Пятая Директива Комиссии 74/203/EEC от 25 марта 1974 г., устанавливающая методы Сообщества анализа для официального контроля кормов.

ПЯТАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ от 25 марта 1974 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов (74/203/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества;

Принимая во внимание Директиву Совета от 20 июля 1970 г. (1) о введении методов Сообщества по отбору проб и анализу для официального контроля кормов, с последними поправками, внесенными Законом (2), приложенным к Договору (3) относительно присоединения новых государств-членов к Европейскому экономическому сообществу и Европейскому сообществу по атомной энергии, и в частности их статьи 2;

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с положениями, установленными законом, нормативными актами или административными действиями, касающимися качества и состава кормов. ;

Принимая во внимание, что Директивы № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г. (4), № 71/393/EEC от 18 ноября 1971 г. (5), № 72/199/EEC от 27 апреля 1972 г. (6) и № 73/ 46/EEC от 5 декабря 1972 г. (7) уже установил ряд методов анализа Сообщества; поскольку прогресс работы с тех пор делает целесообразным принять пятый набор методов;

Принимая во внимание, что меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют заключению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания крахмала и продуктов разложения крахмала с высокой молекулярной массой в кормах, содержащих свекольную стружку, свекольную ботву, сушеную ботву или листья свеклы, картофельную пульпу, сухие дрожжи , продуктов, богатых инулином, или шкварок, производиться в соответствии с методом, описанным в Приложении I к настоящей Директиве.

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., должны применяться к методу, описанному в Приложении I к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания в них ампролия, этопабата, динитолмида (DOT), никарбазина и менадиона (витамина К3) проводились в соответствии с методами, описанными в Приложении II к настоящей Директиве. .

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., за исключением части, касающейся подготовки пробы для анализа, должны быть применимы к методам, описанным в Приложении II к настоящей Директиве.

Статья 3

Государства-члены должны не позднее 1 ноября 1974 г. ввести в действие законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно уведомить об этом Комиссию.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 25 марта 1974 г.

Для Комиссии

Президент

Франсуа-Ксавье ОРТОЛИ (1)ОЖ № L 170, 3 августа 1970 г., стр. 2. (2)ОЖ № L 73, 27 марта 1972 г., с. 14. (3)ОЖ № L 73, 27 марта 1972 г., с. 5. (4)ОЖ № L 155, 12 июля 1971 г., с. 13. (5)ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7. (6)ОЖ № L 123, 29 мая 1972 г., с. 6. (7)ОЖ № L 83, 30.3.1973, с. 21.

ПРИЛОЖЕНИЕ I ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРАХМАЛА - панкреатический метод -

1. Назначение и область применения

Способ позволяет определять содержание крахмала и высокомолекулярных продуктов распада крахмала в кормах, содержащих свекловичные жомы, свекольный жом, сушеную ботву или листья свеклы, картофельный жом, сухие дрожжи, продукты, богатые инулином (например, цукаты и шрот из топинамбура) и продукты, содержащие шкварки. Определение следует проводить только в том случае, если микроскопическое исследование показывает, что в образце присутствует значительное количество крахмала.

2. Принцип

Сахар, присутствующий в образце, экстрагируется этанолом. Крахмал в экстрагированном остатке восстанавливают до сахара панкреатином. Образовавшиеся сахара гидролизуют соляной кислотой и образовавшуюся глюкозу определяют по методу Лаффа-Шорля. Полученное таким образом количество глюкозы, умноженное на постоянный коэффициент, дает содержание крахмала в образце.

3. Реагенты 3.1. 90 % (по объему) этанола, нейтрального по отношению к фенолфталеину.

4. Аппаратура 4.1. Экстрактор (см. схему п. 12), состоящий из: 4.1.1. Коническая колба с широким горлышком емкостью 500 мл;

5. Процедура 5.1. Подготовка образца

Раздавите образец так, чтобы он целиком прошел через сито 0 75 мм. (Сито ISO R 565 соответствует).

