOC в минеральной среде с холостой инокуляцией в момент времени t (мг DOC/л).

Все концентрации измерены экспериментально.

I.7.2. Деградация измеряется посредством специального анализа

При наличии конкретных аналитических данных рассчитайте первичную биодеградацию по формуле:

Дт = Sb SaSb × 100

где:

Dt = % деградации во время t, обычно 28 дней,

Sa = остаточное количество тестируемого вещества в инокулируемой среде в конце теста (мг),

Sb = остаточное количество испытуемого вещества в холостой пробе с водой/средой, к которой было добавлено только испытуемое вещество (мг).

I.7.3. Абиотическая деградация

При использовании абиотического стерильного контроля рассчитайте процент абиотического разложения, используя

% абиотического разложения = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

где

Cs(o) = концентрация DOC в стерильном контроле в день 0

Cs(t) = концентрация DOC в стерильном контроле в день t

И.8. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТОВ

Протокол испытаний должен, если возможно, содержать следующее:

- тестовые и эталонные химические вещества и их чистота;

- условия испытаний;

- инокулят: природа и место(а) отбора проб, концентрация и предварительная обработка;

- доля и характер промышленных отходов, присутствующих в сточных водах, если они известны;

- продолжительность и температура испытания;

- в случае плохо растворимых тестируемых химикатов провести обработку;

- примененный метод испытаний; Для любого изменения процедуры должны быть даны научные обоснования и объяснения;

- техническая спецификация;

- любые наблюдаемые явления торможения;

- любая наблюдаемая абиотическая деградация;

- конкретные химико-аналитические данные, если таковые имеются;

- аналитические данные о промежуточных продуктах, если таковые имеются;

- график процентной деградации от времени для испытуемого и эталонного веществ; должны быть четко обозначены фаза задержки, фаза деградации, 10-дневное окно и наклон (Приложение I). Если испытание соответствует критериям достоверности, для построения графика можно использовать среднее значение процентов разложения колб, содержащих испытуемое вещество.

- процентное удаление после 10-дневного окна, а также на плато или в конце теста.

ЧАСТЬ II. ИСПЫТАНИЕ НА ДИАГНОСТИКУ DOC (Метод C.4-A)

II.1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Измеренный объем инокулированной минеральной среды, содержащей известную концентрацию испытуемого вещества (10-40 мг РОУ/л) в качестве номинального единственного источника органического углерода, аэрируют в темноте или рассеянном свете при температуре 22±2°С.

За разложением следует анализ DOC через определенные промежутки времени в течение 28-дневного периода. Степень биоразложения рассчитывают путем выражения концентрации удаленного DOC (с поправкой на концентрацию в контрольном холостом инокуляте) в процентах от первоначально присутствующей концентрации. Степень первичного биоразложения также можно рассчитать на основе дополнительного химического анализа, проведенного в начале и в конце инкубации.

II.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

II.2.1. Оборудование

(а) Конические колбы, т.е. г. от 250 мл до 2 л, в зависимости от объема, необходимого для анализа DOC;

(b) Встряхивающая машина для размещения конических колб, либо с автоматическим контролем температуры, либо используемая в помещении с постоянной температурой, и достаточной мощности для поддержания аэробных условий во всех колбах;

(c) Фильтрационный аппарат с подходящими мембранами;

(d) анализ DOC;

(д) Аппаратура для определения растворенного кислорода;

(е) Центрифуга.

II.2.2. Приготовление минеральной среды

Информацию о приготовлении исходных растворов см. в I.6.2.

Смешайте 10 мл раствора (а) с 800 мл разбавляющей воды, добавьте по 1 мл растворов (б) к (г) и доведите до 1 л разбавляющей водой.

II.2.3. Приготовление и предварительное кондиционирование инокулята

Инокулят может быть получен из различных источников: активного ила; канализационные стоки; поверхностные воды; почвы или из их смеси.

См. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. и I.6.5.

II.2.4. Подготовка колб

Например, в конические колбы емкостью 2 л вносят порции минеральной среды по 800 мл и в отдельные колбы добавляют достаточные объемы исходных растворов испытуемого и эталонного веществ для получения концентрации химического эквивалента 10-40 мг РОУ/л. Проверьте значения pH и при необходимости доведите их до 7,4. Засеивают колбы активным илом или другим источником инокулята (см. I.6.4.) до достижения конечной концентрации не более 30 мг взвешенных веществ/л. Также подготовьте контроли инокулята в минеральной среде, но без тестируемого или эталонного химиката.

При необходимости используйте один сосуд для проверки возможного ингибирующего действия испытуемого химиката путем внесения в минеральную среду раствора, содержащего сравнимые концентрации как испытуемого, так и эталонного химиката.

Кроме того, при необходимости установите еще одну стерильную колбу, чтобы проверить, не разлагается ли испытуемое химическое вещество абиотически при использовании незасеянного раствора химического вещества (см. I.6,6).

Кроме того, если есть подозрение, что испытуемое химическое вещество в значительной степени адсорбируется на стекле, иле и т. д., проведите предварительную оценку, чтобы определить вероятную степень адсорбции и, следовательно, пригодность испытания для данного химического вещества (см. Таблицу 1). Подготовьте колбу, содержащую испытуемое вещество, инокулят и стерилизующий агент.

Доводят объемы во всех колбах до 1 л минеральной средой и после перемешивания отбирают пробу из каждой колбы для определения исходной концентрации РОУ (см. приложение II.4). Закройте отверстия колб, например. г. алюминиевой фольгой таким образом, чтобы обеспечить свободный обмен воздуха между колбой и окружающей атмосферой. Затем вставьте сосуды в встряхивающую машину для начала теста.

II.2.5. Количество колб в типичном цикле

Колбы 1 и 2: Испытательная суспензия Колбы 3 и 4: Бланк инокулята Колба 5: Контроль процедуры желательно и при необходимости: Колба 6: Контроль абиотической стерильности Колба 7: Контроль адсорбции Колба 8: Контроль токсичности

См. также I.6.7.

II.2.6. Производительность теста

На протяжении всего испытания определяют концентрацию DOC в каждой колбе в двух экземплярах через известные интервалы времени, достаточно часто, чтобы иметь возможность определить начало 10-дневного окна и процент удаления в конце 10-дневного окна. Берите только минимальный объем тестируемой суспензии, необходимый для каждого определения.

Перед отбором проб производят хорошие потери на испарение из колб, добавляя при необходимости разбавляющую воду (П.6.1) в необходимом количестве. Тщательно перемешайте культуральную среду перед отбором пробы и убедитесь, что материал, прилипший к стенкам сосудов, растворился или суспендировался перед отбором проб. Мембранный фильтр или центрифуга (см. Приложение II.4) сразу после отбора пробы. Анализируйте отфильтрованные или центрифугированные образцы в тот же день, в противном случае храните при температуре 2–4°С в течение максимум 48 часов или при температуре ниже 18°С в течение более длительного периода.

II.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

II.3.1. Обработка результатов

Рассчитайте процентное ухудшение в момент времени t, как указано в I.7.1. (определение DOC) и, опционально, согласно 1.7.2. (специфический анализ).

Запишите все результаты в предоставленные таблицы данных.

II.3.2. Достоверность результатов

См. I.5.2.

II.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

II.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

ТЕСТ НА ВЫМИРАНИЕ DOC

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/л в качестве химиката

Начальная концентрация в среде, до: мг/л как хим.

