Девятая Директива Комиссии 81/715/EEC от 31 июля 1981 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

ДЕВЯТАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ от 31 июля 1981 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов (81/715/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов (1), с последними поправками, внесенными Актом о присоединении Греции, и в конкретную статью 2,

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, предусмотренным положениями, установленными законом, постановлением или административными действиями, касающимися качества и состава кормов, проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества;

Принимая во внимание, что Директивы Комиссии 71/250/EEC (2), 71/393/EEC (3), 72/199/EEC (4), 73/46/EEC (5), 74/203/EEC (6) , 75/84/EEC (7), 76/372/EEC (8) и 78/633/EEC (9), с последними поправками, внесенными Директивой от 30 июля 1981 г., уже установили ряд методов анализа Сообщества; тогда как ход работы с тех пор делает целесообразным принять девятый набор методов;

Принимая во внимание, что меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания в них авопарцина и монензина натрия проводились в соответствии с методами, описанными в Приложении.

Статья 2

Государства-члены ЕС должны ввести в действие законы, правила или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, 1 декабря 1981 г. и немедленно проинформировать об этом Сообщество.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 31 июля 1981 г.

Для Комиссии

Президент

Гастон ТОРН (1) OJ № L 170, 3 августа 1970 г., с. 2. (2) ОЖ № L 155, 12 июля 1971 г., с. 13. (3) ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7. (4) ОЖ № L 123, 29 мая 1972 г., с. 6. (5) ОЖ № L 83, 30 марта 1973 г., с. 21. (6) ОЖ № L 108, 22 апреля 1974 г., с. 7. (7) ОЖ № L 32, 5 февраля 1975 г., с. 26. (8) ОЖ № L 102, 15 апреля 1976 г., с. 8. (9) OJ No L 206, 29.07.1978, с. 43.

ПРИЛОЖЕНИЕ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АВОПАРКИНА МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАРНОЙ СРЕДЕ

1. ЦЕЛЬ И ОБЪЕМ

Метод предназначен для определения авопарцина в кормах и премиксах. Нижний предел определения — 2 мг/кг (2 ppm). Присутствие полиэфирных антибиотиков может помешать определению.

2. ПРИНЦИП

Пробу экстрагируют смесью ацетон/вода/соляная кислота. Антибиотическую активность экстракта определяют путем измерения диффузии авопарцина в агаризованной среде, инокулированной Bacillus subtilis. Диффузия проявляется образованием зон ингибирования микроорганизма. Диаметр этих зон принимают прямо пропорциональным логарифму концентрации антибиотика в диапазоне используемых концентраций антибиотика.

3. МИКРООРГАНИЗМ: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Поддержание фондовой культуры

Засейте пробирки, содержащие откосы культуральной среды (4.1), Bacillus subtilis и инкубируйте в течение ночи при 30 ºC. Храните культуру в холодильнике при температуре около 4 ºC. Делайте повторную прививку каждый месяц.

Соберите ростки с недавно приготовленного агара (3.1) с помощью 2–3 мл стерильной воды. Эту суспензию инокулируют в 300 мл культуральной среды (4.1), содержащейся в колбе Ру, и инкубируют в течение трех-пяти дней при температуре 30°С. Собирают ростки в 15 мл этанола (4.2), проверив спорообразование под микроскопом, и хорошо перемешивают. Эту суспензию можно хранить не менее пяти месяцев при температуре около 4 ºC.

4. КУЛЬТУРНЫЕ СРЕДА И РЕАГЕНТЫ 4.1. Культуральная среда (2) >PIC FILE="T0020682">

Калий дигидрофосфат, KH2PO4: 13 76 г.

Вода до 1 000 мл.

Отрегулируйте pH до 4 75.