Взвешивают с точностью до мг 2 г пробы и помещают ее в фильтрационный тигель (4.1.5), дно которого предварительно застилают фильтровальной бумагой (4.1.6), смоченной этанолом (3.1). Помещают в коническую колбу (4.1.1) 55 мл этанола (3.1) и несколько гранул пемзы (3.14). Поместите фильтрационный тигель в металлический контейнер (4.1.4) и подвесьте его на крюке шпинделя (4.1.3). Поместите обратный холодильник над конической колбой и опустите шпиндель так, чтобы дно тигля едва касалось поверхности этанола. Прочно зафиксируйте шпиндель на этом уровне. Доведите этанол до кипения и варите 3 часа. Затем дайте остыть и поднимите шпиндель (4.1.3), чтобы поднять тигель в конической колбе как можно выше. Осторожно откройте коническую колбу и дайте 45 мл воды стечь по стенкам колбы. Установите обратный холодильник на колбу Эрленмейера и держите фильтрационный тигель на высоте 10 см над поверхностью жидкости. Доведите жидкость до кипения и варите 3 часа. Затем дайте остыть, откупорьте коническую колбу и выньте тигель из емкости.

Поместите тигель в вакуумную колбу и высушите под отсасыванием. Остаток экстракции переложите в ступку и мелко измельчите. Используя примерно 60 мл воды, количественно переносят порошок в градуированную колбу вместимостью 200 мл со стандартным притертым стеклом и добавляют несколько капель амилового спирта (3.2). Подсоедините к колбе обратный конденсатор. Нагрейте до кипения и варите 1 час. Затем дайте остыть и отсоедините обратный конденсатор. Добавляют 25 мл буферного раствора (3.4), 250 мг панкреатина (3.12), 2,5 мл раствора хлорида натрия (3.5) и 10 капель толуола (3.3). Встряхивают 2 мин, помещают колбу в инкубатор (4.2) и выдерживают там 21 час, периодически встряхивая. Затем оставьте остывать до комнатной температуры.

Добавьте 5 мл раствора Carrez I (3.6) и встряхивайте в течение одной минуты. Затем добавьте 5 мл раствора Carrez II (3.7) и еще раз встряхивайте в течение одной минуты. Довести до объема водой, перемешать и профильтровать. С помощью пипетки возьмите 50 мл фильтрата и поместите в градуированную колбу на 100 мл (можно также работать со 100 мл фильтрата в градуированной колбе на 200 мл). Добавьте несколько капель индикатора (3.11) и подкислите соляной кислотой 8 Н (3.9) до тех пор, пока индикатор не станет красным. Затем добавляют еще 6,25 мл соляной кислоты 8 N (3,9) (12,50 мл при работе с фильтратом 100 мл). Подсоедините обратный конденсатор к колбе, доведите раствор до кипения и кипятите 1 час. Дать остыть, нейтрализовать раствором гидроксида натрия 10 Н (3,10) до появления желтого цвета индикатора. Затем слегка подкислить, добавив немного соляной кислоты N ('3,8), довести объем водой и перемешать. Определите содержание глюкозы по методу Лаффа-Шорля, как показано в 5.4.

5.4 Титрование по Лаффу-Шорлю

С помощью пипетки отберите 25 мл реактива Лаффа-Шорля (3.13) и поместите в коническую колбу вместимостью 300 мл; добавляют 25 мл точно отмеренного раствора, полученного в 5.3, он не должен содержать более 60 мг глюкозы. Добавьте две гранулы пемзы (3.14), нагрейте, встряхивая вручную, на среднем огне и доведите жидкость до кипения примерно за 2 минуты. Немедленно поместите коническую колбу на проволочную сетку с асбестовым экраном с отверстием диаметром примерно 6 см. Под проволочной сеткой сначала зажигают пламя, которое регулируют таким образом, чтобы нагревалось только дно конической колбы. Затем подсоедините обратный конденсатор к конической колбе. Как только это будет сделано, варите ровно 10 минут. Немедленно охладить в холодной воде и примерно через 5 минут титровать следующим образом:

Добавьте 10 мл раствора йодида калия (3.15) и сразу же после этого, но с осторожностью (из-за опасности сильного пенообразования) 25 мл серной кислоты 6 N (3.16). Затем титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (3.17) до появления тускло-желтой окраски, добавляют несколько капель индикатора крахмала (3.18) и завершают титрование.

Проводят холостое испытание, применяя процедуру, описанную в 5.3 и 5.4, но без образца.

6. Подсчет результатов

Используя таблицу в приложении, определите количество глюкозы в мг, соответствующее разнице результатов двух титрований (выраженное в мл тиосульфата натрия 0,71 N) и относящееся как к анализу пробы, так и к холостой пробе. .