4. ТРАВМЫ

Источник:

Назначено лечение:

Предварительное кондиционирование, если таковое имеется:

Концентрация взвешенных веществ в реакционной смеси: мг/л

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕРОДА

Анализатор углерода:

>ТАБЛИЦА>

6. ОЦЕНКА НЕОБХОДИМЫХ ДАННЫХ

>ТАБЛИЦА>

7. АБИОТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ (по желанию)

>ТАБЛИЦА>

% абиотического разложения = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

8. СПЕЦИАЛЬНЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (по желанию)

>ТАБЛИЦА>

ЧАСТЬ III. МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СКРИНИНГОВЫЙ ТЕСТ ОЭСР (Метод C.4-B)

III.1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Измеренный объем минеральной среды, содержащей известную концентрацию испытуемого вещества (10-40 мг DOC/л) в качестве номинального единственного источника органического углерода, инокулируют 0,5 мл стоков на литр среды. Смесь аэрируют в темноте или при рассеянном свете при температуре 22±2°С.

За разложением следует анализ DOC через определенные промежутки времени в течение 28-дневного периода. Степень биоразложения рассчитывают путем выражения концентрации удаленного DOC (с поправкой на концентрацию в контрольном холостом инокуляте) в процентах от первоначально присутствующей концентрации. Степень первичного биоразложения также можно рассчитать на основе дополнительного химического анализа, проведенного в начале и в конце инкубации.

III.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

III.2.1. Оборудование

(а) Конические колбы, например от 250 мл до 2 литров, в зависимости от объема, необходимого для анализа DOC;

(b) Встряхивающая машина - для размещения конических колб, либо с автоматическим контролем температуры, либо используемая в помещении с постоянной температурой, и достаточной мощности для поддержания аэробных условий во всех колбах;

(c) Фильтрационный аппарат с подходящими мембранами;

(d) анализ DOC;

(д) Аппаратура для определения растворенного кислорода;

(е) Центрифуга.

III.2.2. Приготовление минеральной среды

Информацию о приготовлении исходных растворов см. в I.6.2.

Смешать 10 мл раствора (а) с 80 мл разбавляющей воды, добавить по 1 мл растворов (б) к (г) и довести объем до 1 л водой для разбавления.

В этом методе в качестве инокулята используется только 0,5 мл стоков на литр, поэтому может потребоваться обогащение среды микроэлементами и факторами роста. Это делается путем добавления по 1 мл каждого из следующих растворов на литр конечной среды:

Раствор микроэлементов:

Тетрагидрат сульфата марганца, MnSO4. 4H2O 39,9 мг

Борная кислота, H3BO3 57,2 мг

Гептагидрат сульфата цинка, ZnSO4. 7H2O 42,8 мг

Гептамолибдат аммония (NH4)6 Mo7O24 34,7 мг

Fe-хелат (FeCl3 этилендиаминтетрауксусная кислота) 100,0 мг

Растворить и довести до 1 000 мл водой для разбавления.

Витаминный раствор:

Дрожжевой экстракт 15,0 мг

Растворите дрожжевой экстракт в 100 мл воды. Стерилизовать, пропуская через мембрану толщиной 0,2 микрона, или приготовить свежеприготовленную.

III.2.3. Приготовление и предварительное кондиционирование инокулята

Инокулят получают из вторичных сточных вод очистных сооружений или лабораторных установок, куда поступают преимущественно бытовые сточные воды. См. I.6.4.2. и I.6.5.

Используют 0,5 мл на литр минеральной среды.

III.2.4. Подготовка колб

Например, в 2-литровые конические колбы вносят порции минеральной среды по 800 мл и в отдельные колбы добавляют достаточные объемы исходных растворов испытуемого и эталонного веществ для получения концентрации химического эквивалента 10-40 мг РОУ/л. Проверьте значение pH и при необходимости доведите его до 7,4. Инокулируют колбы канализационными стоками из расчета 0,5 мл/л (см. I.6.4.2.). Также подготовьте контроли инокулята в минеральной среде, но без тестируемого или эталонного химиката.

При необходимости используйте один сосуд для проверки возможного ингибирующего действия испытуемого химиката путем внесения в минеральную среду раствора, содержащего сравнимые концентрации как испытуемого, так и эталонного химиката.

Кроме того, при необходимости подготовьте еще одну стерильную колбу, чтобы проверить, не разлагается ли испытуемое химическое вещество абиотически при использовании незасеянного раствора химического вещества (см. I.6.6).

Кроме того, если есть подозрение, что испытуемое химическое вещество в значительной степени адсорбируется на стекле, иле и т. д., проведите предварительную оценку, чтобы определить вероятную степень адсорбции и, следовательно, пригодность испытания для данного химического вещества (см. Таблицу 1). Подготовьте колбу, содержащую испытуемое вещество, инокулят и стерилизующий агент.

Доводят объемы во всех колбах до 1 л минеральной средой и после смешивания отбирают пробу из каждой колбы для определения исходной концентрации РОУ (см. приложение II.4). Закройте отверстия колб, например. алюминиевой фольгой таким образом, чтобы обеспечить свободный обмен воздуха между колбой и окружающей атмосферой. Затем вставьте сосуды в встряхивающую машину для начала теста.

III.2.5. Количество колб в типичном цикле

Колбы 1 и 2: Испытательная суспензия

Колбы 3 и 4: бланк инокулята.

Колба 5: Контроль процедуры и желательно и при необходимости:

Колба 6: Абиотический стерильный контроль

Колба 7: Контроль адсорбции

Колба 8: Контроль токсичности

См. также I.6.7.

III.2.6. Производительность теста

На протяжении всего испытания определяют концентрацию DOC в каждой колбе в двух экземплярах через известные интервалы времени, достаточно часто, чтобы иметь возможность определить начало 10-дневного окна и процент удаления в конце 10-дневного окна. Берите только минимальный объем тестируемой суспензии, необходимый для каждого определения.

Перед отбором проб производят хорошие потери на испарение из колб, добавляя при необходимости разбавляющую воду (П.6.1) в необходимом количестве. Тщательно перемешайте культуральную среду перед отбором пробы и убедитесь, что материал, прилипший к стенкам сосудов, растворился или суспендировался перед отбором проб. Мембранный фильтр или центрифуга (см. Приложение II.4) сразу после отбора пробы. Анализируйте отфильтрованные или центрифугированные образцы в тот же день, в противном случае храните при температуре 2–4°С в течение максимум 48 часов или при температуре ниже 18°С в течение более длительного периода.

III.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

III.3.1. Обработка результатов

Рассчитайте процентное ухудшение в момент времени t, как указано в I.7.1. (определение DOC) и, факультативно, согласно I.7.2. (специфический анализ).

Запишите все результаты в предоставленные таблицы данных.

III.3.2. Достоверность результатов

См. I.5.2.

III.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

III.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СКРИНИНГОВЫЙ ТЕСТ ОЭСР

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/литр в качестве химиката

Начальная концентрация в среде, до: мг/литр в качестве химического вещества

4. ТРАВМЫ

Источник:

Назначено лечение:

Предварительное кондиционирование, если таковое имеется:

Концентрация взвешенных веществ в реакционной смеси: мг/л

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕРОДА

Анализатор углерода:

>ТАБЛИЦА>

6. ОЦЕНКА НЕОБХОДИМЫХ ДАННЫХ

>ТАБЛИЦА>

7. АБИОТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ (по желанию)

>ТАБЛИЦА>

% абиотического разложения = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

8. СПЕЦИАЛЬНЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (по желанию)

>ТАБЛИЦА>

ЧАСТЬ IV. ТЕСТ НА ВЫДЕЛЕНИЕ CO2 (Метод C.4-C)

IV.1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Измеренный объем инокулированной минеральной среды, содержащей известную концентрацию тестируемого химиката (10-20 мг DOC или TOC/л) в качестве номинального единственного источника органического углерода, аэрируется путем пропускания воздуха, не содержащего диоксида углерода, с контролируемой скоростью в в темноте или при рассеянном свете. За разложением следят в течение 28 дней путем определения образовавшегося диоксида углерода, который улавливается гидроксидом бария или натрия и который измеряется титрованием остаточного гидроксида или неорганического углерода. Количество диоксида углерода, полученного из испытуемого химиката (с поправкой на количество, полученное из холостого инокулята), выражается в процентах от ThCO2. Степень биоразложения также можно рассчитать на основе дополнительного анализа DOC, проведенного в начале и в конце инкубации.