5. СТАНДАРТНЫЕ РЕШЕНИЯ

Точную навеску примерно 10 мг стандартного вещества (4.7) растворяют в фосфатном буфере (4.5) и разбавляют этим буфером, чтобы получить исходный раствор, содержащий 100 мкг авопарцина на миллилитр. При хранении в колбе с пробкой при температуре 4 ºC этот раствор стабилен до семи дней. 5.1. Для премиксов

Из этого исходного раствора путем последовательного разведения буфером (4.5) приготовьте следующие растворы: >PIC FILE="T0020683">

Из исходного раствора путем последовательного разведения буфером (4.5) приготовьте следующие растворы: >PIC FILE="T0020684">

6. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ И АНАЛИЗА РАСТВОРОВ 6.1. Премиксы

Взвесьте с точностью до 10 мг достаточное количество образца, чтобы оно содержало от 10 до 100 мг авопарцина. Переносят в градуированную колбу вместимостью 100 мл с 60 мл смеси (4.6) и встряхивают на механической шейкере в течение 15 мин. Проверьте pH и при необходимости доведите pH до 2 с помощью соляной кислоты (4.3). Доведите объем смесью (4.6) и хорошо перемешайте. Отфильтруйте порцию через подходящую фильтровальную бумагу (например, Whatman No 1), отбросив первые 5 мл фильтрата. Возьмите аликвоту и доведите pH до 4,75 раствором гидроксида натрия (4,4). Разбавьте этот раствор буфером (4.5), чтобы получить ожидаемую концентрацию авопарцина 4 мкг/мл (= U8).

Из этого раствора готовят растворы U4 (ожидаемое содержание: 2 ¶г/мл), U2 (ожидаемое содержание: 1 ¶г/мл) и U1 (ожидаемое содержание: 0,75 ¶г/мл) путем последовательного разведения ( 1+1) с буфером (4.5).

Отвешивают пробу массой 50 г и встряхивают 100 мл смеси (4.6) в течение 30 минут на механическом шейкере. Осветляют экстракт центрифугированием (используя центрифужные пробирки с пробками), берут аликвоту осветленного экстракта (см. таблицу ниже) и доводят pH до 4,75 раствором гидроксида натрия (4.4). Разбавьте эту аликвоту буфером (4,5), чтобы получить U8 (см. таблицу ниже).

Из этого раствора готовят растворы U4 (ожидаемое содержание: 1 ¶г/мл), U2 (ожидаемое содержание: 0,75 ¶г/мл) и U1 (ожидаемое содержание: 0,725 ¶г/мл) путем последовательного разведения. (1+1) с буфером (4.5). >PIC ФАЙЛ="T0020685">

7. ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА 7.1. Инокуляция аналитической среды

Инокулируют среду для анализа (4.1) суспензией спор (3.2) при температуре от 50 до 60 ºC. Путем предварительных испытаний на чашках с аналитической средой (4.1) определяют количество суспензии спор, необходимое для получения наиболее крупных и четких зон ингибирования при различных концентрациях авопарцина.

Диффузию через агар проводят в чашках с четырьмя концентрациями стандартного раствора (S8, S4, S2, S1) и четырьмя концентрациями анализируемого раствора (U8, U4, U2, U1). Эти четыре концентрации экстракта и стандарта обязательно должны быть помещены в каждую чашку. Для этого подбирают чашки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее восьми отверстий диаметром от 10 до 13 мм и расстоянием между центрами не менее 30 мм. Испытание может проводиться на пластинах, состоящих из листа стекла с помещенным сверху алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Наливают в чашки некоторое количество среды (4.1), инокулированной, как указано в 7.1, так, чтобы получился слой толщиной около 2 мм (60 мл для чашки диаметром 200 мм). Дайте установить в ровное положение, просверлите отверстия и поместите в них точно отмеренные объемы аналитического и стандартного растворов (от 0,710 до 0,715 мл на отверстие, в зависимости от диаметра). Каждую концентрацию применяют не менее четырех раз, чтобы каждое определение подвергалось оценке 32 зон ингибирования.

Инкубируйте чашки в течение 16–18 часов при температуре 30 ºC.

8. ОЦЕНКА

Измерьте диаметр зон торможения с точностью до 0,71 мм. Запишите средние значения для каждой концентрации на полулогарифмической миллиметровой бумаге, показывая логарифм концентраций по отношению к диаметрам зон ингибирования. Постройте линии «наилучшего соответствия» стандартного решения и экстракта, например, как показано ниже.