Содержание крахмала в процентах от образца определяется по формуле:

0 772 (а – б)

где:

a = мг глюкозы относительно образца;

b = мг глюкозы относительно холостого теста (см. наблюдение 7.2).

7. Наблюдения 7.1 Если в образце одновременно присутствуют частично или полностью декстринированный крахмал и лактоза, результат может быть повышен на 0,75–3,70 %. В таких случаях фактическое содержание крахмала получают следующим образом: а) определяют содержание редуцирующих сахаров в спиртовом экстракте, полученном по 5.2, и выражают результат в процентах от глюкозы;

(b) Определите содержание водорастворимых редуцирующих сахаров в образце и выразите результат в процентах от глюкозы;

(c) Вычтите результат, полученный в (a), из результата, полученного в (b), и умножьте разницу на 0,9;

(d) Вычтите значение, полученное в (c), из содержания крахмала, полученного путем применения метода и расчета, как показано в пункте 6.

7.2 Количество глюкозы по отношению к холостой пробе обычно составляет 0,725 мг. Оно не может быть больше 0,750 мг.

8. Указания по применению панкреатина

Физический вид: желтовато-белый аморфный порошок.

Содержание глюкозы: количество глюкозы в холостой пробе (см. 5.5) обычно составляет 0,725 мг. Результат больше 0,750 мг указывает на то, что панкреатин больше нельзя применять.

Проверьте потребление йода: растворите 62–75 мг панкреатина примерно в 50 мл воды, нагретой до 25–30 ºC. Добавьте 1 мл раствора йода 0 71 Н. Перемешивайте 2 минуты. Титруйте раствором тиосульфата натрия 0,71 Н в присутствии индикатора крахмала. Расход раствора йода панкреатином не должен превышать 0,75 мл.

Проверку на амилолитическую активность: смешать 100 мл раствора крахмала (3.18), 5 мл буферного раствора (3.4), 0,75 мл раствора натрия хлорида (3,5) и 62,75 мг панкреатина. Нагрейте смесь до 25–30 ºC, перемешивайте 2 минуты. Добавьте 1 мл раствора йода 0,71 N. Синяя окраска должна исчезнуть в течение 15 минут ровно после добавления раствора йода.

Таблица значений для 25 мл реактива Лаффа-Шорля мл Na2S2O3 0 71 N ; 2 минуты нагрева; 10 минут кипячения

>PIC FILE="T0005512"> >PIC FILE="T0005513">

ПРИЛОЖЕНИЕ II

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМПРОЛИЯ [Хлорид гидрохлорида 1-(4-амино-2-пропил-5-пиримидилметил-2-пиколиния]

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество ампролия в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 40 м.д.

2. Принцип

Проба экстрагируется разбавленным метанолом. Экстракт очищают на колонке с оксидом алюминия и обрабатывают метанольным раствором 2,7-дигидроксиднафталина, феррицианида калия, цианида калия и гидроксида натрия, образуя комплекс пурпурного цвета. Ампролий определяют спектрофотометрически при 530 нм.

3. Реагенты 3.1. Метанол а.п.

Температура плавления (разложения): 248 ºC. >PIC ФАЙЛ="T0005532">

4. Аппаратура 4.1. Конические колбы вместимостью 50, 250 и 500 мл с притертыми пробками.

5. Процедура 5.1. Экстракция и очистка 5.1.1. Корма и премиксы

Взвесьте с точностью до 1 мг 10 г мелко измельченного и гомогенизированного образца. Для премиксов отвешивают от 3 до 6 граммов с точностью до 1 мг. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют ровно 100 мл разбавленного метанола (3.2). Взболтайте в течение 60 минут и профильтруйте. При необходимости разбавляют разбавленным метанолом (3.2) до получения раствора, содержащего от 5 до 15 мкг ампролия на мл.

Вставьте ватную пробку в нижний конец хроматографической пробирки (4.4), утрамбуйте 5 г оксида алюминия (3.9), а затем влейте 25,0 мл экстракта. Дайте жидкости стечь через колонку, отбросьте первые 5 мл и соберите следующие 12 мл в градуированную пробирку.

Взвешивают с точностью до 1 мг 0,75 г мелко измельченной и гомогенизированной пробы, помещают ее в коническую колбу вместимостью 500 мл (4.1), добавляют 250 мл разбавленного метанола (3.2), взбалтывают или перемешивают в течение 60 минут и фильтруют. Разбавляют 5 70 мл фильтрата до 200 мл разбавленным метанолом (3,2) в мерной колбе.