IV.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

IV.2.1. Оборудование

а) колбы емкостью 2–5 л, каждая из которых снабжена аэрационной трубкой, доходящей почти до дна сосуда, и выпускным отверстием;

(b) Магнитные мешалки при оценке плохо растворимых химических веществ;

(c) Газоабсорбционные баллоны;

(г) Устройство для контроля и измерения расхода воздуха;

(e) Аппараты для очистки углекислого газа для подготовки воздуха, свободного от углекислого газа; в качестве альтернативы можно использовать смесь кислорода, не содержащего CO2, и азота, не содержащего CO2, из газовых баллонов в правильных пропорциях (20 % O2:80 % N2);

f) устройство для определения диоксида углерода титриметрически или с помощью какого-либо анализатора неорганического углерода;

(g) Устройство мембранной фильтрации (опционально);

(h) Анализатор DOC (опционально).

IV.2.2. Приготовление минеральной среды

Информацию о приготовлении исходных растворов см. в I.6.2.

Смешайте 10 мл раствора (а) с 800 мл разбавляющей воды, добавьте по 1 мл растворов (б) к (г) и доведите до 1 л разбавляющей водой.

IV.2.3. Приготовление и предварительное кондиционирование инокулята

Инокулят может быть получен из различных источников: активного ила; канализационные стоки; поверхностные воды; почвы или из их смеси.

См. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. и I.6.5.

IV.2.4. Подготовка колб

В качестве примера следующие объемы и массы указывают значения для 5-литровых колб, содержащих 3 л суспензии. Если используются меньшие объемы, измените значения соответствующим образом, но убедитесь, что образующийся углекислый газ можно измерить точно.

В каждую 5-литровую колбу добавляют по 2 400 мл минеральной среды. Добавляют соответствующий объем подготовленного активного ила (см. I.6.4.1 и I.6.5) до достижения концентрации взвешенных веществ не более 30 мг/л в конечных 3 л инокулированной смеси. В альтернативном варианте подготовленный ил сначала разбавляют до получения суспензии 500-1000 мг/л в минеральной среде, а затем добавляют аликвоту к содержимому 5-литровой колбы до достижения концентрации 30 мг/л; это обеспечивает большую точность. Могут быть использованы другие источники инокулята (см. I.6.4.2.).

Аэрируйте эти инокулированные смеси воздухом, не содержащим CO2, в течение ночи, чтобы очистить систему от углекислого газа.

Добавляют испытуемый материал и эталонное вещество отдельно в известном объеме исходных растворов для повторения колб до достижения концентрации, обусловленной добавленными химикатами, от 10 до 20 мг DOC или TOC/л; оставьте некоторые колбы без добавления химикатов в качестве контроля инокулята. Добавляйте плохо растворимые тестируемые вещества непосредственно в колбы по весу или объему или обрабатывайте, как описано в Приложении III.

При необходимости используйте одну колбу для проверки возможного ингибирующего эффекта тестируемого химиката, добавляя тестируемый и эталонный химикаты в тех же концентрациях, которые присутствуют в других колбах.

Также, если необходимо, используйте стерильную колбу, чтобы проверить, не разлагается ли испытуемое химическое вещество абиотически, используя незасеянный раствор химического вещества (см. I.6.6). Стерилизовать добавлением токсичного вещества в соответствующей концентрации.

Доводят объемы суспензий во всех колбах до 3 л добавлением минеральной среды, предварительно аэрированной воздухом, не содержащим CO2. По желанию пробы могут быть отобраны для анализа DOC (см. Приложение II.4.) и/или специального анализа. Подсоедините поглотительные бутылки к воздуховыпускным отверстиям колб.

При использовании гидроксида бария к каждой 5-литровой колбе последовательно подключают три абсорбционные бутылки, содержащие по 100 мл 0,0125 М раствора гидроксида бария. Раствор не должен содержать выпавших в осадок сульфатов и карбонатов, а его крепость необходимо определять непосредственно перед применением. Если используется гидроксид натрия, соедините две ловушки, причем вторая будет служить контролем, чтобы продемонстрировать, что весь углекислый газ был поглощен первой. Подходят абсорбционные флаконы с крышками для бутылей с сывороткой. В каждую бутылку добавляют по 200 мл 0,05 М гидроксида натрия, что достаточно для поглощения всего количества углекислого газа, выделяющегося при полном разложении испытуемого химиката. Раствор гидроксида натрия, даже свежеприготовленный, будет содержать следы карбонатов; это корректируется вычетом содержания карбоната в бланке.

IV.2.5. Количество колб в типичном цикле

Колбы 1 и 2: Испытательная суспензия

Колбы 3 и 4: бланк инокулята.

Колба 5: Контроль процедуры и, желательно и при необходимости:

Колба 6: Абиотический стерильный контроль

Колба 7: Контроль токсичности

См. также I.6.7.

IV.2.6. Производительность теста

Начните тест с барботирования суспензий воздухом, не содержащим CO2, со скоростью 30–100 мл/мин. Периодически отбирайте пробы поглотителя углекислого газа для анализа содержания CO2. В течение первых десяти дней рекомендуется проводить анализы каждый второй или третий день, а затем каждый пятый день до 28-го дня, чтобы можно было определить 10-дневный период окна.

На 28-й день отберите пробы (по желанию) для ДОУ и/или специфического анализа, измерьте pH суспензий и добавьте в каждую колбу по 1 мл концентрированной соляной кислоты; аэрируйте колбы на ночь, чтобы удалить углекислый газ, присутствующий в тестируемых суспензиях. На 29 день делают последний анализ выделяющегося углекислого газа.

В дни измерения СО2 отсоединяют ближайший к колбе поглотитель гидроксида бария и титруют раствор гидроксида 0,05 М HCl, используя в качестве индикатора фенолфталеин. Переместите оставшиеся поглотители на одно место ближе к колбе и поместите в дальнем конце ряда новый поглотитель, содержащий 100 мл свежего 0,0125 М гидроксида бария. Производите титрование по мере необходимости, например, когда в первой ловушке наблюдается значительное осаждение и до того, как оно появится во второй, или, по крайней мере, еженедельно. В качестве альтернативы, используя NaOH в качестве абсорбента, отберите шприцом небольшую пробу (в зависимости от характеристик используемого анализатора углерода) раствора гидроксида натрия из абсорбера, расположенного ближе к колбе. Введите образец в часть IC анализатора углерода для непосредственного анализа выделяющегося углекислого газа.

Анализируйте содержимое второй ловушки только в конце теста, чтобы внести поправку на любой перенос углекислого газа.

IV.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

IV.3.1. Обработка результатов

Количество CO2, улавливаемого абсорбером при титровании, определяется по формуле:

мгСО2 = (100 × СВ 0,5 × В × СА) × 44

где:

V = объем HCl, использованный для титрования 100 мл абсорбера (мл),

CB = концентрация раствора гидроксида бария (М),

CA = концентрация раствора соляной кислоты (М),

если CB составляет 0,0125 М, а CA составляет 0,05 М, то титрование для 100 мл гидроксида бария составляет 50 мл, а масса CO2 определяется по формуле:

0,052 × 44 × мл титрованной HCl = 1,1 × мл HCl

Таким образом, в данном случае для пересчета объема титрованной HCl в мг произведенного CO2 коэффициент равен 1,1.

