Директива Совета 77/312/EEC от 29 марта 1977 г. о биологическом скрининге населения на наличие свинца.

ДИРЕКТИВА СОВЕТА от 29 марта 1977 г. о биологическом скрининге населения на свинец (77/312/EEC)

СОВЕТ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества и, в частности, его статью 235,

Принимая во внимание предложение Комиссии,

Принимая во внимание мнение Европейского парламента (1),

Принимая во внимание мнение Экономического и социального комитета (2),

Принимая во внимание, что одной из важнейших задач Европейского Экономического Сообщества является содействие гармоничному развитию экономической деятельности и непрерывному и сбалансированному расширению Сообщества, ни одно из которых не может быть достигнуто без борьбы с загрязнением и вредными воздействиями и улучшения качества жизни. и защита окружающей среды;

Принимая во внимание, что различные виды использования свинца в настоящее время вызывают загрязнение этим веществом многих областей окружающей среды;

Поскольку многочисленные источники свинца в окружающей среде затрудняют определение общего воздействия этого загрязнителя на одного человека, и, следовательно, защита здоровья человека требует максимально точного мониторинга общего поглощения свинца человеком;

Принимая во внимание, что необходимо проводить биологический скрининг населения на свинец и оценивать результаты этого скрининга, чтобы при необходимости можно было составить новые предложения;

Принимая во внимание, что желательно установить технические процедуры и биологические референтные уровни для такого скрининга;

Принимая во внимание, что измерение уровня свинца в крови в настоящее время является лучшим средством оценки количества свинца, недавно полученного человеком в результате воздействия свинца из окружающей среды; поскольку ферментативная активность дегидратазы дельта-аминолевулиновой кислоты (ALAD) может использоваться в качестве ориентировочного или дополнительного теста для определения воздействия свинца;

Принимая во внимание, что программа действий Европейских сообществ по окружающей среде (3) предусматривает координацию национальных программ, целью которых является улучшение качества жизни и приоритетное исследование свинца,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены ЕС должны предпринять необходимые шаги для применения общей процедуры биологического скрининга с целью оценки воздействия свинца на население за пределами производственной среды.

Статья 2

Эта общая процедура, применение которой ограничивается четырьмя годами, должна основываться на измерении уровня свинца в крови.

В качестве ориентировочного или дополнительного испытания измерение ALAD также может использоваться в соответствии с процедурами, изложенными в Приложениях II и III. (1)ОЖ № C 28, 9 февраля 1976 г., стр. 31. (2)ОЖ № C 50, 4 марта 1976 г., с. 9. (3)ОЖ № C 112, 20.12.1973, с. 3.

Статья 3

1. Условия проведения биологического скрининга определяются посредством: - процедур отбора проб и анализа,

— частота выборки.

2. Забор крови осуществляется у добровольцев.

Статья 4

Отбор проб осуществляется из: - групп численностью не менее 100 человек в городских районах с населением более 500 000 человек,

- группы численностью не менее 100 человек, насколько это возможно, выбранные из числа людей, подвергающихся воздействию значительных источников свинцового загрязнения,

— критические группы, определяемые компетентными органами государств-членов.

В каждом государстве-члене ЕС и во время каждой кампании количество проводимых анализов должно составлять 50 или более на миллион жителей.

Статья 5

Отбор проб из групп, упомянутых в Статье 4, должен проводиться в ходе как минимум двух кампаний в каждой исследуемой области в течение периода действия программы с интервалом не менее 24 месяцев. Во второй кампании пробы не обязательно должны быть взяты у тех же лиц, что и в первой кампании.

Статья 6

При оценке результатов биологического скрининга для целей действий, предусмотренных в Статье 8, следующие уровни свинца в крови, которые учитывают взаимосвязь между дозой и эффектом, приведенную в Приложении I, вместе взяты в качестве эталонных: уровни: - максимум 20 ¶г Pb/100 мл крови для 50 % группы обследованных лиц,

- максимум 30 ¶г Pb/100 мл крови для 90 % группы обследованных лиц,

- максимум 35 мкг Pb/100 мл крови для 98 % группы обследованных.

Статья 7

Уровни свинца в крови определяются следующим образом: - Государства-члены должны сообщить Комиссии названия лабораторий, участвующих в программе биологического скрининга, и используемые методы анализа,

- Комиссия совместно с государствами-членами организует программы взаимного сличения, в которых принимают участие вышеупомянутые лаборатории,

- Комиссия совместно с государствами-членами должна изучить результаты этих программ с целью улучшения сопоставимости методов анализа.