Перенесите 5 70 мл раствора, полученного в 5.1.1 или 5.1.2, в центрифужную пробирку А (4.5). Поместите 5–70 мл разбавленного метанола (3.2) в центрифужную пробирку В (4.5). В каждую пробирку добавляют по 10,0 мл красящего реактива (3.8), закупоривают пробирки, перемешивают и оставляют на 18 мин. Затем центрифугируют в течение 3 мин и декантируют растворы А и Б в конические колбы вместимостью 50 мл (4.1).

Немедленно измерьте оптическую плотность раствора А при длине волны 530 нм в спектрофотометре, используя раствор В в качестве контроля. Определите количество ампролия, сверяясь с калибровочной кривой (5.3).

Внесите в центрифужные пробирки (4.5) объемы 1,70, 2,70, 3,70, 4,70 и 5,70 мл соответственно стандартного раствора (3.11). Доведите объемы первых четырех пробирок до 5–70 мл разбавленным метанолом (3.2). Во все пять пробирок 10 добавляют по 70 мл красящего реагента (3.8), закупоривают пробирки, перемешивают и оставляют на 18 минут. Затем центрифугируют 3 мин и декантируют растворы в конические колбы вместимостью 50 мл (4.1).

Немедленно измерьте оптическую плотность растворов при 530 нм в спектрофотометре, используя в качестве контроля смесь 5 мл разбавленного метанола (3.2) и 10 мл цветного реагента (3.8). Постройте калибровочную кривую, используя значения оптической плотности в качестве ординат и соответствующие количества ампролия в мг в качестве оси абсцисс.

6. Подсчет результатов 6.1. Корма и премиксы

Содержание ампролия в мг на кг образца определяется по формуле >PIC FILE="T0005514">

в котором:

A = количество ампролия в мг, определенное фотометрическим измерением.

W = вес пробной порции в г.

F = коэффициент разбавления (возможно, рассчитанный в 5.1.1).

Процентное содержание ампролия в образце определяется по формуле >PIC FILE="T0005515">

в котором:

A = количество ампролия в мг, определенное фотометрическим измерением.

W = вес пробной порции в г.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 частей на миллион, в абсолютном значении, для содержания ампролия ниже 100 частей на миллион;

10 % относительного значения для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm, в абсолютном значении, для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительного значения для содержания выше 10 000 частей на миллион.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТОПАБАТА (метил-4-ацетамидо-2-этоксибензоата)

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество этопабата в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 2 ppm.

2. Принцип

Проба экстрагируется разбавленным метанолом. Раствор подкисляют и экстрагируют хлороформом. Хлороформовый экстракт промывают сначала раствором щелочи, а затем водой. Очищенный экстракт концентрируют, этопабат гидролизуют разбавленной соляной кислотой. Образовавшееся таким образом аминопроизводное диазотируют и связывают с 2-аминоэтил-1-нафтиламином. Окрашенный комплекс экстрагируют бутанолом и измеряют оптическую плотность раствора при 555 нм.

3. Реагенты 3.1. Метанол а.п.

4. Аппаратура 4.1. Конические колбы вместимостью 250 мл с притертыми пробками.

5. Процедура 5.1. Извлечение

Взвесьте с точностью до 1 мг количество тонкоизмельченного и гомогенизированного образца, содержащего около 80 мкг этопабата. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют 100–70 мл разбавленного метанола (3.2). Перемешивают, закрывают колбу и встряхивают в течение 1 ч с помощью шейкера (4.3). Декантируют, фильтруют и отбрасывают первые мл фильтрата.

Все операции по этому пункту должны выполняться быстро.

Перенесите 20 70 мл прозрачного экстракта в делительную воронку емкостью 100 мл (4.2), добавьте 5,0 мл 1/10 разбавленной соляной кислоты (3.4) и 20 70 мл хлороформа (3.6). Встряхивайте сначала осторожно, а затем энергично в течение 3 минут. Оставляют стоять до разделения зон и собирают фазу хлороформа во вторую делительную воронку емкостью 100 мл (4.2).