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного наивысшего уровня (SL) по формуле: >PIC FILE="T0020686">

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного наивысшего уровня (SH) по формуле: >PIC FILE="T0020687">

Аналогичным образом рассчитайте точки «наилучшего соответствия» для самого низкого уровня экстракта (UL) и самого высокого уровня экстракта (UH), заменив U1, U2, U4 и U8 на S1, S2, S4 и S8 в приведенных выше формулах.

Запишите рассчитанные значения SL и SH на одной миллиметровой бумаге и соедините их, чтобы получить линию «наилучшего соответствия» для стандартного решения. Аналогичным образом запишите UL и UH и соедините их, чтобы получить строку, наиболее подходящую для фрагмента.

При отсутствии каких-либо помех линии должны быть параллельны. Для практических целей линии можно считать параллельными, если значения (SH-SL) и (UH-UL) не отличаются более чем на 10 % от своего среднего значения.

Если окажется, что линии непараллельны, либо U1 и S1, либо U8 и S8 можно отбросить и рассчитать SL, SH, UL и UH с использованием альтернативных формул, чтобы получить альтернативные «наилучшие подходящие» линии: > PIC-ФАЙЛ="T0020688">

и аналогично для UL и UH. Альтернативные линии «наилучшего соответствия» следует проверить на параллельность, как и раньше. Тот факт, что результат был рассчитан по трем уровням, должен быть отмечен в итоговом отчете.

Если линии считаются параллельными, вычислите логарифм относительной активности (log. A) с помощью одной из следующих формул: >PIC FILE="T0020689">

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Если окажется, что относительная активность выходит за пределы диапазона от 0,75 до 2,70, повторите анализ, внося соответствующие корректировки в концентрации экстракта или, если это невозможно, в стандартные растворы. Если относительную активность невозможно привести в требуемый диапазон, любой полученный результат следует считать приблизительным, и это следует отметить в итоговом отчете.

Если линии считаются непараллельными, повторите определение. Если параллелизм все же не достигнут, определение следует признать неудовлетворительным.

9. ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Разница между результатами двух определений, проведенных на одной и той же пробе одним и тем же аналитиком, не должна превышать: - 2 мг/кг по абсолютной величине для содержания авопарцина от 2 до 10 мг/кг. ,

 – 20 % относятся к самому высокому значению для содержания от 10 до 25 мг/кг,

- 5 мг/кг, по абсолютной величине, для содержания от 25 до 50 мг/кг,

- 10 % относятся к самому высокому значению для содержания выше 50 мг/кг.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАТРИЯ МОНЕНСИНА МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАРНОЙ СРЕДЕ

1. ЦЕЛЬ И ОБЪЕМ

Метод предназначен для определения монензина натрия в кормах и премиксах. Нижний предел определения составляет 10 мг/кг (10 ppm) (1).

2. ПРИНЦИП

Проба экстрагируется 90 % метанолом. Экстракт подвергается соответствующим процедурам в зависимости от содержания монензина натрия в образце. Антибиотическую активность определяют путем измерения диффузии монензина натрия в агаровой среде, инокулированной Bacillus subtilis. Диффузия проявляется образованием зон ингибирования микроорганизма. Диаметр этих зон принимают прямо пропорциональным логарифму концентрации антибиотика в диапазоне используемых концентраций антибиотика. Чувствительность этой аналитической системы снижается в присутствии ионов натрия.

3. МИКРООРГАНИЗМ: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Поддержание фондовой культуры

Засейте пробирки, содержащие откосы культуральной среды (4.1), Bacillus subtilis и инкубируйте в течение ночи при 30 ºC. Храните культуру в холодильнике при температуре около 4 ºC. Делайте повторную прививку каждый месяц.

