Третья Директива Комиссии 72/199/EEC от 27 апреля 1972 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

Третья директива Комиссии

от 27 апреля 1972 г.

установление методов анализа Сообщества для официального контроля кормов

(72/199/ЕЕС)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества;

Принимая во внимание Директиву Совета от 20 июля 1970 г. [1] о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов, и в частности ее Статью 2;

Принимая во внимание, что данная Директива требует, чтобы официальный контроль кормов проводился с использованием методов Сообщества по отбору проб и анализу с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с положениями, установленными законом, нормативными актами или административными действиями, касающимися качества и состава кормов. ;

Принимая во внимание, что Директивы Комиссии № 71/250/EEC [2] от 15 июня 1971 г. и № 71/393/EEC [3] от 18 ноября 1971 г. уже установили ряд методов анализа Сообщества; тогда как, учитывая прогресс, достигнутый в последующей работе, следует принять третий набор методов;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют заключению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы для официального контроля кормов проводились анализы в отношении содержания в них крахмала, сырого белка, сырого белка, который может быть растворен пепсином и соляной кислотой, свободного и общего госсипола, а также активности пепсина. используя методы, описанные в Приложении I к настоящей Директиве.

Общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., устанавливающей методы анализа Сообщества для официального контроля кормов, должны применяться к описанным методам. в Приложении I к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов с целью обнаружения и идентификации антибиотиков тетрациклиновой группы, а также для определения уровней хлортетрациклина, окситетрациклина, тетрациклина, олеандомицина, тилозина и вирджиниамицина в кормах, осуществляться с использованием методов, описанных в Приложении II к настоящей Директиве.

Применяются общие положения, изложенные в Части 1 (Введение) Приложения к Первой Директиве Комиссии № 71/250/EEC от 15 июня 1971 г., за исключением положений, касающихся подготовки пробы для анализа. к методам, описанным в Приложении II к настоящей Директиве.

Статья 3

Государства-члены должны не позднее 1 июля 1973 г. ввести в действие законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Статья 4

Настоящая Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 27 апреля 1972 г.

Для Комиссии

Президент

С. Л. Мэнсхолт

[1] ОЖ № L 170, 3.8.1970, с. 2.

[2] ОЖ № L 155, 12.7.1971, с. 13.

[3] ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7.

----------------------------------------------- ---

ПРИЛОЖЕНИЕ I

Поляриметрический метод

Данный метод позволяет определять содержание крахмала и продуктов деградации высокомолекулярного крахмала в кормах, за исключением тех кормов, которые содержат свекольную стружку, свекольный жом, сушеную свекольную ботву или листья, картофельный жом, обезвоженные дрожжи. , продукты из риса с инулином (например, чипсы и мука из топинамбура) или шкварки.

Способ включает два определения. В первом случае образец обрабатывается в горячем виде разбавленной соляной кислотой. После осветления и фильтрации оптическое вращение раствора измеряют поляриметрически.

Во втором случае образец экстрагируется 40 % этанолом. После подкисления фильтрата соляной кислотой, осветления и фильтрации оптическое вращение измеряют, как при первом определении.

Разница между двумя измерениями, умноженная на известный коэффициент, дает содержание крахмала в образце.

3.1 25% (мас./мас.) соляная кислота, d: 1·126.

3.2 1·128 % (мас./об.) соляная кислота.

Концентрацию необходимо проверять титрованием раствором гидроксида натрия 0,1 N в присутствии 0,1 % (мас./об.) метилового красного в 94 % (об./об.) этаноле. 10 мл = 30·94 мл NaOH 0·1 н.

3.3 Раствор Карреза I: растворить в воде 21,9 г ацетата цинка Zn (CH3COO)2·2H2O и 3 г ледяной уксусной кислоты. Доведите до 100 мл водой.

3.4 Раствор Карреза II: растворяют 10,6 г ферроцианида калия K4 [Fe (CN)6]·3H2O в воде. Доведите до 100 мл водой.