Кислотную фазу еще дважды экстрагируют по 20,0 мл хлороформа (3.6). Соберите экстракты хлороформа во вторую делительную воронку и отбросьте кислотную фазу. К объединенному раствору хлороформа добавляют 10 мл раствора карбоната натрия (3.7), встряхивают 3 мин и оставляют стоять до разделения фаз. Собирают фазу хлороформа в третью делительную воронку емкостью 100 мл (4.2) и отбрасывают водную фазу. К раствору хлороформа добавляют 10 мл раствора карбоната натрия (3.7), встряхивают 3 мин и оставляют стоять до разделения фаз.

Собирают фазу хлороформа в четвертую делительную воронку емкостью 100 мл (4.2), промывают дважды подряд по 25 мл воды по 70 мл каждый раз, разделяют водные фазы и количественно собирают экстракт хлороформа в баллонную колбу емкостью 250 мл (4.4). Объедините водные фазы в одной из делительных воронок; промойте каждую пустую воронку несколькими мл хлороформа; встряхните водную фазу с тем же мл хлороформа, дайте фазам разделиться и перенесите фазу хлороформа в хлороформенный экстракт, собранный в колбе.

Выпаривают хлороформовый экстракт примерно до 2 мл на водяной бане при температуре 50 °С с помощью ротационного вакуумного испарителя (4.4). Остаток растворяют в 2–3 мл метанола (3.1) и количественно переносят раствор в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл (4.6) с помощью двух порций по 10 мл и одной порции 0,3 N соляной кислоты по 5 мл (3.5). Установите воздушный конденсатор (4.7), добавьте несколько стеклянных шариков, хорошо встряхните, погрузите трубку в ванну с кипящей водой и выдержите 45 минут. Затем охладить под струей холодной проточной воды.

Добавьте 1 70 мл раствора нитрита натрия (3.8), перемешайте и оставьте на 2 минуты. Добавляют 1 70 мл раствора сульфамата аммония (3.9), встряхивают и оставляют на 2 мин. Добавьте 1 70 мл раствора 2-аминоэтил-1-нафтиламина (3.10), перемешайте и оставьте на 10 минут. Добавляют 5 70 г хлорида натрия (3.11) и 10,0 мл н-бутанола (3.12), энергично встряхивают до полного растворения хлорида натрия.

Отберите надосадочный раствор бутанола с помощью пипетки, перенесите его в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл (4.6) и центрифугируйте. Затем измерьте оптическую плотность EA на спектрофотометре при длине волны 555 нм, используя в качестве холостого раствора н-бутанол (3.12).

Проведите контрольное испытание по той же методике, начиная с пункта 5 72, на 20 70 мл разбавленного метанола (3.2). Измерьте оптическую плотность FB при 555 нм, используя в качестве холостого раствора н-бутанол (3.12).

Проводят стандартное испытание по той же методике, начиная с пункта 5 72, на 20 70 мл стандартного раствора (3.14.2). Измерьте оптическую плотность EC при длине волны 555 нм, используя в качестве холостого раствора н-бутанол (3.12).

6. Подсчет результатов

Содержание этопабата в мг на кг образца определяется по формуле >PIC FILE="T0005516">

в котором:

EA = оптическая плотность раствора образца.

EB = оптическая плотность раствора, полученного в результате контрольного испытания.

EC = оптическая плотность раствора, полученного в результате стандартного теста.

W = вес тестовой порции в г.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

20%, по относительной величине, для содержания этопабата ниже 7,75 частей на миллион;

1,75 частей на миллион, по абсолютной величине, для содержания от 7,75 до 10 частей на миллион;

15 % относительного значения для содержания выше 10 частей на миллион.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНИТОЛМИДА (ДОТ) (3,5-динитро-о-толуамида)

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество динитолмида (ДОТ) в кормах, концентратах и ​​премиксах. Производные нитрофурана могут мешать. Нижний предел определения составляет 40 м.д.

2. Принцип

Пробу экстрагируют ацетронитрилом. Экстракт очищают на оксиде алюминия и фильтруют. Аликвоту фильтрата упаривают досуха. Остаток растворяют в диметилформамиде и обрабатывают этилендиамином, образуя комплекс пурпурного цвета. Динитолмид определяют спектрофотометрически при 560 нм.

3. Реагенты 3.1. 85% (по объему) ацетонитрила: смешайте 850 мл чистого ацетонитрила и 150 мл воды. Перед использованием перегоните смесь и соберите фракцию, которая кипит при температуре от 75 до 77 ºC.