Статья 8

Если результаты анализов показывают, что референтные уровни, указанные в Статье 6, были превышены в одном или нескольких случаях, государства-члены должны: - проверить достоверность результатов,

— принять меры по отслеживанию источников воздействия, ответственных за превышение уровней; это также должно включать действия в отношении всех лиц с уровнем свинца в крови более 35 мкг/100 мл,

— принять все соответствующие меры по усмотрению своих компетентных национальных органов.

Статья 9

1. В течение шести месяцев после уведомления о настоящей Директиве государства-члены должны назначить компетентные национальные органы, которые должны направить в Комиссию: - данные, относящиеся к биологическому скринингу групп населения, упомянутых в Статье 4, вместе с подробные сведения о методах анализа, обследованных группах населения и районах, в которых были взяты пробы; В отношении допрашиваемых лиц сохраняется полная анонимность; Комиссия и государства-члены должны согласовать процедуры и способ передачи этих данных,

- информация о причинах или факторах, предположительно приведших к превышению контрольных уровней, указанных в статье 6.

2. Компетентный национальный орган также уведомляет Комиссию о мерах, принятых в соответствии с третьим абзацем статьи 8.

Статья 10

Не менее двух раз в год Комиссия созывает заседание представителей правительств государств-членов, которое должно, в частности: - гарантировать, что реализация биологического скрининга и, в частности, положений статей 4 и 5 является гармонизировано,

— следить за тем, чтобы проведенные анализы были сопоставимы,

- изучать информацию и способствовать обмену информацией между государствами-членами о результатах биологического скрининга и о мерах, принятых в соответствии со статьей 8.

Статья 11

На основе информации, собранной в соответствии со статьей 9, Комиссия в сотрудничестве с компетентными национальными органами составляет: - сопоставленный годовой отчет о реализации программы, который направляется государствам-членам, Совет и Европейский парламент,

— общий отчет по окончании программы, который станет основой для составления дальнейших предложений с учетом прогресса в научно-технических знаниях.

Статья 12

Государства-члены ЕС должны принять необходимые меры для того, чтобы процедура, установленная настоящей Директивой, вступила в силу в течение 12 месяцев после ее уведомления, и должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Статья 13

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 29 марта 1977 г.

За Совет

Президент

Т. БЕНН

ПРИЛОЖЕНИЕ I СВЯЗЬ МЕЖДУ ДОЗОЙ И ЭФФЕКТОМ

Уровни свинца в крови, используемые при оценке результатов биологического скрининга, основаны на анализе научных данных о различных токсических эффектах свинца. С помощью этого анализа, который учитывает нормальные вариации биологических показателей внутри популяции, можно установить квазиколичественные взаимосвязи между дозой и эффектом. Следующие соотношения между дозой и эффектом используются в качестве ссылок для целей настоящей Директивы.

Снижение активности АЛАД в эритроцитах в результате воздействия свинца может быть допустимо для населения при условии, что оно не нарушает кроветворение. При уровнях свинца в крови ниже 15–20 мкг/100 мл в настоящее время не считается, что снижение активности ALAD влияет на кроветворение.

Увеличение содержания протопорфирина в эритроцитах крови (PPE) указывает на нарушение использования организмом железа и, следовательно, на синтез гема. Увеличение PPE было обнаружено при уровне свинца в крови более 20–30 мкг/100 мл. Однако увеличение СИЗ может быть вызвано и другими причинами.

Вмешательство в синтез глутатиона может быть допустимо только для небольшой части населения и только в том случае, если оно незначительное и не приводит к каким-либо другим субклиническим симптомам. Это неприемлемое вмешательство в синтез глутатиона не обнаруживается при уровне свинца в крови ниже 30 мкг/100 мл.

Значительное увеличение экскреции дельта-аминолевулиновой кислоты с мочой (АЛАУ) является значимым признаком нарушения обмена порфиринов и, следовательно, признаком ухудшения здоровья. Статистически значимое увеличение ALAU начинает обнаруживаться при уровне в крови выше 35 мкг/100 мл.

ПРИЛОЖЕНИЕ II СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ УРОВНЯМИ СВИНЦА В КРОВИ И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Для целей Статьи 2 настоящей Директивы взаимосвязь между уровнями свинца в крови и ферментативной активностью ALAD, измеренная в соответствии с европейским стандартизированным методом (Приложение III), должна быть следующей: >PIC FILE="T0010805">

Если измеренные значения ALAD значительно превышают вышеуказанные пределы для различных групп населения, подтверждающие измерения содержания свинца в крови не требуются.