3,5 40 % (по объему) этанола, d: 0,948 при 20°C.

4.1 Колба Эрленмейера емкостью 250 мл со стандартным матовым соединением и обратным холодильником.

4.2 Поляриметр или сахариметр.

5.1 Подготовка образца

Измельчите образец до тех пор, пока он не станет достаточно мелким, чтобы весь образец мог пройти через сито с круглыми ячейками 0,5 мм.

5.2 Определение полного оптического вращения (P или S) (см. наблюдение 7.1)

Взвесьте 2,5 г измельченного образца с точностью до мг и поместите его в градуированную колбу емкостью 100 мл. Добавляют 25 мл соляной кислоты (3.2), встряхивают до равномерного распределения исследуемой пробы и добавляют еще 25 мл соляной кислоты (3.2). Погрузите колбу в кипящую водяную баню, энергично и равномерно встряхивая в течение первых трех минут, чтобы предотвратить образование агломератов. Количество воды в водяной бане должно быть достаточным для того, чтобы баня оставалась при температуре кипения при вводе в нее колбы. Колбу нельзя вынимать из ванны во время встряхивания. Ровно через 15 минут выньте из ванны, добавьте 30 мл холодной воды и сразу остудите до 20°С.

Добавьте 5 мл раствора Карреза I(3.3) и встряхивайте в течение одной минуты. Затем добавьте 5 мл раствора Карреза II (3.4) и снова встряхивайте в течение одной минуты. Довести до объема водой, гомогенизировать и профильтровать. Если фильтрат не совсем прозрачный (что бывает редко), повторите определение, используя большее количество растворов Карреза I и II, например 10 мл.

Измерьте оптическое вращение раствора в трубке диаметром 200 мм с помощью поляриметра или сахариметра.

5.3 Определение оптического вращения (P’ или S’) веществ, растворимых в 40 % этаноле

Взвесьте 5 г образца с точностью до мг, поместите его в градуированную колбу емкостью 100 мл и добавьте около 80 мл этанола (3,5) (см. наблюдение 7.2). Оставьте колбу на 1 час при комнатной температуре; за это время шесть раз энергично встряхните, чтобы испытуемый образец тщательно перемешался с этанолом. Доведите объем этанолом (3,5), гомогенизируйте и отфильтруйте.

Внесите пипеткой 50 мл фильтрата (= 2,5 г образца) в колбу Эрленмейера емкостью 250 мл, добавьте 2,1 мл соляной кислоты (3.1) и энергично встряхните. Присоедините к колбе Эрленмейера обратный холодильник и погрузите ее в кипящую водяную баню. Ровно через 15 минут выньте колбу Эрленмейера из бани, перенесите ее содержимое в градуированную колбу вместимостью 100 мл, промойте ее небольшим количеством холодной воды и остудите до 20 °С.

Проясните растворами Карреза I (3.3) и II (3.4), доведите объем водой, гомогенизируйте, отфильтруйте и измерьте оптическое вращение, как указано во 2-м и 3-м параграфах 5.2.

Содержание крахмала в процентах от образца рассчитывается следующим образом:

6.1 Измерение поляриметрически

Процент крахмала =

2000

P−P′αD20°

где:

P = общее оптическое вращение в градусах;

P' = оптическое вращение в градусах веществ, растворимых в 40 % этаноле;

αD20° + 185·9°: рисовый крахмал,

+195·4° : картофельный крахмал,

+184·6°: кукурузный крахмал,

+182·7° : крахмал пшеничный,

+181·5° : ячменный крахмал,

+181·3° : овсяный крахмал,

+184·0°: прочие виды крахмала и смеси крахмалов в комбикормах.

