Шестая Директива Комиссии 75/84/EEC от 20 декабря 1974 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

ДИРЕКТИВА ШЕСТОЙ КОМИССИИ КОМИССИИ от 20 декабря 1974 г., устанавливающая методы Сообщества анализа для официального контроля кормов (75/84/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества;

Принимая во внимание Директиву Совета от 20 июля 1970 г. (1) о введении методов Сообщества по отбору проб и анализу для официального контроля кормов, с последними поправками, внесенными Законом (2), приложенным к Договору (3), касающимся присоединение новых государств-членов к Европейскому экономическому сообществу и Европейскому сообществу по атомной энергии, и в частности к их статье 2;

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с положениями, установленными законом, нормативными актами или административными действиями, касающимися качества и состава кормов. ;

Принимая во внимание, что Директивы Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г. (4), № 71/393/EEC от 18 ноября 1971 г. (5), № 72/199/EEC от 27 апреля 1972 г. (6), № 73 /46/EEC от 5 декабря 1972 г. (7) и № 74/203/EEC от 25 марта 1974 г. (8) уже установили ряд методов анализа Сообщества; тогда как ход работы с тех пор делает целесообразным принять шестой набор методов;

Принимая во внимание, что меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют заключению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания бухинолата, сульфахиноксалина и фуразолидона проводились в соответствии с методами, описанными в Приложении к настоящей Директиве.

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к первой Директиве Комиссии № 71/250/ЕЕС от 15 июня 1971 г., за исключением части, касающейся подготовки пробы для анализа, должны быть применимы к методам, описанным в Приложении к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены ЕС должны не позднее 1 ноября 1975 г. ввести в силу законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно уведомить об этом Комиссию.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 20 декабря 1974 г.

Для Комиссии

Президент

Франсуа-Ксавье ОРТОЛИ (1) OJ No L 170, 3.8.1970, стр. 2. (2) ОЖ № L 73, 27 марта 1972 г., с. 14. (3) ОЖ № L 73, 27 марта 1972 г., с. 5. (4) ОЖ № L 155, 12 июля 1971 г., с. 13. (5) ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7. (6) ОЖ № L 123, 29 мая 1972 г., с. 6. (7) ОЖ № L 83, 30 марта 1973 г., с. 21. (8) ОЖ № L 108, 22 апреля 1974 г., с. 7.

ПРИЛОЖЕНИЕ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БУХИНОЛАТА (этил-4-гидрокси-6,7-диизобутокси-3-хинолинкарбоксилата)

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество бухинолата в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 10 ppm. Декокинат мешает определению.

2. Принцип

Пробу экстрагируют хлороформом: Экстракт выпаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе и затем раствор подвергают тонкослойной хроматографии. Букинолат элюируют этанолом и определяют спектрофотофлуорометрически путем сравнения со стандартными растворами.

3. Реагенты 3.1. Хлороформ а.п.

3,2,96 % (об./об.) этанола а.п.

3,4,80 % (об./об.) этанола а.п.

4. Аппаратура 4.1. Колбы конические вместимостью 50 и 250 мл с притертыми пробками.

5. Процедура 5.1. Подготовка образца

Измельчите образец так, чтобы он целиком прошел через сито с размером ячеек 1 мм (в соответствии с рекомендацией ISO R 565).

Взвесьте с точностью до 1 мг количество мелкодисперсного и однородного образца, содержащего около 1,25 мг бухинолата. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют 100 мл хлороформа (3.1). Перемешайте, закройте колбу пробкой и встряхивайте на шейкере (4.2) в течение одного часа. Декантируют, фильтруют и отбрасывают первые миллилитры фильтрата.

Перенесите 80 мл прозрачного фильтрата в химический стакан емкостью 150 мл или в колбу емкостью 250 мл, прикрепленную к роторному испарителю (4.12). Выпаривают почти досуха на водяной бане (4.4), растворяют маслянистый остаток, используя несколько миллилитров хлороформа (3.1), и количественно переносят жидкости в мерную колбу вместимостью 10 мл, используя воронку с тонкой трубкой. Доведите объем хлороформом (3.1) и перемешайте. Если раствор непрозрачный, центрифугируйте в течение трех минут при 3000 об/мин, используя пробирку с пробкой.