Рассчитайте массу CO2, полученную только из инокулята и из инокулята плюс тестируемое вещество, используя соответствующие значения титрования, и разница представляет собой массу CO2, полученную только из тестируемого химиката.

Например, если только инокулят дает титрование 48 мл, а инокулят плюс тестируемое вещество дает 45 мл,

CO2 из инокулята = 1,1 × (50-48) = 2,2 мг

CO2 из инокулята плюс тестируемое вещество = 1,1 × (50-45) = 5,5 мг, и, таким образом, масса CO2, полученного из тестируемого химиката, составляет 3,3 мг.

Процент биоразложения рассчитывается по формуле:

% разложения = ThCO2 × мг добавленного тестируемого химиката, мг произведенного CO2 × 100

или,

% разложения = мг TOC, добавленного в тесте × 3,67 мг произведенного CO2 × 100

3,67 — коэффициент перевода углерода в диоксид углерода (44/12).

Получите процентное ухудшение после любого временного интервала, сложив процентные значения ThCO2, рассчитанные для каждого дня до того времени, в которое оно было измерено.

Для поглотителей гидроксида натрия рассчитайте количество образующегося диоксида углерода, выраженное в IC (мг), путем умножения концентрации IC в абсорбенте на объем абсорбента.

Рассчитайте процент деградации по формуле:

% ThCO2 = мг IC из тестовой колбы мг IC из бланка мг TOC, добавленного в качестве тестируемого химиката × 100

Рассчитайте удаление DOC (необязательно), как описано в разделе I.7. Запишите эти и все другие результаты в прилагаемые таблицы данных.

IV.3.2. Достоверность результатов

Содержание IC суспензии испытуемого химического вещества в минеральной среде в начале испытания должно быть менее 5 % от ОК, а общее выделение CO2 в бланке инокулята в конце испытания обычно не должно превышать 40 мг/ч. Я средний. Если получены значения, превышающие 70 мг CO2/литр, данные и методику эксперимента следует проанализировать критически.

См. также I.5.2.

IV.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

IV.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

ТЕСТ НА ВЫДЕЛЕНИЕ УГЛЕОКСИДА

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/литр в качестве химиката

Начальная конц. в среде: мг/литр в качестве химиката

Всего C, добавленного в колбу: мг C

ThCO2: мг CO2

4. ТРАВМЫ

Источник:

Назначено лечение:

Предварительное кондиционирование, если таковое имеется:

Концентрация взвешенных веществ в реакционной смеси: мг/литр

5. ПРОИЗВОДСТВО УГЛЕОКСИДА И СПОСОБНОСТЬ РАЗГЛАЖИВАНИЯ

Метод: Ba(OH)2/NaOH/другое.

>ТАБЛИЦА>

6. УГЛЕРОДНЫЙ АНАЛИЗ (опционально)

Анализатор углерода:

>ТАБЛИЦА>

% удаленного DOC = 1 Ct Cb(t) CoCb(o) × 100

7. АБИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ (по желанию)

% абиотического разложения = образование CO2 в стерильной колбе через 28 дней (мг)ThCO2 (мг) × 100

ЧАСТЬ V. МАНОМЕТРИЧЕСКАЯ РЕСПИРОМЕТРИЯ (Метод C.4-D)

В.1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Измеренный объем инокулированной минеральной среды, содержащей известную концентрацию испытуемого вещества (100 мг/л испытуемого вещества, чтобы получить по меньшей мере 50-100 мг ThOD/л) в качестве номинального единственного источника органического углерода, перемешивают в закрытой колбе при постоянной температуре (± 1 С или ближе) до 28 дней. Потребление кислорода определяют либо путем измерения количества кислорода (полученного электролитическим путем), необходимого для поддержания постоянного объема газа в колбе респирометра, либо по изменению объема или давления (или их комбинации) в аппарате. Выделившийся углекислый газ поглощают раствором гидроксида калия или другим подходящим абсорбентом. Количество кислорода, поглощенное тестируемым химикатом (с поправкой на поглощение холостым инокулятом, проводимым параллельно), выражается в процентах от ThOD или COD. Необязательно, первичную биодеградацию можно также рассчитать на основе дополнительного специфического анализа, проведенного в начале и конце инкубации, а конечную биодеградацию - с помощью анализа DOC.

Т.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

В.2.1. Оборудование

(а) подходящий респирометр;

(б) контроль температуры, поддержание ± 1°С или выше;

(c) узел мембранной фильтрации (дополнительно);

(d) анализатор углерода (опционально).

В.2.2. Приготовление минеральной среды

Информацию о приготовлении исходных растворов см. в I.6.2.

Смешайте 10 мл раствора (а) с 800 мл разбавляющей воды, добавьте по 1 мл растворов (б) к (г) и доведите объем до 1 л водой для разбавления.

В.2.3. Приготовление и предварительное кондиционирование инокулята

Инокулят может быть получен из различных источников: активного ила; канализационные стоки; поверхностные воды и почвы или их смесь.

См. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. и I.6.5.

В.2.4. Подготовка колб

Приготовьте растворы тестируемого и эталонного химикатов отдельными партиями в минеральной среде, эквивалентной концентрации, как правило, 100 мг химического вещества/литр (что дает не менее 50-100 мг ThOD/литр), используя исходные растворы.

Рассчитайте ThOD на основе образования солей аммония, если не предполагается нитрификация, тогда как расчет должен быть основан на образовании нитратов (см. Приложение II.2.)

Определите значения pH и при необходимости доведите их до 7,4 ± 0,2.

Плохо растворимые вещества следует добавлять на более позднем этапе (см. ниже).

Если необходимо определить токсичность испытуемого химиката, приготовьте дополнительный раствор в минеральной среде, содержащий как испытуемый, так и эталонный химикаты в тех же концентрациях, что и в отдельных растворах.

Если требуется измерение физико-химического поглощения кислорода, приготовьте раствор испытуемого химиката, обычно с концентрацией 100 мг ThOD/л, который был стерилизован добавлением подходящего токсичного вещества (см. I.6,6). .

Внесите необходимый объем растворов тестируемого и эталонного химикатов соответственно как минимум в дублирующие колбы. В последующие колбы добавляйте только минеральную среду (для контролей инокулята) и, если необходимо, смешанный раствор тестируемого/эталонного химического вещества и стерильный раствор.

Если испытуемое химическое вещество плохо растворимо, добавьте его непосредственно на этом этапе в расчете на вес или объем или обращайтесь с ним, как описано в Приложении III. Добавьте в отсеки поглотителя CO2 гидроксид калия, гранулы натронной извести или другой абсорбент.

В.2.5. Количество колб в типичном цикле

Колбы 1 и 2: Испытательная суспензия

Колбы 3 и 4: бланк инокулята.

Колба 5: Контроль процедуры

желательно и при необходимости:

Колба 6: Стерильный контроль

Колба 7: Контроль токсичности

См. также I.6.7.

В.2.6. Производительность теста

Дайте сосудам достичь желаемой температуры и инокулируйте соответствующие сосуды подготовленным активным илом или другим источником инокулята для получения концентрации взвешенных твердых веществ не более 30 мг/литр. Соберите оборудование, запустите мешалку, проверьте герметичность и начните измерение поглощения кислорода. Обычно никакого дополнительного внимания не требуется, кроме снятия необходимых показаний и ежедневных проверок, чтобы убедиться, что поддерживается правильная температура и достаточное перемешивание.