6.2 Измерение сахариметрическим методом

Процент крахмала =

·

/ =

26·6 Н

S − S′αD20°

где:

S = общее оптическое вращение в сахариметрических градусах;

S' = оптическое вращение в сахариметрических градусах веществ, растворимых в 40 % этаноле;

Н =

Масса сахарозы в 100 мл воды в г, обеспечивающая оптическое вращение 100 сахариметрических градусов в пробирке диаметром 200 мм. Вес варьируется в зависимости от типа используемого сахариметра следующим образом:

16·29 г для французских сахариметров,

26·00 г для немецких сахариметров,

20·00 г для других сахариметров;

αD20° = удельное оптическое вращение чистого крахмала (см. 6.1).

6.3 Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 0,4 по абсолютной величине для содержания крахмала менее 40 % и 1 % по относительной величине для содержания крахмала 40 % и более.

7.1 Если в пробе содержится более 6 % карбонатов в пересчете на карбонат кальция, перед определением общего оптического вращения их необходимо разрушить обработкой точно соответствующим количеством разбавленной серной кислоты.

7.2 В случае продуктов с высоким содержанием лактозы, таких как сухая молочная сыворотка или сухое обезжиренное молоко, после добавления 80 мл этанола (3.5) поступают следующим образом. Прикрепите к колбе обратный холодильник и погрузите ее в водяную баню при температуре 50°С на 30 мин. Дайте остыть и продолжайте анализ, как указано в 5.3.

Данный метод позволяет традиционно определять содержание сырого протеина в кормах на основе содержания азота, определенного по методу Кьельдаля.

Образец разлагается путем мокрого сжигания. Кислый раствор подщелачивают раствором гидроксида натрия. Выделившийся аммиак удаляют перегонкой и собирают в отмеренном количестве серной кислоты, избыток которой титруют раствором гидроксида натрия.

3.1 Сульфат калия А.Р.

3.2 Катализатор: оксид меди CuO A.R. или кристаллизованный сульфат меди CuSO4 · 5H2O А.Р. или ртуть или оксид ртути HgO A.R.

3.3 Цинк гранулированный А.Р.

3.4 Серная кислота A.R., d: 1·84.

3,5 Серная кислота 0·1 н.

3,6 Серная кислота 0,5 н.

3.7 Индикатор метилового красного: растворите 300 мг метилового красного в 100 мл 95–96 % (по объему) этанола.

3.8 40 % раствор (мас./об.) гидроксида натрия.

3.9 Раствор гидроксида натрия 0,1 н.

3.10 Раствор гидроксида натрия 0,25 н.

3.11 Насыщенный раствор сульфида натрия А.Р.

3.12 8 % раствор (мас./об.) тиосульфата натрия, Na2S2O3·5H2O А.Р.

3.13 Гранулированная пемза, промытая соляной кислотой и озоленная.

Аппарат для разложения путем сжигания и для дистилляции по методу Кьельдаля (см. наблюдение 7.1).

5.1 Пищеварение

Взвесьте 1 г образца с точностью до мг и поместите его в колбу аппарата для расщепления. Добавляют 10 г сернокислого калия (3.1), соответствующее количество катализатора (3.2) (0,3–0,4 г оксида меди или 0,9–1,2 г сульфата меди, или каплю ртути, или 0· 6-0,7 г оксида ртути), 25 мл серной кислоты (3.4) и несколько гранул пемзы (3.13). Гомогенизировать. Колбу сначала нагревают умеренно, время от времени встряхивая, пока масса не обуглится и не исчезнет пена; затем нагревайте интенсивнее, пока жидкость не закипит. Не допускайте перегрева боковых сторон и прилипания к ним органических частиц. Когда раствор станет прозрачным и бесцветным (или светло-зеленым, если используется катализатор на основе меди), продолжайте кипятить еще час, затем дайте остыть.

5.2 Дистилляция

Осторожно добавьте 250–350 мл воды, все время помешивая, чтобы сульфаты полностью растворились; оставьте остывать. Добавьте несколько гранул цинка (3.3).

Поместите в сборную колбу перегонного аппарата точно отмеренное количество 25 мл серной кислоты 0,1 Н (3,5) или 0,5 Н (3,6) в зависимости от предполагаемого содержания азота (см. наблюдение 7.2), и добавьте несколько капель индикатора метилового красного (3.7).