4. Аппаратура 4.1. Коническая колба емкостью 250 мл с притертой пробкой.

5. Процедура 5.1. Экстракция и очистка

Взвесьте с точностью до 1 мг 10 г мелко измельченного и гомогенизированного образца. Для концентратов и премиксов отвешивают 1 г с точностью до 1 мг. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют 65 мл ацетонитрила (3.1). Перемешать, присоединить к колбе обратный конденсатор (4.2) и нагревать на водяной бане (4.5) в течение 30 мин, непрерывно встряхивая. Остудить под струей холодной воды. Добавляют 20 г оксида алюминия (3.2), встряхивают 3 мин, оставляют отстаиваться.

Поместите мерную колбу вместимостью 100 мл в вакуум-фильтр (4.4), установите фильтрующий тигель (4.3) и отфильтруйте раствор отсасыванием. Затем перенесите оставшиеся твердые вещества в тигель с помощью нескольких мл ацетонитрила (3.1) и высушите остаток. Сбросьте вакуум, снова суспендируйте осадок в нескольких мл ацетонитрила (3.1) и снова вакуумируйте. Повторяйте эти последние операции до тех пор, пока объем фильтрата не достигнет примерно 95 мл. Доводят до 100 мл ацетонитрилом (3.1) и перемешивают. При необходимости аликвоту разбавляют ацетонитрилом (3.1) до получения раствора, содержащего от 5 до 15 мкг динитолмида на мл.

Пипеткой внесите в три стакана емкостью 50 мл A, B и C соответственно 4 по 70 мл раствора, полученного в 5.1. Также добавьте в стакан С только 170 мл стандартного раствора (3.6). Поместите три стакана на водяную баню (4.5), расположенную под хорошо вентилируемым колпаком, и выпаривайте до высыхания в токе сухого воздуха. Охладите три стакана до комнатной температуры.

Добавьте 10 70 мл N,N-диметилформамида (3.3) в стакан А и 2 70 мл в стаканы В и С соответственно, оставьте на несколько минут, немного помешивая, до полного растворения остатка. Затем в стаканы В и С добавляют по 70 мл диаминоэтана (3.4) и перемешивают. Ровно через 5 минут после добавления диаминоэтана измерьте оптическую плотность трех растворов в спектрофотометре (4.6) при 560 нм, используя N,N-диметилформамид (3.3) в качестве бланка.

6. Подсчет результатов

Содержание динитолмида в мг на кг образца определяется по формуле: >PIC FILE="T0005517">

в котором:

EA = оптическая плотность раствора А (пусто).

EB = оптическая плотность раствора B (образец).

EC = оптическая плотность раствора C (внутренний стандарт).

W = вес тестовой порции в граммах.

F = коэффициент разбавления (возможно, рассчитанный в 5.1).

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 частей на миллион по абсолютной величине для содержания динитолмида ниже 100 частей на миллион;

10 % относительного значения для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm, в абсолютном значении, для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительного значения для содержания выше 10 000 частей на миллион.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКАРБАЗИНА (эквимолекулярная смесь 4,4'-динитрокарбанилида и 2-гидрокси-4,6-диметилпиримидина)

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество никарбазина в кормах, концентратах и ​​премиксах, содержащих не более 5 % травяной муки. Производные нитрофурана, ацетиленгептин и карбадокс могут мешать. Нижний предел определения составляет 20 ppm.

2. Принцип

Проба экстрагируется N,N-диметилформамидом. Экстракт очищают хроматографией на колонке с оксидом алюминия; никарбазин элюируют этанолом. Элюат обрабатывают этанольным гидроксидом натрия; образуя желтый цвет. Никарбазин определяют спектрофотометрически при 430 нм.

3. Реагенты 3.1. N,N-диметилформамид а.п.

>PIC ФАЙЛ="T0005534"> 3.8. Стандартные решения: 3.8.1. Раствор никарбазина 1 725 мг на мл: отвешивают с точностью до 0 71 мг 125 мг стандартного вещества (3 77). Растворяют в 75 мл N,N-диметилформамида (3.1) в мерной колбе вместимостью 100 мл, слегка нагревая, дают остыть, доводят объем тем же растворителем и перемешивают. Держитесь подальше от света.

4. Аппаратура 4.1. Коническая колба емкостью 250 мл с притертой пробкой.