Хроматограмму проявляют хлороформом (3.1) до тех пор, пока фронт растворителя практически не достигнет верхнего края пластинки, затем высушивают с помощью струи воздуха. Проявляйте смесью хлороформ-этанол (3.3) до тех пор, пока фронт растворителя не пройдет около 12 см. Дайте растворителям испариться. Облучают хроматограмму ультрафиолетом (4,9) и с помощью иглы отмечают границу пятна бухинолатного пятна (значение Rf от 0,4 до 0,6).

Соберите силикагель из каждой отмеченной зоны с помощью коллектора зон (4.8) и поместите в центрифужные пробирки. Добавьте в каждую пробирку по 10 мл этанола (3.4), встряхивайте 20 минут, затем центрифугируйте 5 минут при 3000 об/мин. Декантируют дорогие растворы в конические колбы вместимостью 50 мл (4.1).

Установите шкалу спектрофотофлуориметра (4.10) на 100 с помощью элюата из наиболее концентрированного стандартного раствора, используя длину волны возбуждения от 200 до 280 нм, которая дает наиболее интенсивную флуоресценцию, и длину волны излучения 375 нм.

В этих условиях измерьте флуоресценцию остальных элюатов (5.4). По полученным значениям определите количество (А) бухинолата в мг в 10 мл элюата из пробы.

6. Подсчет результатов

Содержание бухинолата в мг на кг образца определяется по формуле >PIC FILE="T0006679">

в котором:

A = количество бухинолата в мг, определенное спектрофлуориметрическим измерением.

P = вес тестовой порции в граммах.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

50 % относительно более высокого результата для содержания бухинолата от 10 до 20 частей на миллион;

10 частей на миллион в абсолютном значении для содержания от 20 до 100 частей на миллион;

10 % относительно более высокого результата для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm по абсолютной величине для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительно более высокого результата для содержания выше 10 000 ppm.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАХИНОКСАЛИНА [(2-4-аминобензолсульфонамидо)хиноксалина]

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество сульфахиноксалина в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 20 ppm. Определению мешают другие сульфаниламиды и арсаниловая кислота.

2. Принцип

Проба экстрагируется диметилформамидом и хлороформом. Сульфахиноксалин гидролизуется в щелочной среде. После нейтрализации образовавшееся аминопроизводное диазотируется и связывается с N-2-аминоэтил-1-нафтиламином. Оптическую плотность раствора измеряют при 545 нм.

3. Реагенты 3.1. N,N-диметилформамид а.п.

4. Аппаратура 4.1. Конические колбы вместимостью 250 мл с притертыми пробками.

5. Процедура 5.1. Подготовка образца

Измельчите образец так, чтобы он целиком прошел через сито с размером ячеек 1 мм (в соответствии с рекомендацией ISO R 565).

Взвесьте с точностью до 1 мг количество мелкодисперсной и однородной пробы, содержащей от 0,25 до 1,25 мг сульфахиноксалина. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют 20 мл N,N-диметилформамида (3.1). Перемешивают и нагревают колбу на паровой бане (4.7) в течение 20 минут. Оставить остывать под струей холодной воды. Добавляют 60 мл хлороформа (3.2), закрывают колбу пробкой и встряхивают в течение 30 мин с помощью шейкера (4.2).

Отфильтруйте жидкость через металлокерамическую воронку (4.3) под слабым отсасыванием. Промойте фильтровальную колбу четырьмя порциями хлороформа по 5 мл (3.2) и пропустите смывы через воронку. Фильтрат переносят в делительную воронку (4.4), ополаскивают фильтровальную колбу примерно 15 мл хлороформа (3.2) и переносят смывы в делительную воронку.

Добавьте в делительную воронку 50 мл щелочного рассола (3.4) и 5 ​​мл этанола (3.3). Тщательно перемешайте слои, избегая образования эмульсии, либо медленным переворотом воронки примерно 20 раз, либо ее вращением вокруг горизонтальной оси штока и пробки. Дайте слоям разделиться (разделение обычно завершается примерно через 15 минут).