Подсоедините колбу к конденсатору перегонного аппарата и погрузите конец конденсатора в жидкость, содержащуюся в сборной колбе, на глубину не менее 1 см (см. наблюдение 7.3). Медленно вливают в колбу через капельную воронку 100 мл 40 % раствора гидроксида натрия (3.8). Если использовался катализатор на основе ртути, добавьте также либо 10 мл раствора сульфида натрия (3.11), либо 25 мл раствора тиосульфата натрия (3.12).

Нагрейте колбу таким образом, чтобы за 30 минут перегналось примерно 150 мл жидкости. По истечении этого времени проверьте pH полученного дистиллята лакмусовой бумажкой. Если реакция щелочная, продолжайте перегонку. Прекратите, когда дистиллят станет нейтральным по отношению к лакмусовой бумажке. Во время перегонки следите за окраской и время от времени встряхивайте содержимое сборной колбы. Если жидкость пожелтела, немедленно добавьте точно отмеренный объем серной кислоты 0,1 Н (3,5) или 0,5 Н (3,6).

5.3 Титрование

В сборной колбе титруйте избыток серной кислоты раствором гидроксида натрия 0,1 Н (3,9) или 0,25 Н (3,10), в зависимости от нормальности используемой серной кислоты, до тех пор, пока окраска не станет бледно-желтой.< /п>

5.4 Проверка метода

Чтобы установить, не содержат ли реагенты азота, проведите холостой тест (перегонка и титрование), исключая анализируемую пробу. Для проверки точности метода проводят анализ (разложение, перегонку и титрование) на 1,5-2,0 г ацетанилида А.Р. (т.пл. 114°С; % N: 10·36) в присутствии 1 г безазотистой сахарозы; На 1 г ацетанилида расходуется 14·80 мл серной кислоты 0·5 н.

Определить объем израсходованной серной кислоты. 1 мл серной кислоты 0,1 Н соответствует 1,4 мг азота. Умножьте количество азота на коэффициент 6·25. Выразите результат в процентах от выборки.

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

- 0,2 по абсолютной величине для содержания сырого протеина менее 20 %;

- 1,0 %, в относительном значении, для содержания не менее 20 % и не более 40 %;

- 0·4 по абсолютной величине для содержания более 40 %.

7.1 Можно использовать определенное оборудование, требующее перехода от разложения к дистилляции. Если используется такой аппарат, перенос должен быть осуществлен без потерь.

7.2 Для продуктов с низким содержанием азота объем серной кислоты 0,1 Н, помещаемой в сборную колбу, может быть уменьшен при необходимости до 10 или 15 мл и доведен водой до 25 мл.< /п>

7.3 Если колба перегонного аппарата не снабжена капельной воронкой, добавьте гидроксид натрия непосредственно перед присоединением колбы к конденсатору, медленно сливая жидкость по стенкам конденсатора, чтобы она не смешивалась с раствор кислоты.

Данный метод позволяет определить долю сырого белка, растворенного пепсином и соляной кислотой в определенных условиях. Он применим ко всем кормам.

Образец нагревают в течение 48 часов при температуре 40 °C в растворе гидрохлорида пепсина. Суспензию фильтруют и определяют содержание азота в фильтрате по методу определения сырого белка.

3.1 Соляная кислота, d: 1·125.

3.2 Соляная кислота 0,075 Н.

3,3 2,0 Ед/мг пепсина; Активность пепсина определяется методом, описанным в Части 4 настоящего Приложения, и должна быть установлена ​​в соответствии с этим методом.

3.4 Около 0,2 % (мас./об.) свежеприготовленного раствора пепсина в соляной кислоте (3.2): активность: 400 Ед/л.

3.5 Противопенная эмульсия (например, силикон).

3.6 Все реагенты, перечисленные в пункте 3 метода определения сырого белка.

