Седьмая Директива Комиссии 76/372/EEC от 1 марта 1976 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

СЕДЬМАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ от 1 марта 1976 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов (76/372/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества по отбору проб и анализу для официального контроля кормов (1), с последними поправками, внесенными Актом о присоединении (2), и, в частности, Статьей 2. из-за этого,

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с положениями, установленными законом, нормативными актами или административными действиями, касающимися качества и состава кормов. ;

Принимая во внимание, что Директивы Комиссии 71/250/EEC от 15 июня 1971 г. (3), 71/393/EEC от 18 ноября 1971 г. (4), 72/199/EEC от 27 апреля 1972 г. (5), 73/46/EEC от 5 декабря 1972 г. (6), 74/203/EEC от 25 марта 1974 г. (7) и 75/84/EEC от 20 декабря 1974 г. (8) уже установили ряд методов анализа Сообщества; тогда как ход работы с тех пор делает целесообразным принять седьмой набор методов;

Принимая во внимание, что меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания в них афлатоксина B1 проводились в соответствии с методами, описанными в Приложении к настоящей Директиве.

Применяются общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к первой Директиве Комиссии 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., за исключением части, касающейся подготовки пробы для анализа. методам, описанным в Приложении к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены должны не позднее 1 октября 1976 г. ввести в действие законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно уведомить об этом Комиссию.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 1 марта 1976 г.

Для Комиссии

Пи Джей Лардинуа

Член Комиссии (1)ОЖ № L 170, 3.8.1970, с. 2. (2)ОЖ № L 73, 27.3.1972, с. 14. (3)ОЖ № L 155, 12 июля 1971 г., с. 13. (4)ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7. (5)ОЖ № L 123, 29 мая 1972 г., с. 6. (6)ОЖ № L 83, 30.3.1973, с. 21. (7)ОЖ № L 108, 22 апреля 1974 г., с. 7. (8)ОЖ № L 32, 5 февраля 1975 г., с. 26.

ПРИЛОЖЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА B1

А. МЕТОД ОДНОМЕРНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять уровень афлатоксина В1 в следующих кормах: арахисе, копре, льняном семени, сое, кунжуте, жмыхах пальмового бабассу и зародышах кукурузы, крупах и зернопродуктах, гороховой муке, картофельной пульпе и крахмале. Нижний предел определения составляет 0,701 мг/кг (10 частей на миллиард).

Если наличие мешающих веществ препятствует определению, необходимо снова начать анализ методом Б (двумерная тонкослойная хроматография).

2. Принцип

Образец подвергают экстракции хлороформом. Экстракт фильтруют, отбирают аликвотную часть и очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Элюат упаривают, а остаток повторно растворяют в определенном объеме хлороформа или смеси бензола и ацетонитрила. Аликвотную часть этого раствора подвергают тонкослойной хроматографии (ТСХ). Количество афлатоксина В1 определяют при УФ-облучении хроматограммы визуально или методом флуороденситометрии путем сравнения с известными количествами стандартного афлатоксина В1. Подлинность афлатоксина B1, выделенного из корма, должна быть подтверждена указанной процедурой.

3. Реагенты

Примечание: Все реагенты должны быть качества «аналитического реагента», если не указано иное. 3.1. Ацетон.

4. Аппаратура. 4.1. Мельница-миксер.

Готовые к использованию планшеты подходят, если они дают результаты, аналогичные тем, которые получены с планшетами, приготовленными, как указано выше.

5. Процедура 5.1. Подготовка образца (см. раздел «Наблюдения», часть C, пункт 1).

Измельчите образец так, чтобы он целиком прошел через сито с размером ячеек 1 мм (в соответствии с рекомендацией ISO R 565).

Поместите 50 г измельченной гомогенизированной пробы в коническую колбу вместимостью 500 мл (4.6). Добавляют 25 г кизельгура (3.14), 25 мл воды и 250 мл хлороформа (3.2). Закрывают колбу пробкой, встряхивают или перемешивают в течение 30 мин с помощью аппарата (4.2) и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (4.3). Отбросьте первые 10 мл фильтрата, а затем соберите 50 мл.

Убедитесь, что верхняя поверхность слоя сульфата натрия ровная, затем добавьте небольшими порциями 10 г силикагеля (3.8). После каждого добавления тщательно перемешивайте, чтобы исключить пузырьки воздуха. Оставьте на 15 минут, а затем осторожно добавьте 15 г сернокислого натрия (3.10). Дайте жидкости упасть, пока она не окажется чуть выше верхней поверхности слоя сульфата натрия.