Соберите ростки с недавно приготовленного агара (3.1) с помощью 2–3 мл стерильной воды. Эту суспензию инокулируют в 300 мл культуральной среды (4.1), содержащейся в колбе Ру, и инкубируют в течение трех-пяти дней при температуре 30°С. Соберите ростки в 15 мл 20% этанола (4.3), проверив спорообразование под микроскопом, и хорошо перемешайте. Эту суспензию можно хранить не менее пяти месяцев при температуре около 4 ºC.

4. КУЛЬТУРНЫЕ СРЕДА И РЕАГЕНТЫ 4.1. Культуральная среда (3) >PIC FILE="T0020690">

5. АППАРАТ 5.1. Роторный вакуумный испаритель с круглодонной колбой емкостью 250 мл.

6. СТАНДАРТНЫЕ РЕШЕНИЯ

Точную навеску стандартного вещества (4.8) растворяют в метаноле (4.4) и разбавляют до получения маточного раствора, содержащего 800 мкг монензина натрия на мл. При хранении в колбах с пробками при температуре 4 ºC этот раствор стабилен до двух недель.

Из этого исходного раствора путем последовательного разбавления 50 % метанола (4.6) приготовьте следующие растворы: >PIC FILE="T0020692">

7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА 7.1. Экстракция 7.1.1. Премиксы

Взвесьте образец массой 2 г, добавьте 100 мл 90 % метанола (4,5), гомогенизируйте и центрифугируйте в течение нескольких минут. Разбавьте надосадочный раствор 50 % метанолом (4.6) до получения ожидаемого содержания монензина натрия 8 мкг/мл (= U8).

Взвесьте пробу массой от 10 до 20 г, добавьте 100 мл 90 % метанола (4,5), гомогенизируйте в течение 15 минут и оставьте отстояться.

Вставьте ватную пробку в узкий конец стеклянной трубки (5.2) и легкими постукиваниями добавляйте оксид алюминия (4.7) до тех пор, пока высота колонки не достигнет 75–80 мм.

Декантируйте экстракт в колонку с оксидом алюминия и соберите фильтрат. Разбавьте 30 мл фильтрата до 50 мл водой. Сделайте последующие разведения 50% метанолом (4.6) для получения ожидаемого содержания монензина натрия 8 мкг/мл (= U8).

Взвесьте образец массой от 10 до 20 г, добавьте 100 мл 90 % метанола (4,5) и гомогенизируйте в течение 15 минут. Центрифугируйте до прозрачности.

Для образца, содержащего 20 ppm монензина натрия, возьмите 40 мл надосадочной жидкости. Для пробы, содержащей 10 ppm, отбирают 80 мл и выпаривают досуха под вакуумом на роторном испарителе (5.1) при температуре не выше 40 °С. Остаток растворяют в 10 мл 90 % метанола (4,5).

Вставьте ватную пробку в узкий конец стеклянной трубки (5.3) и легкими постукиваниями добавляйте оксид алюминия (4.7) до тех пор, пока колонка не достигнет высоты 75–80 мм.

Декантируйте метанольный раствор остатка в колонку с оксидом алюминия и собирайте фильтрат. Промывают колонку 10 мл 90% метанола (4,5) и объединяют промывные воды с фильтратом.

Раствор выпаривают досуха в вакууме на роторном испарителе (5.1) при температуре менее 40 ºC. Остаток растворяют в 10 мл метанола безводного (4.4) и доводят объем воды до 20 мл. Центрифугируйте раствор со скоростью не менее 4000 об/мин в течение не менее пяти минут. Сделайте последующие разведения 50% метанолом (4.6) для получения ожидаемого содержания монензина натрия 8 мкг/мл (= U8).

Из раствора U8 приготовьте растворы U4 (ожидаемое содержание: 4 ¶г/мл), U2 (ожидаемое содержание: 2 ¶г/мл) и U1 (ожидаемое содержание: 1 ¶г/мл) путем последовательного разведения (1 + 1) с 50 % метанола (4.6).

8. ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА 8.1. Инокуляция аналитической среды

Инокулируют среду для анализа (4.2) суспензией спор (3.2) при температуре от 50 до 60 ºC. Путем предварительных испытаний на чашках с аналитической средой (4.2) определяют количество суспензии спор, необходимое для получения наиболее крупных и четких зон ингибирования при различных концентрациях монензина натрия.