4.1 Водяная баня или инкубатор с температурой 40 °C ± 1 °C.

4.2 Аппарат для разложения и дистилляции по Кьельдалю.

5.1 Приготовление раствора (см. наблюдение 7.2)

Взвесьте 2 г образца с точностью до миллиграмма и поместите его в градуированную колбу емкостью 500 мл. Добавляют 450 мл раствора гидрохлорида пепсина (3.4), предварительно нагретого до 40 °С, и встряхивают, чтобы предотвратить образование агломератов. Убедитесь, что pH суспензии меньше 1,7. Поместите колбу на водяную баню или в инкубатор (4.1) и оставьте там на 48 часов. Встряхните через 8, 24 и 32 часа. Через 48 часов добавляют 15 мл соляной кислоты (3.1), охлаждают до 20 °С, доводят объем водой и фильтруют.

5.2 Пищеварение

Отбирают 250 мл фильтрата и помещают в колбу перегонного аппарата (4.2). Добавляют реагенты, необходимые для переваривания, указанные во втором предложении 5.1 метода определения сырого белка. Гомогенизировать и довести до кипения. Если образуется пена, добавьте несколько капель пеногасящей эмульсии (3.5). Продолжайте энергично кипятить, пока вода почти полностью не выпарится. Уменьшите огонь и тщательно удалите последние следы воды.

Когда раствор станет прозрачным и бесцветным (или светло-зеленым, если используется катализатор на основе меди), продолжайте кипятить еще час. Оставьте остывать.

5.3 Дистилляция и титрование

Действуйте, как указано в 5.2 и 5.3 метода определения сырого белка.

5.4 Пустой тест

Проведите холостой тест, используя ту же процедуру, но без анализа образца.

Вычтите объем серной кислоты, израсходованный в холостом тесте, из объема, потребленного испытуемым образцом. 1 мл серной кислоты 0,1 Н соответствует 1,4 мг азота.

Умножьте количество азота на коэффициент 6·25. Выразите результат в процентах от выборки.

Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

- 0,4 по абсолютной величине для содержания менее 20 %;

- 2,0 %, в относительном значении, для содержания не менее 20 % и не более 40 %;

- 0,8 по абсолютной величине, для содержания более 40 %.

7.1 Значения, полученные данным методом, не имеют прямой связи с усвояемостью in vivo.

7.2 Продукты с содержанием масла или жира более 10 % необходимо предварительно обезжирить путем экстракции петролейным эфиром (температура кипения от 40 до 60 °C).

Данный метод позволяет установить активность пепсина, используемого при определении сырого белка, растворенного пепсином и соляной кислотой.

Гемоглобин обрабатывают пепсином в среде соляной кислоты при определенных условиях. Негидролизованную фракцию белка осаждают трихлоруксусной кислотой. К фильтрату добавляют гидроксид натрия и реактив Фолина-Чокальтеу. Оптическую плотность этого раствора измеряют при 750 нм, а соответствующее количество тирозина определяют по калибровочной кривой.

Определение: Единица пепсина определяется как количество фермента, который в условиях метода высвобождает в минуту количество гидроксиарильных групп, которые при окрашивании реагентом Фолина-Чиокальтеу имеют оптический оптический эффект. плотность соответствует плотности одного мкмоля тирозина, окрашенного таким же образом.

3.1 Соляная кислота 0,2 н.

3.2 Соляная кислота 0,06 Н.

3.3 Соляная кислота 0,025 Н.

3.4 5 % раствор (мас./об.) трихлоруксусной кислоты.

3,5 Раствор гидроксида натрия 0,5 н.

3.6 Реагент Фолина-Чокальтеу. Поместите 100 г вольфрамата натрия (Na2WO4.2H2O), 25 г молибдата натрия (Na2MoO4.2H2O) и 700 мл воды в круглодонную колбу емкостью 2 л, снабженную стандартным матовым соединением. Добавляют 50 мл фосфорной кислоты (д: 1·71) и 100 мл концентрированной соляной кислоты (д: 1·19), подключают к колбе обратный холодильник, доводят до кипения и выдерживают раствор при слабом кипении в течение 10 часов. Дать остыть, отсоединить обратный холодильник, добавить 175 г сернокислого лития (Li2SO4.2H2O), 50 мл воды и 1 мл брома. Кипятите 15 минут, чтобы удалить излишки брома.