ПРИЛОЖЕНИЕ III ТЕХНИЧЕСКИЕ ИНСТРУКЦИИ ПО ИЗМЕРЕНИЮ АКТИВНОСТИ ALAD

Европейский стандартизированный метод определения активности дегидратазы дельта-аминолевулиновой кислоты

Принцип метода определения активности дегидратазы дельта-аминолевулиновой кислоты хорошо известен. Он основан на инкубации фермента с избытком субстрата дельта-аминолевулиновой кислоты. Порфобилиноген (ПБГ), образующийся через определенный промежуток времени, смешивают с модифицированным реактивом Эрлиха и полученный цвет измеряют по белому с помощью фотометра. Количество продуцируемого порфобилиногена представляет собой меру активности ALAD.

МЕТОД Влияние света

Недавние эксперименты показали, что ПБГ особенно чувствителен к свету. Таким образом, весь анализ следует проводить в лаборатории без прямых солнечных лучей (а не просто исключать точку, в которой проводится анализ).

Фаза первая – Отбор проб крови и ее сохранение перед анализом – Возьмите образец венозной крови объемом 2 мл с помощью пластикового шприца (не стабилизированного свинцом) в присутствии сухого гепарина ( – Немедленно приготовьте и охладите до 4 ºC четыре образца по 0,72 мл помещают в пластиковые пробирки (не стабилизированные свинцом). Следует использовать градуированные пипетки типа Марбура.

- Если пробы анализируются в течение трех часов, охлаждать их нет необходимости.

— Образцы не следует хранить при температуре 4 ºC более 24 часов.

- Непосредственно перед анализом все образцы следует поместить в ванну с ледяной водой на 10 минут.

Примечание. К пластикам, которые можно использовать, относятся, например, полиэтилен, полистирол и полипропилен. Срок хранения 24 часа при температуре 4 ºC является осторожной оценкой. Этот интервал достаточен для того, чтобы образец был доставлен для анализа из того места, где он был доставлен в центральную лабораторию. Три из четырех образцов крови используются для измерения ALAD, а четвертый – в качестве холостого.

Второй этап — измерение гематокрита

Эти показания необходимо снимать: - одновременно с анализом крови,

- капиллярным методом с использованием двух образцов.

Образец следует центрифугировать после закрытия одного конца пробирки со скоростью не менее 30 000 об/мин и в течение не менее пяти минут.

Примечание. Желательно, чтобы эти показания были сняты сразу, но в любом случае не позднее, чем через 24 часа после взятия образца крови. Если возможно, следует использовать микрогематокритную центрифугу.

Третий этап – Гемолиз – Возьмите три образца крови, «размороженных» с использованием 1 73 мл дистиллированной воды (предварительно нагретой до 37 ºC) и гемолизируйте в течение 10 минут при 37 ± 0,72 ºC.

- Для добавления воды лучше использовать градуированную пипетку емкостью 2 мл, а затем тщательно перемешать.

— Не встряхивайте образцы на этом этапе.

Примечание. Было решено, что для гемолиза следует использовать воду, а не Тритон Х 100. Эксперименты по гемолизу с использованием Triton X 100 привели к значительному замедлению активности ALAD, которое еще не было учтено и которое может быть артефактом.

Четвертый этап. Добавление раствора АЛК к гемолизату. Приготовьте раствор АЛК.

- Готовить его следует не более чем за пять часов.

— Перед добавлением нагрейте этот раствор до 37 ºC в течение как минимум 10 минут.

- Добавьте 1 мл этого раствора к гемолизату, желательно с помощью мерной пипетки объемом 1 мл, и перемешайте.

Примечание. Было выбрано значение pH 6,74, поскольку эксперименты показали, что именно при этом значении pH существует наилучшая корреляция между активностью ALAD и уровнем свинца в крови у нормальных людей. Нет необходимости получать максимальную активность (что можно сделать, повышая pH), поскольку измеряемая активность уже достаточно высока.

Пятая фаза. Подготовка бланка. Возьмите 0,72 мл крови, обработанной так же, как при измерении АЛАД, до момента добавления раствора АЛК; вместо этого добавьте 1 мл раствора ТСА-HgCl2, 1 мл раствора АЛК и далее действуйте так же, как при измерении АЛАД (см. ниже).

— Добавьте растворы с помощью мерной пипетки.