Рассчитайте поглощение кислорода на основе показаний, снятых через регулярные и частые промежутки времени, используя методы, указанные производителем оборудования. В конце инкубации, обычно 28 дней, измеряют pH содержимого колб, особенно если поглощение кислорода ниже или превышает ThODNH4 (для азотсодержащих соединений).

При необходимости сначала и в конце отберите пробы из колб респирометра для анализа DOC или конкретного химического вещества (см. Приложение II.4). При первоначальном отборе убедитесь, что известен объем тестируемой суспензии, оставшейся в колбе. Когда кислород поглощается N-содержащим испытуемым веществом, определяют увеличение концентрации нитритов и нитратов за 28 дней и рассчитывают поправку на кислород, потребляемый при нитрификации (приложение V).

В.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

В.3.1. Обработка результатов

Разделите поглощение кислорода (мг) тестируемого химиката через заданное время (с поправкой на контроль холостого инокулята через то же время) на массу использованного тестируемого химиката. Это дает БПК, выраженный в мг кислорода/мг тестируемого химиката, т.е.

БПК = мг поглощения O2 тестируемым химикатом мг поглощения O2 холостым раствором мг тестируемого химиката в колбе

= мг O2 на мг тестируемого химиката.

рассчитайте процент биоразложения либо из:

% биоразложения = % ThOD = БПК (мг O2/мг химического вещества)ThOD (мг O2 химического вещества) × 100,

или форма

% ХПК = БПК (мг O2/мг химического вещества) ХПК (мг O2/мг химического вещества) × 100

Следует отметить, что эти два метода не обязательно дают одинаковую ценность; предпочтительнее использовать первый метод.

Для испытуемых веществ, содержащих азот, используйте соответствующий ThOD (NH4 или NO3) в соответствии с тем, что известно или ожидается о возникновении нитрификации (Приложение II.2). Если нитрификация происходит, но не является полной, рассчитайте поправку на кислород, потребляемый при нитрификации, исходя из изменений концентрации нитритов и нитратов (приложение V).

Если проводятся дополнительные определения органического углерода и/или конкретных химических веществ, рассчитывают процентное разложение, как описано в I.7.

Запишите все результаты в прилагаемые таблицы данных.

В.3.2. Достоверность результатов

Поглощение кислорода бланком инокулята обычно составляет 20-30 мг O2/литр и не должно превышать 60 мг/литр за 28 дней. Значения выше 60 мг/литр требуют критического анализа данных и экспериментальных методов. Если значение pH выходит за пределы диапазона 6–8,5 и потребление кислорода испытуемым веществом менее 60 %, испытание следует повторить с более низкой концентрацией испытуемого вещества.

См. также I.5.2.

В.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

В.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

МАНОМЕТРИЧЕСКИЙ РЕСПИРОМЕТРИЧЕСКИЙ ТЕСТ

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/литр

Начальная концентрация в среде, Co: мг/л

Объем в пробирке (V): мл

ThOD или COD: мг O2/мг тестируемого вещества (NH4, NO3)

4. ТРАВМЫ

Источник:

Назначено лечение:

Предварительное кондиционирование, если таковое имеется:

Концентрация взвешенных веществ в реакционной смеси: мг/л

5. ПОГЛОЩЕНИЕ КИСЛОРОДА: БИОРАЗЛАГАЕМОСТЬ

>ТАБЛИЦА>

6. ПОПРАВКА НА НИТРИФИКАЦИЮ (см. Приложение V)

>ТАБЛИЦА>

7. УГЛЕРОДНЫЙ АНАЛИЗ (опционально)

Анализатор углерода:

>ТАБЛИЦА>

% удаленного DOC = 1 Ct Cblt Co Cblo × 100

8. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХИМИКАТЫ (дополнительно)

Sb = концентрация в физико-химическом (стерильном) контроле через 28 дней.

Sa = концентрация в засеянной колбе через 28 дней.

% биоразложения = Sb SaSb × 100

9. АБИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ (по желанию)

а = потребление кислорода в стерильных колбах через 28 дней, (мг)

потребление кислорода на мг тестируемого вещества = CoVa (см. разделы 1 и 3)

% абиотического разложения = CoV × ThODa × 100

ЧАСТЬ ШЕСТАЯ. ИСПЫТАНИЕ В ЗАКРЫТОЙ БУТЫЛКЕ (Метод C.4-E)

VI.1. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Раствор испытуемого вещества в минеральной среде, обычно в концентрации 2-5 мг/л, инокулируют относительно небольшим количеством микроорганизмов из смешанной популяции и хранят в полностью заполненных закрытых флаконах в темноте при постоянной температуре. За разложением следует анализ растворенного кислорода в течение 28-дневного периода. Количество кислорода, поглощенное тестируемым химикатом, с поправкой на поглощение параллельным холостым инокулятом выражается в процентах от ThOD или COD.

VI.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

VI.2.1. Оборудование

а) флаконы БПК со стеклянными пробками, например 250-300 мл;

б) водяная баня или инкубатор для хранения бутылочек при постоянной температуре (± 1°С или выше) при исключении света;

в) Большие стеклянные бутылки (2-5 литров) для приготовления сред и наполнения бутылей БПК;

г) Кислородный электрод и измеритель или оборудование и реагенты для титрования Винклера.

VI.2.2. Приготовление минеральной среды

Информацию о приготовлении исходных растворов см. в I.6.2.

Смешайте 1 (один) мл раствора (a)-(d) и доведите до 1 л водой для разбавления.

VI.2.3. Приготовление инокулята

Инокулят обычно получают из вторичных сточных вод очистных сооружений или лабораторных установок, куда поступают преимущественно бытовые сточные воды. Альтернативным источником инокулята являются поверхностные воды. Обычно используют от одной капли (0,05 мл) до 5 мл фильтрата на литр среды; могут потребоваться испытания для определения оптимального объема для данного стока (см. I.6.4.2 и I.6.5).

VI.2.4. Подготовка колб

Сильно аэрируют минеральную среду не менее 20 мин. Каждую серию испытаний проводят на минеральной среде, полученной из одной и той же партии. Как правило, среда готова к использованию после выдерживания в течение 20 часов при температуре испытания. Определить концентрацию растворенного кислорода для целей контроля; значение должно составлять около 9 мг/л при 20 C. Все операции по перекачке и заполнению насыщенной воздухом среды следует проводить без пузырьков, например, с помощью сифонов.

Подготовьте параллельные группы бутылок БПК для определения тестируемых и эталонных химикатов в одновременных экспериментальных сериях. Соберите достаточное количество бутылей с БПК, включая бланки для инокулята, чтобы можно было провести как минимум повторные измерения потребления кислорода через желаемые интервалы тестирования, например, через 0, 7, 14, 21 и 28 дней. Чтобы обеспечить возможность определения 10-дневного окна, может потребоваться больше бутылок.

В большие бутылки добавьте полностью аэрированную минеральную среду так, чтобы они были заполнены примерно на одну треть. Затем добавьте достаточное количество исходных растворов испытуемого химиката и эталонного химиката в отдельные большие бутыли так, чтобы конечная концентрация химикатов обычно не превышала 10 мг/литр. Не добавляйте никаких химикатов в контрольную среду, содержащуюся в следующей большой бутыли.

Чтобы гарантировать, что активность инокулята не ограничена, концентрация растворенного кислорода не должна опускаться ниже 0,5 мг/литр во флаконах с БПК. Это ограничивает концентрацию тестируемого химиката примерно до 2 мг/литр. Однако для плохо разлагаемых соединений и соединений с низким ThOD можно использовать 5–10 мг/литр. В некоторых случаях было бы целесообразно провести параллельную серию тестовых химикатов в двух разных концентрациях, например, 2 и 5 мг/литр. Обычно ThOD рассчитывают на основе образования солей аммония, но если ожидается или известно, что произойдет нитрификация, рассчитывают на основе образования нитрата (ThODNO3: см. Приложение II.2). Однако если нитрификация не завершена, но происходит, внесите поправку на изменения концентрации нитритов и нитратов, определенные анализом (см. Приложение V).