Смешайте 50 мл экстракта, собранного в 5.2, со 100 мл н-гексана (3.3) и количественно перенесите смесь в колонку. Дайте жидкости упасть, пока она не окажется чуть выше верхней поверхности слоя сульфата натрия. Выбросьте эту стирку. Затем добавляют 100 мл диэтилового эфира (3,5) и снова дают ему опуститься на верхнюю поверхность слоя сульфата натрия. Во время этих операций следите за тем, чтобы скорость потока составляла от 8 до 12 мл в минуту и ​​чтобы колонка не пересыхала. Вылейте вытекшую жидкость. Затем элюируют 150 мл смеси хлороформ/метанол (3.7) и собирают весь элюат.

Нанесите на пластинку для ТСХ (4.8) на расстоянии 2 см от нижнего края и через интервалы 2 см указанные ниже объемы стандартного раствора и экстракта: - 10, 15, 20, 30 и 40 ¶л стандартный раствор афлатоксина В1 (3.16);

Проявите хроматограмму в темноте одним из проявляющих растворителей (3.18). Выбор растворителя необходимо сделать заранее, нанеся на чашку 25 мкл качественного стандартного раствора (3.17) и проверив, что при проявлении афлатоксины В1 и В2 полностью разделяются.

Дайте растворителям испариться в темноте, а затем облучите УФ-светом, поместив пластинку на расстоянии 10 см от лампы (4.9). Пятна афлатоксина В1 дают синюю флуоресценцию.

Определите визуально или с помощью флуороденситометрии, как указано ниже. 5.5.1. Визуальные измерения

Определите количество афлатоксина B1 в экстракте, сопоставив интенсивность флуоресценции пятен экстракта с интенсивностью флуоресценции одного из пятен стандартного раствора. Интерполируйте, если необходимо. Флуоресценция, полученная при наложении экстракта на стандартный раствор, должна быть более интенсивной, чем флуоресценция 10 мкл экстракта, и не должно быть более одного видимого пятна. Если интенсивность флуоресценции 10 л экстракта превышает интенсивность флуоресценции 40 л стандартного раствора, разбавьте экстракт в 10 или 100 раз хлороформом (3.2) или смесью бензола и ацетонитрила (3.6) перед повторным воздействием. к тонкослойной хроматографии.

Измерьте интенсивность флуоресценции пятен афлатоксина В1 с помощью флуороденситометра (4.12) при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 443 нм. Определите количество афлатоксина В1 в пятнах экстракта путем сравнения интенсивности их флуоресценции с интенсивностью флуоресценции стандартных пятен афлатоксина В1.

Подтвердите идентичность афлатоксина B1 в экстракте с помощью процессов, указанных ниже. 5.6.1. Лечение серной кислотой

Распылите серную кислоту (3.13) на хроматограмму, полученную в 5.4. Флуоресценция пятен афлатоксина В1 под воздействием УФ-излучения должна изменить цвет с синего на желтый.

Внимание: Описанные ниже операции необходимо выполнять, внимательно следуя схеме на рисунке 3. 5.6.2.1. Применение решений

Сделайте на пластине (4.8) две прямые линии, параллельные двум смежным сторонам (6 см с каждой стороны), чтобы ограничить миграцию фронтов растворителя. Нанесите на чашку с помощью капиллярной пипетки или микрошприца следующие растворы: - в точке А: объем очищенного экстракта образца, полученного в 5.3, содержащего около 2,75 нм афлатоксина В1;

Проявляйте хроматограмму в направлении I в темноте, используя проявляющий растворитель (3.18.1) (слой 1 см в ненасыщенной емкости) до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет линии ограничения растворителя.

Снимите пластину с резервуара и дайте высохнуть в темноте при температуре окружающей среды в течение пяти минут. Затем распыляют соляную кислоту (3.12) вдоль полосы 2 высотой 75 см, закрывая точки А и Б (обозначены заштрихованной областью на рисунке 3) до ее потемнения, защищая остальную часть пластинки стеклянным листом. Дать прореагировать в течение 10 минут в темноте и высушить струей воздуха при температуре окружающей среды.

Далее проявляют хроматограмму в направлении II в темноте, используя проявляющий растворитель (3.18.1) (слой 1 см в ненасыщенной емкости) до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет линии ограничения растворителя. Снимите пластину с резервуара и дайте высохнуть при температуре окружающей среды.

(b) Появление синего флуоресцентного пятна непрореагировавшего (с соляной кислотой) афлатоксина B1 и более интенсивного синего флуоресцентного пятна полуацеталя афлатоксина B1, оба происходят из стандартного раствора, нанесенного в точке B (миграция в направлении II) .