5. Процедура 5.1. Извлечение

Взвесьте с точностью до 1 мг 10 г тонкоизмельченной и гомогенизированной пробы. Для концентратов и премиксов отвешивают 1 г с точностью до 1 мг. Помещают исследуемую навеску в коническую колбу вместимостью 250 мл (4.1) и добавляют ровно 100 мл N,N-диметилформамида (3.1). Перемешать, надеть на колбу обратный конденсатор (4.2) и нагревать на водяной бане (4.3) в течение 15 мин, время от времени встряхивая. Остудить под струей холодной воды. Затем переливают надосадочный слой в центрифужную пробирку (4.4) и центрифугируют около 3 минут. При необходимости 25–70 мл надосадочного слоя разбавляют N,N-диметилформамидом (3.1) до получения раствора, содержащего 2–70–10 мкг никарбазина на мл.

5.2 Хроматография

Вливают в пробирку для хроматографии (4.5) взвесь 30 г оксида алюминия (3.2) в N,N-диметилформамиде (3.1). Дают уровню жидкости упасть на 1 см выше колонки с оксидом алюминия и затем помещают в колонку 25,0 мл экстракта, полученного в 5.1. Дают жидкости стечь, не давая колонке высохнуть, и промывают колонку тремя порциями по 10 мл N,N-диметилформамида (3.1). Затем элюируют 70 мл 95% этанола (3.3). Удалите первые 10 мл элюата и соберите остаток, разделив его следующим образом:

одна порция объемом 5 мл (а);

одну порцию объемом 50 мл (б) в мерную колбу;

одна порция объемом 5 мл (c).

Убедитесь, что части (a) и (c) не желтеют при добавлении этанольного гидроксида натрия (3.6). Продолжайте операции на этапе (b), как показано в 5.3.

5.3 Развитие цвета и измерение оптической плотности

Отнесите пипеткой 20 по 70 мл порции (b) элюата в две отдельные мерные колбы емкостью 25 мл A и B. Добавьте в колбу A 50 мл этанольного гидроксида натрия (3.6) и в колбу B 5,0 мл 95 % метанола ( 3.3).

Хорошо перемешайте.

В течение следующих пяти минут измеряют оптическую плотность обоих растворов при 430 нм, используя в качестве холостого раствора смесь 20 70 мл 95 % метанола (3.3) и 5 ​​70 мл этанольного раствора гидроксида натрия (3.6).

Вычтите значение оптической плотности раствора Б из значения оптической плотности раствора А. По этому значению определите количество никарбазина, сверяясь с калибровочной кривой (5.4).

5.4 Калибровка

Подвергните 25 70 мл стандартного раствора (3.8.3) хроматографии, как показано в 5.2. Наливают порцию (б) элюата в градуированную бюретку (4.7) и распределяют его по мерным колбам вместимостью 25 мл в соответствующих объемах 2,70, 4,70, 6,70, 8,70 и 10,70 мл (соответствует 0,7025, 0,7050). , 0,7075, 0,7100 и 0,7125 мг никарбазина соответственно). В каждую колбу добавляют по 5,0 мл этанольного гидроксида натрия (3.6), дополняют объем 95 %-ным этанолом (3.3) и хорошо перемешивают.

В течение следующих пяти минут измеряют оптическую плотность растворов при 430 нм, используя в качестве контроля смесь 20 70 мл 95 % этанола (3.3) и 5,0 мл этанольного гидроксида натрия (3.6).

Нарисуйте калибровочную кривую, используя значения оптической плотности в качестве ординат и соответствующие количества никарбазина в мг в качестве оси абсцисс.

6. Подсчет результатов

Содержание никарбазина в мг на кг пробы определяется по формуле >PIC FILE="T0005518">

в котором:

A = количество никарбазина в мг, определенное фотометрическим измерением;

W = вес тестовой порции в граммах;

F = коэффициент разбавления (возможно, рассчитанный в 5.1).

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

10 м.д., по абсолютной величине, для содержания никарбазина ниже 100 м.д.;

10 % относительного значения для содержания от 100 до 5 000 частей на миллион;

500 ppm, в абсолютном значении, для содержания от 5 000 до 10 000 ppm;

5 % относительного значения для содержания выше 10 000 частей на миллион.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕНАДИОНА (ВИТАМИНА К3)

1. Цель и сфера применения

Метод позволяет определять количество менадиона (витамина К3) в кормах, концентратах и ​​премиксах. Нижний предел определения составляет 1 ppm.