Оставьте остывать, перенесите раствор в градуированную колбу емкостью 1 л, доведите объем водой, гомогенизируйте и отфильтруйте. Никакого зеленоватого оттенка оставаться не должно. Перед использованием разбавьте 1 объем реагента 2 объемами воды.

3.7 Раствор гемоглобина: Взвесьте количество гемоглобина (около 2 г белкового субстрата, определенное по Энсону), соответствующее 354 мг азота [1], и поместите в колбу емкостью 200 мл, снабженную стандартным матовым соединением. Добавьте несколько мл соляной кислоты (3.2), подсоедините колбу к вакуум-насосу и встряхивайте до полного растворения гемоглобина. Снимите вакуум и, встряхивая, добавьте соляную кислоту (3.2) до объема 100 мл. Готовьте непосредственно перед использованием.

3.8 Стандартный раствор тирозина: растворяют 181,2 мг тирозина в соляной кислоте (3.1) и доводят до 1 л той же кислотой (карандашный раствор). Берут 20,0 мл и разбавляют до 100 мл соляной кислотой (3.1). В 1 мл этого раствора содержится 0,2 мкмоля тирозина.

4.1 Водяная баня настроена на температуру 25 °C ± 0,1 °C с помощью ультратермостата.

4.2 Спектрофотометр.

4.3 Хронометр, точность: 1 секунда.

4.4 pH-метр.

5.1 Приготовление раствора (см. замечание 7.1)

150 мг пепсина растворяют в 100 мл соляной кислоты (3.2). Отнесите пипеткой 2 мл раствора в градуированную колбу вместимостью 50 мл и доведите объем соляной кислотой (3.3). Значение pH, проверенное с помощью pH-метра, должно составлять 1,6 ± 0,1. Погрузите колбу в водяную баню (4.1).

5.2 Гидролиз

Внесите пипеткой 5,0 мл раствора гемоглобина (3.7) в пробирку, нагрейте до 25 °С на водяной бане (4.1), добавьте 1,0 мл раствора пепсина, полученного в 5·1, и смешайте с стеклянный стержень, утолщенный на одном конце, совершив примерно 10 движений вперед-назад. Оставьте пробирку на водяной бане при температуре 25°С ровно на 10 минут с момента добавления раствора пепсина (следует строго соблюдать продолжительность и температуру). Затем добавляют 10,0 мл раствора трихлоруксусной кислоты (3.4), предварительно нагретого до 25 °С, гомогенизируют и фильтруют через сухой фильтр.

5.3 Развитие окраски и измерение оптической плотности

Внесите пипеткой 5,0 мл фильтрата в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл, добавьте 10,0 мл раствора гидроксида натрия (3.5) и, постоянно встряхивая, 3,0 мл разбавленного реактива Фолина-Чиокальтеу (3.6). Через 5-10 минут определите оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 750 нм в кюветах толщиной 1 см по воде.

5.4 Пустой тест

Для каждого определения проведите холостой тест следующим образом:

Внесите пипеткой 5,0 мл раствора гемоглобина (3.7) в пробирку, нагрейте до 25 °С на водяной бане (4.1), добавьте 10,0 мл раствора трихлоруксусной кислоты (3.4), предварительно нагретого до 25 °С. , гомогенизируют, затем добавляют 1,0 мл раствора пепсина, полученного в 5.1. Перемешайте стеклянной палочкой и оставьте пробирку на водяной бане (4.1) при температуре 25 °С ровно на 10 минут. Гомогенизировать и профильтровать через сухой фильтр. Следуйте процедуре, указанной в 5.3.