Переносят верхний слой (водный слой) в мерную колбу вместимостью 250 мл (4.5). Повторяют экстракцию слоя хлороформа тремя дополнительными порциями по 50 мл щелочного рассола (3.4), добавляя каждый водный экстракт к содержимому мерной колбы. Доведите объем водой и перемешайте.

25 мл раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл (4.5), добавляют 5 мл соляной кислоты (3.5), дополняют объем водой и перемешивают. При необходимости профильтровать, отбросив первые 15 мл фильтрата. Перенесите аликвоты раствора по 10 мл в две пробирки (4.6), А и Б.

В каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора нитрита натрия (3.6), перемешивают и оставляют на три минуты. Добавьте 2 мл раствора сульфамата аммония (3.7), перемешайте и оставьте на две минуты. В пробирку А добавляют 1 мл раствора дигидрохлорида N-2-аминоэтил-1-нафтиламина (3.8), а в пробирку Б - 1 мл воды. Тщательно перемешивают содержимое каждой пробирки. С помощью водяного насоса создайте в трубках через резиновые соединения небольшой вакуум, чтобы удалить растворенный азот.

Через 10 минут измерьте оптическую плотность EA и EB растворов с помощью спектрофотометра (4.8) при длине волны 545 нм, используя воду в качестве холостого раствора. По значению EA – EB определяют количество (А) сульфахиноксалина, присутствующего в растворе пробы, используя предварительно составленную калибровочную кривую (5.5).

Переносят в серию мерных колб вместимостью 100 мл (4.5) объемы 2, 4, 6, 8 и 10 мл стандартного раствора (3.10), соответствующих 50, 100, 150, 200 и 250 мкг сульфахиноксалина. В каждую колбу добавьте по 8 мл соляной кислоты (3,5), доведите объем водой и перемешайте.

Внесите пипеткой по 10 мл каждого раствора (что соответствует 5, 10, 15, 20 и 25 мкг сульфахиноксалина) в пробирки (4.6). Развивайте цветную реакцию, как указано в пункте 5.4 первого абзаца. Измерьте оптическую плотность при длине волны 545 нм, используя воду в качестве бланка. Постройте калибровочную кривую, используя значения оптической плотности в качестве ординат и соответствующие количества сульфахиноксалина в микрограммах в качестве координат по оси абсцисс.

6. Подсчет результатов

Содержание сульфахиноксалина в мг на кг образца определяется по формуле >PIC FILE="T0006680">

в котором:

A = количество сульфахиноксалина в микрограммах, определенное фотометрическим измерением.

P = вес тестовой порции в граммах.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 ppm по абсолютной величине для содержаний сульфахиноксалина от 20 до 100 ppm;

10 % относительно более высокого результата для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm по абсолютной величине для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительно более высокого результата для содержания выше 10 000 ppm.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУРАЗОЛИДОНА [(3-(5-нитрофурфурилиденамино)-оксазолидин-2-она)]

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество фуразолидона в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 10 ppm.

2. Принцип

Фуразолидон экстрагируют ацетоном, предварительно экстрагируя пробу петролейным эфиром для удаления жира. Экстракт очищают хроматографией на колонке с оксидом алюминия и элюируют фуразолидон ацетоном. Элюат ацетона выпаривают досуха и остаток растворяют в пентаноле. Затем фуразолидон экстрагируют из пентанола водным раствором мочевины и измеряют оптическую плотность экстракта при 375 нм.

3. Реагенты 3.1. Ацетон а.п.

4. Аппаратура 4.1. Мерные колбы из янтарного стекла емкостью 100 и 250 мл.

5. Процедура

Все процедуры следует проводить при приглушенном свете. 5.1. Подготовка образца

Измельчите образец так, чтобы он целиком прошел через сито с размером ячеек 1 мм (в соответствии с рекомендацией ISO R 565).