(c) Появление пятен, соответствующих описанным в (b); происходящих из экстракта образца, нанесенного в точке А. Положение этих пятен определяется сначала расстоянием миграции афлатоксина В1 из точки А в направлении I (тот же, что и расстояние, пройденное стандартом, нанесенным в точке С), а затем расстоянием миграции расстояния оттуда в направлении II афлатоксина B1-полуацеталя (такие же, как и расстояния, пройденные стандартом, применяемым в B). Интенсивность флуоресценции гемиацетальных пятен экстракта и стандарта, нанесенного в точке Б, должна совпадать.

6. Подсчет результатов 6.1. Судя по визуальным измерениям

Содержание афлатоксина B1 в микрограммах на кг образца (ppb) определяется по формуле: >PIC FILE="T0009133">

в котором:

Y и X — соответственно объемы в микролитрах стандартного раствора афлатоксина В1 (3.16) и экстракта, имеющего аналогичную интенсивность флуоресценции;

S = концентрация афлатоксина В1 в микрограммах на мл стандартного раствора (3.16);

V = конечный объем экстракта в микролитрах с учетом любого необходимого разведения;

W = вес в граммах образца, соответствующий объему экстракта, подвергнутого очистке колонки.

Содержание афлатоксина В1 в микрограммах на кг пробы определяется по формуле: >PIC FILE="T0009134">

в котором:

Y = объем экстракта, нанесенного на тарелку, в микролитрах (10 или 20 л);

S = количество в нанограммах афлатоксина B1 в пятне экстракции (пропорциональное взятому значению Y), определенное на основе измерений;

V = конечный объем экстракта в микролитрах с учетом любого необходимого разведения;

W = вес в граммах образца, соответствующий объему экстракта, подвергнутого очистке колонки.

7. Приготовление и испытание стандартного раствора (3.16) 7.1. Определение концентрации афлатоксина В1

Приготовьте стандартный раствор афлатоксина В1 в хлороформе (3.2) или смеси бензола и ацетонитрила (3.6) с концентрацией от 8 до 10 мкг/мл. Определите спектр поглощения в диапазоне 330–370 нм с помощью спектрофотометра (4.11).

Измерьте оптическую плотность (А) при длине волны 363 нм в случае раствора хлороформа; или при 348 нм в случае раствора в смеси бензол/ацетонитрил.

Рассчитайте концентрацию афлатоксина В1 в микрограммах на мл раствора по формулам ниже: >PIC FILE="T0009135">

Разбавьте при необходимости вдали от дневного света, чтобы получить рабочий стандартный раствор с концентрацией афлатоксина B1 около 0,71 мкг/мл. При хранении в холодильнике при температуре 4 ºC этот раствор стабилен в течение двух недель.

Нанесите на пластинку (4.8) 5 мкл стандартного раствора афлатоксина В1, содержащего от 8 до 10 мкг/мл (7.1). Постройте хроматограмму, как указано в 5.4. В УФ-свете на хроматограмме должно быть только одно пятно, а в исходной зоне отложения не должно быть заметной флуоресценции.

8. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе одним и тем же аналитиком, не должна превышать: - 25 % относительно наивысшего результата для содержания афлатоксина В1 от 10 до 20 мкг/кг;

- 5 мкг, по абсолютной величине, для содержания от 20 до 50 мкг/кг;

- 10 % относятся к самому высокому значению для содержания выше 50 мкг/кг.

9. Воспроизводимость

См. раздел «Наблюдения», часть C, пункт 2.

>B МЕТОД ДВУМЕРНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять уровень афлатоксина В1 в кормах, не подпадающих под действие метода А. Нижний предел определения составляет 0,701 мг/кг (10 ppb). Метод неприменим к кормам, содержащим мякоть цитрусовых.

2. Принцип

Образец подвергают экстракции хлороформом. Экстракт фильтруют, отбирают аликвотную часть и очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Элюат упаривают, а остаток повторно растворяют в определенном объеме хлороформа или смеси бензола и ацетонитрила. Аликвотную часть этого раствора подвергают двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Количество афлатоксина В1 определяют при УФ-облучении хроматограммы визуально или методом флуороденситометрии путем сравнения с известными количествами стандартного афлатоксина В1. Подлинность афлатоксина B1, выделенного из корма, должна быть подтверждена указанной процедурой.

3. Реагенты

Примечание: Все реагенты должны быть качества «аналитического реагента», если не указано иное. 3.1. Ацетон.

4. Аппаратура См. пункт 4 метода А.