2. Принцип

Пробу экстрагируют разбавленным этанолом. Смесь осветляют раствором танина и центрифугируют. Экстракт обрабатывают раствором карбоната натрия; высвобожденный менадион экстрагируют 1,2-дихлорэтаном. Дихлорэтановый экстракт обрабатывают в зависимости от содержания в нем менадиона непосредственно или после выпаривания 2,4-динитрофенилгидразином в растворе в этаноле, подкисленном соляной кислотой. Полученный гидразон, обработанный избытком аммиака, образует комплекс сине-зеленого цвета, оптическая плотность которого измеряется при 635 нм.

3. Реагенты 3.1. 96% (по объему) этанола.

4. Аппаратура 4.1. Механический шейкер.

5. Процедура

Все операции необходимо проводить вдали от прямого света, используя при необходимости аппараты из янтарного стекла. 5.1. Тестовый образец

Из мелкоизмельченной пробы отбирают пробу в соответствии с предполагаемым содержанием менадиона, например: от 0,1 до 5,0 г для концентратов и премиксов;

От 20 до 30 г для кормов.

Немедленно перенесите тестируемый образец в колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой.

5.2 Извлечение

Добавьте к исследуемому образцу ровно 96 мл разбавленного этанола (3.2) и механически встряхивайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 4,0 мл раствора танина (3.3), перемешивают, экстракт переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 3000–5000 об/мин. и декантировать.

Поместите от 20 до 40 мл (точно отмеренное) экстракта в сепаратор емкостью 250 мл, добавьте пипеткой 50 мл 1,2-дихлорэтана (3.4), перемешайте и добавьте пипеткой 20 мл раствора карбоната натрия (3.5). Энергично встряхивайте в течение 30 секунд, а затем собирайте фазу дихлорэтана в сепараторе емкостью 100 мл. Добавьте 20 мл воды, снова встряхните в течение 15 секунд, соберите фазу дихлорэтана и удалите следы воды полосками фильтровальной бумаги.

Для концентратов и премиксов берут аликвотную часть экстракта и разбавляют 1,2-дихлорэтаном (3.4) до получения концентрации менадиона от 2 до 10 мкг/мл. Для кормов аликвотную часть экстракта упаривают досуха при пониженном давлении в атмосфере азота на водяной бане при температуре 40°С. Остаток быстро обрабатывают 1,2-дихлорэтаном (3.4) до получения раствора, содержащего от 2 до 10 мкг менадиона на мл.

2,0 мл дихлорэтанового экстракта, полученного в 5.2, переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и добавляют 3,0 мл реагента 2,4-динитрофенилгидразина (3.8), надежно закрывают колбу пробкой или тефлоновой пробкой, чтобы предотвратить испарение и нагревание. в течение двух часов при температуре 70 ºC на водяной бане. Дать остыть, добавить 3,0 мл аммиачного этанола (3.10), перемешать, довести объем абсолютным этанолом (3.7) и еще раз перемешать.

Измерьте оптическую плотность комплекса сине-зеленого цвета с помощью спектрофотометра при 635 нм путем сравнения с холостой реагентом, полученным обработкой 2,0 мл 1,2-дихлорэтана (3.4), как указано в 5.3.

Определите количество менадиона по калибровочной кривой, установленной для каждой серии анализов.

Обработайте 2,0 мл стандартных растворов менадиона (3.11), как описано в 5.3. Измерьте оптическую плотность, как указано в 5.4. Постройте калибровочную кривую, отобразив значения оптической плотности по ординатам и соответствующие количества менадиона в ¶g по оси абсцисс.

6. Подсчет результатов

Рассчитайте содержание менадиона в образце, принимая во внимание вес исследуемого образца и дилатацию, полученную в ходе анализа.

Выразите результат в мг менадиона на кг.

7. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать: - 20 % по относительной величине при содержании менадиона менее 10 ppm;

— 2 ppm по абсолютной величине для содержания от 10 до 14 ppm;

- 15 % по относительной величине для содержания от 14 до 100 частей на миллион;

- 15 частей на миллион по абсолютной величине для содержания от 100 до 150 частей на миллион;

- 10 % относительного значения для содержания более 150 частей на миллион.