Диффузию через агар проводят в чашках с четырьмя концентрациями стандартного раствора (S8, S4, S2, S1) и четырьмя концентрациями анализируемого раствора (U8, U4, U2, U1). Эти четыре концентрации экстракта и стандарта обязательно должны быть помещены в каждую чашку. Для этого подбирают чашки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее восьми отверстий диаметром от 10 до 13 мм и расстоянием между центрами не менее 30 мм. Испытание может проводиться на пластинах, состоящих из листа стекла с помещенным сверху алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Наливают в чашки некоторое количество среды (4.2), инокулированной, как указано в 8.1, так, чтобы получился слой толщиной около 2 мм (60 мл для чашки диаметром 200 мм). Дайте установить в ровное положение, просверлите отверстия и поместите в них точно отмеренные объемы аналитического и стандартного растворов (от 0,710 до 0,715 мл на отверстие, в зависимости от диаметра). Каждую концентрацию применяют не менее четырех раз, чтобы каждое определение подвергалось оценке 32 зон ингибирования.

Инкубируйте чашки примерно 18 часов при температуре от 35 до 37 ºC.

9. ОЦЕНКА

Измерьте диаметр зон торможения с точностью до 0,71 мм. Запишите средние значения для каждой концентрации на полулогарифмической миллиметровой бумаге, показывая логарифм концентраций по отношению к диаметрам зон ингибирования. Постройте линии «наилучшего соответствия» стандартного решения и экстракта, например, как показано ниже.

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного нижнего уровня (SL) по формуле: >PIC FILE="T0020693">

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного наивысшего уровня (SH) по формуле: >PIC FILE="T0020694">

Аналогичным образом рассчитайте точки «наилучшего соответствия» для самого низкого уровня экстракта (UL) и самого высокого уровня экстракта (UH), заменив U1, U2, U4 и U8 на S1, S2, S4 и S8 в приведенных выше формулах.

Запишите рассчитанные значения SL и SH на одной миллиметровой бумаге и соедините их, чтобы получить линию «наилучшего соответствия» для стандартного решения. Аналогичным образом запишите UL и UH и соедините их, чтобы получить строку, наиболее подходящую для фрагмента.

При отсутствии каких-либо помех линии должны быть параллельны. Для практических целей линии можно считать параллельными, если значения (SH-SL) и (UH-UL) не отличаются более чем на 10 % от своего среднего значения.

Если окажется, что линии непараллельны, либо U1 и S1, либо U8 и S8 можно отбросить и рассчитать SL, SH, UL и UH с использованием альтернативных формул, чтобы получить альтернативные «наилучшие подходящие» линии: > PIC-ФАЙЛ="T0020695">

и аналогично для UL и UH. Альтернативные линии «наилучшего соответствия» следует проверить на параллельность, как и раньше. Тот факт, что результат был рассчитан по трем уровням, должен быть отмечен в итоговом отчете.

Если линии считаются параллельными, вычислите логарифм относительной активности (log. A) с помощью одной из следующих формул: >PIC FILE="T0020696">

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Если окажется, что относительная активность выходит за пределы диапазона от 0,75 до 2,70, повторите анализ, внося соответствующие корректировки в концентрации экстракта или, если это невозможно, в стандартные растворы. Если относительную активность невозможно привести в требуемый диапазон, любой полученный результат следует считать приблизительным, и это следует отметить в итоговом отчете.

Если линии считаются непараллельными, повторите определение. Если параллелизм все же не достигнут, определение следует признать неудовлетворительным.

10. ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Разница между результатами двух определений, выполненных на одной и той же пробе одним и тем же аналитиком, не должна превышать: - 20 % относительно наибольшего значения для содержания монензина натрия от 10 до 25 мг/кг,

- 5 мг/кг, по абсолютной величине, для содержания от 25 до 50 мг/кг,

- 10 % относятся к самому высокому значению для содержания выше 50 мг/кг.