Если необходимо исследовать токсичность испытуемого химического вещества (например, в случае, если ранее было обнаружено низкое значение биоразлагаемости), необходима еще одна серия бутылок.

Подготовьте еще одну большую бутыль, содержащую аэрированную минеральную среду (около одной трети ее объема), а также испытуемый химикат и эталонный химикат в конечных концентрациях, обычно таких же, как в других больших бутылях.

Инокулируют растворы в больших бутылях вторичными стоками (одна капля или около 0,05 мл, до 5 мл/литр) или другим источником, например, речной водой (см. I.6.4.2.). Наконец, доведите объем растворов аэрированной минеральной средой, используя шланг, доходящий до дна бутылки, чтобы обеспечить адекватное перемешивание.

VI.2.5. Количество колб в типичном цикле

В типичном цикле используются следующие бутылки:

не менее 10, содержащих тестируемое химическое вещество и инокулят (тестовая суспензия),

по меньшей мере 10, содержащих только инокулят (холостой инокулят),

не менее 10, содержащих эталонный химикат и инокулят (контроль процедуры),

и, при необходимости, 6 флаконов, содержащих тестируемый химикат, эталонный химикат и инокулят (контроль токсичности). Однако для того, чтобы обеспечить возможность определения 10-дневного окна, потребуется примерно вдвое больше бутылок.

VI.2.6. Производительность теста

Немедленно дозируйте каждый приготовленный раствор в соответствующую группу бутылок с БПК с помощью шланга из нижней части (не дна) соответствующей большой бутылки так, чтобы все бутылки с БПК были полностью заполнены. Аккуратно постучите, чтобы удалить пузырьки воздуха. Немедленно проанализируйте бутыли с нулевым временем на наличие растворенного кислорода методом Винклера или электродным методом. Содержимое бутылей можно сохранить для последующего анализа по методу Винклера, добавив сульфат марганца (II) и гидроксид натрия (первый реактив Винклера). Тщательно закупоренные флаконы, содержащие кислород, фиксированный в виде коричневого гидратированного оксида марганца (III), хранят в темноте при температуре 10-20°С не более 24 часов, прежде чем приступить к остальным этапам метода Винклера. Закройте оставшиеся флаконы-реплицы пробками, убедившись, что в них нет пузырьков воздуха, и инкубируйте при температуре 20°С в темноте. Каждая серия должна сопровождаться полной параллельной серией для определения инокулированной холостой среды. Извлекайте по крайней мере дубликаты бутылей всех серий для анализа растворенного кислорода через определенные промежутки времени (минимум еженедельно) в течение 28 дней инкубации.

Еженедельные пробы должны позволять оценивать процент удаления в 14-дневном окне, тогда как отбор проб каждые 3-4 дня должен позволять идентифицировать 10-дневное окно, для чего потребуется примерно в два раза больше бутылок.

Для испытуемых веществ, содержащих азот, следует внести поправки на поглощение кислорода в результате любой происходящей нитрификации. Для этого используют О2-электродный метод определения концентрации растворенного кислорода, а затем отбирают пробу из БПК-флакона для анализа на нитриты и нитраты. По увеличению концентрации нитритов и нитратов рассчитайте использованный кислород (см. приложение V).

VI.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

VI.3.1. Обработка результатов

Сначала рассчитайте БПК, возникающий после каждого периода времени, вычитая истощение кислорода (мг O2/литр) контрольного инокулята из показателя, демонстрируемого тестируемым химикатом. Разделите это скорректированное истощение на концентрацию (мг/литр) тестируемого химиката, чтобы получить конкретный БПК в мг кислорода на мг тестируемого химиката. Рассчитайте процентную биоразлагаемость, разделив конкретную БПК на конкретную ThOD (рассчитывается в соответствии с Приложением II.2) или ХПК (определяется путем анализа, см. Приложение II.3),

таким образом:

БПК = мг поглощения O2 тестируемым химикатом мг поглощения O2 холостым раствором мг тестируемого химиката в колбе

= мг O2 на мг тестируемого вещества

% разложения = БПК (мг O2/мг тестируемого химиката) ThOD (мг O2/мг тестируемого химиката) × 100

или

% разложения = БПК (мг O2/мг тестируемого химиката) ХПК (мг O2/мг тестируемого химиката) × 100

Следует отметить, что эти два метода не обязательно дают одинаковую ценность; предпочтительнее использовать первый метод.

Для испытуемых веществ, содержащих азот, используйте соответствующий ThOD (NH4 или NO3) в соответствии с тем, что известно или ожидается о возникновении нитрификации (Приложение II.2). Если нитрификация происходит, но не является полной, рассчитайте поправку на кислород, потребляемый при нитрификации, исходя из изменений концентрации нитритов и нитратов (приложение V).

VI.3.2. Достоверность результатов

Обеднение кислорода в бланке инокулята не должно превышать 1,5 мг растворенного кислорода/литр через 28 дней. Значения выше этого требуют изучения экспериментальной техники. Остаточная концентрация кислорода в тестовых бутылях никогда не должна опускаться ниже 0,5 мг/л. Такие низкие уровни кислорода действительны только в том случае, если используемый метод определения растворенного кислорода позволяет точно измерить такие уровни.

См. также I.5.2.

VI.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

VI.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

ТЕСТ ЗАКРЫТОЙ БУТЫЛКИ

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/литр

Начальная концентрация в бутылке: мг/литр.

ThOD или COD: мгO2/мг тестируемого вещества

4. ТРАВМЫ

Источник:

Назначено лечение:

Предварительное кондиционирование, если таковое имеется:

Концентрация в реакционной смеси: мг/литр

5. ПРИНЯТЬ РЕШЕНИЕ

Метод: Винклер/электрод.

>ТАБЛИЦА>

6. ПОПРАВКА НА НИТРИФИКАЦИЮ (см. Приложение V)

>ТАБЛИЦА>

7. ИСТОЩЕНИЕ: % ДЕГРАДАЦИИ

>ТАБЛИЦА>

mto = значение в тестовой колбе в момент времени 0

mtx = значение в тестовой колбе в момент времени x

mbo = среднее пустое значение в момент времени 0

mbx = среднее пустое значение в момент времени x

Примените также поправку на нитрификацию из iii+vi в разделе 6.

8. ПУСТОЕ ИСТОЩЕНИЕ ДО

Потребление кислорода по холостому опыту: (mbo mb28) мг/литр. Этот расход важен для достоверности теста. Оно должно быть менее 1,5 мг/литр.

ЧАСТЬ VII. М.И.Т.И. ТЕСТ (Метод C.4-F)

VII.1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Поглощение кислорода перемешанным раствором или суспензией тестируемого вещества в минеральной среде, инокулированной специально выращенными неадаптированными микроорганизмами, измеряется автоматически в течение 28 дней в затемненном закрытом респирометре при температуре 25 ± 1 C. Выделившийся углекислый газ поглощается натронной известью. Биоразлагаемость выражается как процент поглощения кислорода (с поправкой на холостой поглощение) от теоретического поглощения (ThOD). Процент первичной биоразлагаемости также рассчитывают на основе дополнительного специфического химического анализа, проводимого в начале и в конце инкубации, и, необязательно, с помощью анализа DOC.

VII.2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

VII.2.1. Оборудование

(a) Автоматический электролитический измеритель БПК или респирометр, обычно оснащенный 6 бутылями по 300 мл каждая и чашками для содержания абсорбента CO2;

(b) Комната с постоянной температурой и/или водяная баня 25°С ± 1°С или выше;

(c) Узел мембранной фильтрации (опционально);

(d) Анализатор углерода (опция).