>PIC ФАЙЛ="T0009136"> 5.4. Двумерная ТСХ 5.4.1. Применение решений (следуйте схеме на рисунке 1)

Сделайте на пластине (4.8) две прямые линии, параллельные двум смежным сторонам (на расстоянии 5 и 6 см с каждой стороны соответственно), чтобы ограничить миграцию фронтов растворителя. Нанесите на чашку с помощью капиллярной пипетки или микрошприца следующие растворы: - в точке А - 20 мкл очищенного экстракта пробы, полученного в 5.3;

Высушить в медленной струе воздуха или инертного газа (3.11). Полученные пятна должны иметь диаметр около 5 мм.

Проявляйте хроматограмму в направлении I в темноте, используя проявляющий растворитель (3.15.1) (слой 1 см в насыщенном резервуаре) до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет линии ограничения растворителя. Выньте пластину из резервуара и дайте высохнуть в темноте при температуре окружающей среды в течение 15 минут.

Затем проявляйте хроматограмму в направлении II в темноте, используя проявляющий растворитель (3.15.2) (слой 1 см в ненасыщенном резервуаре) до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет линии ограничения растворителя. Снимите пластину с резервуара и дайте высохнуть в темноте при температуре окружающей среды.

Облучите хроматограмму УФ-светом, поместив пластинку на расстоянии 10 см от (4.9). Найдите положение синих флуоресцентных пятен B, C, D и E афлатоксина B1 из стандартного раствора. Спроецируйте две воображаемые линии, проходящие через эти точки под прямым углом к ​​направлениям развития. Пересечение P этих линий — это место, в котором можно ожидать обнаружения пятна афлатоксина B1, происходящего из экстракта образца, нанесенного на точку A (рисунок 1). Однако фактическое расположение пятна афлатоксина В1 может находиться в точке Q на пересечении двух воображаемых прямых, образующих между собой угол около 100° и проходящих через пятна В и С соответственно. Определите количество афлатоксина В1 в экстракте пробы, как указано в 5.5.

Сделайте на новой пластине (4.8) две прямые линии, параллельные двум смежным сторонам, как указано на схеме на рисунке 1, и нанесите на точку А (см. рисунок 1) 20 мкл очищенного экстракта образца, полученного в 5.3. и на него накладывают 20 мкл стандартного раствора (3.16). Разрабатывают, как указано в 5.4.2. Облучают хроматограмму УФ-светом (4.9) и проверяют, что: - пятна афлатоксина В1 из экстракта и стандартного раствора накладываются друг на друга,

- флуоресценция этого пятна более интенсивна, чем у афлатоксина В1, пятно развито в точке Q на первой пластинке.

Определите визуально или с помощью флуороденситометрии, как указано ниже. 5.5.1. Визуальные измерения

Определите количество афлатоксина B1 в экстракте, сопоставив интенсивность флуоресценции пятна экстракта с интенсивностью флуоресценции пятен C, D и E стандартного раствора. Интерполируйте, если необходимо. Если интенсивность флуоресценции 20 л экстракта превышает интенсивность флуоресценции 40 л стандартного раствора, разбавьте экстракт в 10 или 100 раз хлороформом (3.2) или смесью бензола и ацетонитрила (3.6) перед повторным воздействием. к тонкослойной хроматографии.

Измерьте интенсивность флуоресценции пятен афлатоксина B1 с помощью флуороденситометра (4.12), используя длину волны возбуждения 365 нм и длину волны излучения 443 нм.

Определить количество афлатоксина В1 в пятне экстракта путем сравнения интенсивности его флуоресценции с интенсивностью флуоресценции пятен C, D и E стандартного раствора.

См. пункт 5.6 метода А.

6. Подсчет результатов

См. пункт 6 метода А.

7. Повторяемость

См. пункт 8 метода А.

8. Воспроизводимость

См. раздел «Наблюдения», часть C, пункт 2.

C. НАБЛЮДЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО МЕТОДОВ A И B

1. Обезжиривание

Пробы, содержащие более 5 % жиров, должны быть обезжирены петролейным эфиром (т. кип. от 40 до 60 °С) после подготовки, указанной в 5.1.

В таких случаях результаты анализа должны быть выражены в единицах веса необезжиренной пробы.

2. Воспроизводимость результатов

Воспроизводимость результатов, т. е. разница между результатами, полученными двумя или более лабораториями на одном и том же образце, оценивается как:

±50 % среднего значения для средних значений афлатоксина В1 от 10 и до 20 мкг/кг;

± 10 ¶г/кг от среднего значения для средних значений от 20 до 50 ¶г/кг;

± 20 % среднего значения для средних значений выше 50 мкг/кг.

Приложение к Приложению

>PIC FILE="T0009137"> >PIC FILE="T0009138">