Примечание. Для каждого образца крови только один бланк сравнивается с серией из трех тестов. Если ОП, полученный для заготовки, очень высокий, операцию следует повторить для его проверки.

Шестая фаза – Инкубация – 60 минут при температуре 37±0,72 ºC на водяной бане.

— Время инкубации начинается с момента добавления раствора АЛК.

Примечание. Инкубационный период продолжительностью 60 минут был выбран для того, чтобы повысить активность ALAD естественным путем, учитывая, что никакая другая фаза не приводит к какому-либо искусственному увеличению активности. Эксперименты показали, что соотношение время инкубации/активность является линейным для интервалов более двух часов.

По практическим соображениям температура инкубации поддерживалась на уровне 37 ºC.

Фаза седьмая. Остановка реакции PBG. Добавьте к инкубационной смеси 1 мл раствора TCA-HgCl2, предпочтительно с помощью мерной пипетки объемом 1 мл.

Этап восьмой – Центрифугирование и фильтрация – 30 000 об/мин.

- Фильтрация с использованием бумаги Whatman No 54 или эквивалентной (кислотостойкой).

Примечание. Центрифугирование должно длиться около 10 минут. Фаза фильтрации включена во избежание переноса пипеткой мелких частиц на поверхность надосадочной жидкости. Эти частицы, по-видимому, вызывают цветную реакцию с реактивом Эрлиха. Ряд испытаний показал, что включение фазы фильтрации приводит к лучшей воспроизводимости. Эту фазу при необходимости можно заменить вторым центрифугированием.

Фаза девятая. Реакция с реактивом Эрлиха. Смешайте 1 мл надосадочной жидкости с 1 мл модифицированного реактива Эрлиха, используя мерную пипетку емкостью 1 мл.

— Используйте миксер типа Vortex, чтобы смесь была однородной.

— Дайте реакции продолжиться в течение пяти минут, прежде чем измерять угасание.

Примечание. Для получения гомогенной смеси очень важно убедиться, что отфильтрованная надосадочная жидкость хорошо смешана с реактивом Эрлиха.

Десятый этап. Измерение гашения. Калибровка спектрофотометра с использованием раствора фенолфталина в базовом буфере.

- Сравните измерение экстинкции образца с измерением холостого сигнала при длине волны 555 нм в ячейке размером 1 см (или 2 см, если поглощение очень низкое).

Одиннадцатый этап. Расчет активности фермента. Уравнение для расчета активности фермента выглядит следующим образом: >PIC FILE="T0010806">

где:

OD = измеренное вымирание,

60 = время инкубации,

35 = коэффициент разбавления,

62 = молярный коэффициент экстинкции в см2/¶моль,

K = коэффициент спектрофотометрической поправки.

Примечание. Предложенные единицы измерения соответствуют рекомендациям Международного биохимического союза по номенклатуре ферментов.

РЕШЕНИЯ

1. Приготовление раствора АЛК

Решение А:

1 778 г Na2HPO4 7 ·2H2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды (предпочтительно деионизированной).

Решение Б:

1 738 г NaH2PO4 7 ·1H2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

29 мл раствора А + 71 мл раствора Б дают буфер 0,71 М фосфата натрия при pH 6,74.

Такая буферная сила необходима для предотвращения любых колебаний значения pH в растворе, подвергающемся реакции.

167 76 мг ALA-HCl растворяют в растворе B (который всегда должен быть кислым); pH доводят до 6,74 на основе раствора А. Затем объем доводят до 100 мл, используя буферный раствор 0,71 М фосфата натрия при pH 6,74. Этот препарат дает раствор 0,701 М АЛК.

2. Раствор ТСА-HgCl2

1 735 г HgCl2 растворяют в 100 мл 10 % трихлоруксусной кислоты.

3. Раствор реактива Эрлиха

Реагенты:

2 75 г п-диметиламинобензальдегида (pDMAB),

0,725 г HgCl2 растворяют в 10 мл ледяной уксусной кислоты,

Кислота хлорная СГ 1 77,

ледяная уксусная кислота.

Подготовка:

Растворите pDMAB в 50 мл уксусной кислоты. Добавьте 24 75 мл хлорной кислоты и 4 мл раствора HgCl2. Перемешать, охладить и довести до 100 мл ледяной уксусной кислотой в мерной колбе (1). Хранить в темной бутылке.

Калибровка:

Калибровка на уровне сообщества должна проводиться каждый год лабораторией, совместно назначенной государствами-членами. (1) Если на этом этапе появляется коричневое окрашивание, реагент следует выбросить.