VII.2.2. Приготовление минеральной среды

Приготовьте следующие исходные растворы, используя реагенты аналитической степени чистоты и воду (I.6.1.):

(а) Монокалий дигидроортофосфат, KH2PO4 8,50 г

Дикалий моногидроортофосфат, K2HPO4 21,75 г

Додекагидрат ортофосфата динатрия моногидрофосфата Na2HPO4 12 H2O 44,60 г

Хлорид аммония, NH4Cl 1,70 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

Значение pH раствора должно составлять 7,2.

(б) Гептагидрат сульфата магния, MgSO4 7 H2O 22,50 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

(в) Хлорид кальция безводный, CaCl2 27,50 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

(г) хлорид железа (III) гексагидрат, FeCl3 6 H2O 0,25 г

Растворить в воде и довести до 1 л.

Возьмите по 3 мл каждого раствора (а), (б), (в) и (г) и доведите объем до 1 л.

VII.2.3. Приготовление инокулята

Соберите свежие пробы не менее чем с десяти объектов, главным образом в районах, где используются и сбрасываются различные химические вещества. На таких объектах, как очистные сооружения, очистные сооружения промышленных сточных вод, реки, озера, моря, соберите 1 л проб ила, поверхностной почвы, воды и т. д. и тщательно перемешайте. После удаления плавающих веществ и выдерживания доведите pH надосадочной жидкости до 7 ± 1 с помощью гидроксида натрия или фосфорной кислоты.

Используйте соответствующий объем отфильтрованного супернатанта для заполнения сосуда с активным илом для наполнения и забора и аэрации жидкости в течение примерно 23 1/2 часов. Через тридцать минут после прекращения аэрации отбросьте около одной трети всего объема надосадочной жидкости и добавьте к осевшему материалу равный объем раствора (рН 7), содержащего по 0,1 % глюкозы, пептона и монокалийного ортофосфата, и возобновите аэрацию. . Повторяйте эту процедуру один раз в день. Установка для сбора ила должна работать в соответствии с надлежащей практикой: сточные воды должны быть прозрачными, температура должна поддерживаться на уровне 25 ± 2 C, pH должен быть 7 ± 1, ил должен хорошо оседать, достаточная аэрация, чтобы смесь всегда оставалась аэробной, простейшие должны присутствовать, а активность ила следует тестировать по эталонному веществу не реже одного раза в три месяца. Не используйте ил в качестве инокулята до истечения как минимум одного месяца эксплуатации, но не более четырех месяцев. После этого отбирайте образцы как минимум из 10 участков через регулярные промежутки времени, один раз в три месяца.

Чтобы поддерживать одинаковую активность свежего и старого ила, смешайте отфильтрованный супернатант используемого активного ила с равным объемом отфильтрованного супернатанта свежесобранной смеси из десяти источников и культивируйте объединенную жидкость, как указано выше. Возьмите осадок для использования в качестве инокулята через 18–24 часа после подачи в аппарат.

VII.2.4. Подготовка колб

Подготовьте следующие шесть колб:

№ 1: тестируемое химическое вещество в воде для разбавления при концентрации 100 мг/л.

№ 2, 3 и 4: тестируемое вещество в минеральной среде при концентрации 100 мг/л.

№ 5: эталонный химикат (например, анилин) в минеральной среде в концентрации 100 мг/л.

№ 6: только минеральная среда

Добавляйте плохо растворимые тестируемые химикаты непосредственно по весу или объему или обрабатывайте, как описано в Приложении III, за исключением того, что не следует использовать ни растворители, ни эмульгаторы. Добавьте абсорбент CO2 во все колбы в специальных чашках, входящих в комплект поставки. Отрегулируйте pH в колбах №. 2, 3 и 4 по 7,0.

VII.2.5. Производительность теста

Инокуляционные колбы №. 2, 3 и 4 (испытательные суспензии), №. 5 (контроль активности) и №. 6 (холостой инокулят) с небольшим объемом инокулята для получения концентрации взвешенных веществ 30 мг/л. N инокулята добавляют в колбу №. 1, который служит абиотическим контролем. Соберите оборудование, проверьте герметичность, запустите мешалки и приступите к измерению поглощения кислорода в условиях темноты. Ежедневно проверяйте температуру, мешалку и кулонометрический регистратор поглощения кислорода и отмечайте любые изменения цвета содержимого колб. Считайте поглощение кислорода для шести колб непосредственно подходящим методом, например, с помощью шеститочечного самописца, который создает кривую БПК. В конце инкубации, обычно 28 дней, измерьте pH содержимого колб и определите концентрацию остаточного тестируемого химиката и любого промежуточного продукта, а в случае водорастворимого вещества - концентрацию DOC (Приложение II.4). ). Будьте особенно осторожны с летучими химическими веществами. Если ожидается нитрификация, по возможности определите концентрацию нитратов и нитритов.

VII.3. ДАННЫЕ И ОТЧЕТНОСТЬ

VII.3.1. Обработка результатов

Разделите поглощение кислорода (мг) испытуемым химикатом через заданное время с поправкой на поглощение холостого контрольного инокулята через то же время на массу используемого испытуемого химиката. Это дает БПК, выраженный в мг кислорода/мг тестируемого химиката, то есть:

БПК = поглощение O2 в мг тестируемого химиката, мг поглощения O2 холостым веществом, мг тестируемого химиката в колбе = мг O2/мг тестируемого химиката.

Процент биоразложения затем получается из:

% биоразложения = % ThOD = БПК (мг O2/мг химического вещества) ThOD (мг O2/мг химического вещества) × 100

Для смесей рассчитывайте ThOD на основе элементного анализа, как для простого соединения. Используйте соответствующий ThOD (ThODNH4 или ThODNO3) в зависимости от того, отсутствует или завершена нитрификация (Приложение II.2). Однако если нитрификация происходит, но является неполной, внесите поправку на кислород, потребляемый при нитрификации, рассчитанный на основе изменений концентраций нитритов и нитратов (Приложение V).

Рассчитайте процент первичного биоразложения в результате потери конкретного (исходного) химического вещества (см. I.7,2).

Dt = Sb SaSb × 100 %

Если произошла потеря тестируемого химиката в колбе №. 1, измеряя физико-химическое удаление, запишите это и используйте концентрацию тестируемого химиката (Sb) через 28 дней в этой колбе для расчета процентного биоразложения.

После определения DOC (необязательно) рассчитайте процент окончательного биоразложения по формуле:

Dt = 1 Ct Cbt Co Cbo × 100%

как описано в пункте I.7.1. Если произошла потеря DOC в колбе №. 1, измеряя физико-химическое удаление, используйте концентрацию DOC в этой колбе для расчета процентного биоразложения.

Запишите все результаты в прилагаемые таблицы данных.

VII.3.2. Достоверность результатов

Поглощение кислорода бланком инокулята обычно составляет 20-30 мг O2/л и не должно превышать 60 мг/л за 28 дней. Значения выше 60 мг/л требуют критического анализа данных и экспериментальных методов. Если значение pH выходит за пределы диапазона 6–8,5 и потребление кислорода испытуемым веществом менее 60 %, испытание следует повторить с более низкой концентрацией испытуемого вещества.

См. также I.5.2.

Если процентная деградация анилина, рассчитанная по потреблению кислорода, не превышает 40 % через 7 суток и 65 % через 14 суток, испытание считается недействительным.

VII.3.3. Составление отчетов

См. I.8.

VII.4. ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ

Пример технического паспорта приведен ниже.