Отвешивают от 5 до 20 г мелкоизмельченной и однородной пробы (содержащей не более 1 мг фуразолидона) с точностью до 1 мг в экстракционную насадку (4.4) и переносят ее в экстракционный аппарат (4.3). Экстрагируют петролейным эфиром (3.5), обеспечивая в случае аппарата Сокслета 13-17 циклов растворителя; если используются другие экстракторы, отведите на этот этап не менее 30 минут. Выньте насадку из аппарата, слейте остатки растворителя и высушите насадку и извлеченный корм в токе теплого воздуха.

Поместите высушенный наперсток и его содержимое в чистый экстракционный аппарат и экстрагируйте ацетоном (3.1), допуская не менее 25 циклов растворителя при использовании аппарата Сокслета. Должны быть заранее определены точные условия достижения полной экстракции с помощью любого конкретного аппарата. Ацетоновый экстракт упаривают на паровой бане (4.6) до объема 5–10 мл и охлаждают до комнатной температуры.

В нижний конец хроматографической трубки (4.5) вставьте пробку из стекловаты и проткните ее подходящим стержнем до толщины 2–3 мм. Приготовьте суспензию оксида алюминия (3.2) с ацетоном (3.1), вылейте в пробирку и дайте отстояться. Подготовленный столбик должен быть высотой около 200 мм. Дайте слою ацетона стечь до верхней части колонки.

Ацетоновый экстракт, полученный в 5.2, переносят из колбы в колонку, несколько раз промывают колбу ацетоном (3.1) и переносят жидкость на колонку. Поместите подходящую колбу под колонку и элюируйте фуразолидон ацетоном (3.1); общий объем использованного ацетона, включая использованный для полоскания, должен составлять около 150 мл.

Выпаривают ацетоновый элюат (5.3) досуха на паровой бане (4.6). (В некоторых случаях можно оставить небольшое количество диацетонового спирта, полученного конденсацией ацетона на оксиде алюминия, но это не помешает последующей экстракции.) Растворяют остаток в 10 мл пентанола (3.4) и переносят раствор в разделительную емкость. воронка (4.2). Повторите процедуру, используя 10 мл пентилацетата (3.3) в качестве промывочной жидкости. Наконец, прополощите сосуд, содержащий остаток экстракта, 10 мл раствора мочевины (3.6), добавьте его в делительную воронку и довольно энергично встряхивайте в течение двух минут.

Дают фазам разделиться в течение трех-четырех минут, прежде чем переносить водный экстракт в мерную колбу вместимостью 100 мл (4.1). Повторите этапы промывки и экстракции еще четырьмя аликвотами раствора мочевины по 10 мл (3.6) и перенесите водные экстракты в мерную колбу. Содержимое мерной колбы разбавляют до 100 мл раствором мочевины (3,6) и перемешивают. Измерьте оптическую плотность раствора в спектрофотометре (4.7) при длине волны 375 нм относительно раствора мочевины (3.6) в кювете сравнения. Определите количество фуразолидона, сверившись с калибровочной кривой (5.5).

Подготовьте четыре хроматографические колонки, как описано в первом параграфе 5.3. Пипеткой в ​​отдельные колонки вносят стандартный раствор объемом 2,5, 5, 7,5 и 10 мл соответственно (3.8). Промойте каждую из четырех колонок 150 мл ацетона (3.1) и продолжайте, как указано в пункте 5.4. Постройте калибровочную кривую, используя значения оптической плотности по оси ординат и соответствующие количества фуразолидона в мкг по оси абсцисс.

6. Подсчет результатов

Содержание фуразолидона в мг на кг определяется по формуле >PIC FILE="T0006681">

в котором:

A = количество фуразолидона в микрограммах, определенное фотометрическим измерением.

P = вес тестовой порции в граммах.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

50 % относительно более высокого результата для содержания фуразолидона от 10 до 20 частей на миллион;

10 частей на миллион в абсолютном значении для содержания от 20 до 100 частей на миллион;

10 % относительно более высокого результата для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm по абсолютной величине для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительно более высокого результата для содержания выше 10 000 ppm.