МИФЫ (I) ТЕСТ

1. ЛАБОРАТОРИЯ

2. ДАТА НАЧАЛА ИСПЫТАНИЯ

3. ИСПЫТАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО

Имя:

Концентрация исходного раствора: мг/л в качестве химиката

Начальная концентрация в среде, Co: мг/л как хим.

Объем реакционной смеси, V: мл

ThOD: мг O2/л

4. ТРАВМЫ

Места отбора проб осадка:

1) ...

2) ...

3) ...

4) ...

5) ...

6) ...

7) ...

8) ...

9) ...

10) ...

Концентрация взвешенных веществ в активном иле после акклиматизации синтетическими сточными водами = ... мг/л.

Объем активного ила на литр конечной среды = ... мл.

Концентрация ила в конечной среде = ... мг/л

5. ПОГЛОЩЕНИЕ КИСЛОРОДА: БИОРАЗЛАГАЕМОСТЬ

Тип используемого респирометра:

>ТАБЛИЦА>

6. УГЛЕРОДНЫЙ АНАЛИЗ (опционально):

Анализатор углерода:

>ТАБЛИЦА>

% удаленного DOC: a (b c)a × 100

7. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

>ТАБЛИЦА>

% деградации = Sb SaSb × 100

Рассчитайте % разложения для колб a1, a2 и a3 соответственно.

8. ПРИМЕЧАНИЯ

Кривая БПК от времени, если таковая имеется, должна быть приложена.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

СОКРАЩЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

DO: Растворенный кислород (мг/л) — это концентрация кислорода, растворенного в водной пробе.

БПК: Биохимическая потребность в кислороде (г) – это количество кислорода, потребляемое микроорганизмами при метаболизме тестируемого соединения; также выражается как г поглощения кислорода на г испытуемого соединения. (См. метод С.5).

ХПК: Химическая потребность в кислороде (г) – это количество кислорода, потребляемое при окислении испытуемого соединения горячим кислым дихроматом; он позволяет измерить количество присутствующего окисляемого вещества; также выражается в г потребляемого кислорода на г испытуемого соединения. (См. метод С.6).

DOC: Растворенный органический углерод – это органический углерод, присутствующий в растворе или который проходит через фильтр с размером пор 0,45 микрометра или остается в надосадочной жидкости после центрифугирования при 40 000 мс 2 (± 4 000 g) в течение 15 мин.

ThOD: Теоретическая потребность в кислороде (мг) — это общее количество кислорода, необходимое для полного окисления химического вещества; он рассчитывается по молекулярной формуле (см. Приложение II.2) и также выражается в мг кислорода, необходимого на мг испытуемого соединения.

ThCO2: Теоретический диоксид углерода (мг) представляет собой количество диоксида углерода, рассчитанное на основе известного или измеренного содержания углерода в испытуемом соединении при полной минерализации; также выражается в мг выделенного диоксида углерода на мг испытуемого соединения.

TOC: Общий органический углерод образца представляет собой сумму органического углерода в растворе и во взвеси.

IC: Неорганический углерод

TC: Общий углерод — это сумма органического и неорганического углерода, присутствующего в образце.

Первичная биодеградация:

Это изменение химической структуры вещества, вызванное биологическим действием, приводящее к потере определенных свойств этого вещества.

Окончательное биоразложение (аэробное):

— уровень разложения, достигаемый при полном использовании испытуемого соединения микроорганизмами, что приводит к образованию углекислого газа, воды, минеральных солей и новых микробных клеточных компонентов (биомасса).

Легко биоразлагаемый:

произвольная классификация химических веществ, прошедших определенные проверочные тесты на максимальную биоразлагаемость; эти испытания настолько строгие, что предполагается, что такие соединения будут быстро и полностью биоразлагаться в водной среде в аэробных условиях.

По своей сути биоразлагаемый:

классификация химических веществ, для которых имеются недвусмысленные доказательства биоразложения (первичного или окончательного) в любом признанном тесте на биоразлагаемость.

Излечимость:

– это способность соединений удаляться при биологической очистке сточных вод без ущерба для нормального функционирования процессов очистки. Как правило, легко биоразлагаемые соединения поддаются лечению, но не все биоразлагаемые соединения поддаются лечению. Могут также иметь место абиотические процессы.

Время задержки – это время от инокуляции в тесте на вымирание до того, как процент разложения увеличится как минимум до 10%. Время задержки часто сильно варьируется и плохо воспроизводится.

Время деградации — это время от окончания периода задержки до момента достижения 90 % максимального уровня деградации.

10-дневное окно – это 10 дней сразу после достижения деградации на 10%.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

РАСЧЕТ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДХОДЯЩИХ СВОДНЫХ ПАРАМЕТРОВ

В зависимости от выбранного метода потребуются определенные сводные параметры. В следующем разделе описывается получение этих значений. Использование этих параметров описано в отдельных методах.

1. Содержание углерода

Содержание углерода рассчитывают по известному элементному составу или определяют посредством элементного анализа испытуемого вещества.

2. Теоретическая потребность в кислороде (ThOD)

Теоретическая потребность в кислороде (ThOD) может быть рассчитана, если элементный состав известен или определен посредством элементного анализа. Это для соединения:

CcHhClclNnNanaOoPpSs без нитрификации,

ThODNH4 = 16 [2 c + 1/2 (h cl 3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o]MW мг/мг

или с нитрификацией,

ThODNO3 = 16 [2 c + 1/2 (h cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o]MW мг/мг

3. Химическая потребность в кислороде (ХПК)

Химическую потребность в кислороде (ХПК) определяют по методу С.6.

4. Растворенный органический углерод (DOC).

Растворенный органический углерод (DOC) по определению представляет собой органический углерод любого химического вещества или смеси в воде, проходящий через фильтр с размером пор 0,45 микрометра.

Пробы из тестовых сосудов отбирают и немедленно фильтруют в фильтрующем аппарате с использованием соответствующего мембранного фильтра. Первые 20 мл (при использовании небольших фильтров количество можно уменьшить) фильтрата отбрасывают. Объемы 10-20 мл или меньше, если они введены (объем зависит от количества, необходимого для углеродного анализатора), сохраняются для анализа углерода. Концентрацию DOC определяют с помощью анализатора органического углерода, который способен точно измерять концентрацию углерода, эквивалентную или менее 10 % от исходной концентрации DOC, использованной в испытании.

Отфильтрованные образцы, которые невозможно проанализировать в тот же рабочий день, можно хранить в холодильнике при температуре 2–4°С в течение 48 часов или при температуре ниже 18°С в течение более длительного периода.

Примечания:

Мембранные фильтры часто пропитывают поверхностно-активными веществами для гидрофилизации. Таким образом, фильтр может содержать до нескольких мг растворимого органического углерода, который будет мешать определению биоразлагаемости. Поверхностно-активные вещества и другие растворимые органические соединения удаляются из фильтров путем кипячения их в деионизированной воде в течение трех периодов по одному часу каждый. Затем фильтры можно хранить в воде в течение одной недели. Если используются одноразовые фильтрующие картриджи, каждая партия должна быть проверена на предмет отсутствия выделения растворимого органического углерода.

В зависимости от типа мембранного фильтра тестируемое химическое вещество может удерживаться за счет адсорбции. Поэтому может быть целесообразным обеспечить, чтобы тестируемое химическое вещество не задерживалось фильтром.

Центрифугирование при 40 000 м·с 2 (4 000 g) в течение 15 мин может использоваться для дифференциации TOC и DOC вместо фильтрации. Метод ненадежен при начальной концентрации ПОЛОЖЕНИЕ ТАБЛИЦЫ>

0,05 М бура + 0,1 Н NaOH

>ТАБЛИЦА>