5.5 Калибровочная кривая

Поместите 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0 мл аликвоты стандартного раствора тирозина (3.8), соответствующие 0,2, 0,4, 0,6, 0,8. и 1,0 мкмоль тирозина соответственно в колбах Эрленмейера емкостью 50 мл. Завершите серию эталонным раствором, не содержащим тирозина. Доводят объемы до 5,0 мл соляной кислотой (3.1). Добавляют 10,0 мл раствора гидроксида натрия (3.5) и, постоянно встряхивая, 3,0 мл разбавленного реактива Фолина-Чиокальтеу (3.6). Измерьте оптическую плотность, как указано в последнем предложении 5.3. Проследите калибровочную кривую, построив зависимость оптической плотности от количества тирозина.

По калибровочной кривой определите количество тирозина в мкмоль, соответствующее оптической плотности окрашенного раствора, скорректированное на основе холостого значения.

Активность пепсина тирозина в мкмолях при 25 °C, на мг и в минуту, рассчитывается по формуле:

Единицы на мг

=

0·32 АП

где:

a = количество тирозина в мкмолях, определенное по калибровочной кривой;

p = масса пепсина, добавленного в 5.2, в мг.

7.1 Количество растворяемого пепсина должно быть таким, чтобы при окончательном фотометрическом измерении была получена оптическая плотность 0,35 ± 0,035.

7.2 Две единицы на мг, полученные этим методом, соответствуют:

3,64 миллиединицы Ансона/мг (мкмоль тирозина/мг · мин при 35,5 °C) или

36400 коммерческих единиц/г (мкмоль тирозина/г за 10 мин при 35·5 °C).

Данный метод позволяет определять содержание свободного госсипола, общего госсипола и химически родственных веществ в семенах хлопчатника, хлопковом шроте и хлопковом жмыхе, а также в комбикормах, содержащих эти вещества, где их содержание превышает 20 ppm.

Госсипол экстрагируют в присутствии 3-аминопропан-1-ола либо смесью пропан-2-ола и гексана для определения свободного госсипола, либо диметилформамидом для определения общего содержания госсипола. Госсипол под действием анилина превращается в госсипол-дианилин, оптическая плотность которого измеряется при 440 нм.

3.1 Смесь пропан-2-ол-гексан: смешайте 60 объемных частей пропан-2-ола А.Р. с 40 объемными частями н-гексана.

3.2 Растворитель А: Поместите в градуированную колбу емкостью 1 литр примерно 500 мл смеси пропан-2-ол-гексан (3.1), 2 мл 3-аминопропан-1-ола, 8 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл воды. Доведите объем смесью пропан-2-ол-гексан (3.1). Этот реагент стабилен в течение одной недели.

3.3 Растворитель B: Внесите пипеткой 2 мл 3-аминопропан-1-ола и 10 мл ледяной уксусной кислоты в градуированную колбу емкостью 100 мл. Остудить до комнатной температуры и довести до объема N,N-диметилформамидом. Этот реагент стабилен в течение одной недели.

3.4 Анилин А.Р.: Если оптическая плотность в холостой пробе превышает 0,022, перегоняют анилин над цинковой пылью, отбрасывая первую и последнюю 10% фракции дистиллята. Этот реагент можно хранить в холодильнике и хранить в коричневой стеклянной колбе с пробкой в ​​течение нескольких месяцев.

3.5 Стандартный раствор госсипола А: Поместите 27,9 мг ацетата госсипола в градуированную колбу емкостью 250 мл. Растворить и довести объем растворителем А (3.2). Отнесите пипеткой 50 мл этого раствора в градуированную колбу вместимостью 250 мл и доведите объем растворителем А. Концентрация госсипола в этом растворе составляет 0,02 мг на мл. Перед использованием дайте постоять один час при комнатной температуре.

3.6 Стандартный раствор госсипола B: Поместите 27,9 мг ацетата госсипола в градуированную колбу емкостью 50 мл, растворите и доведите объем растворителем B (3.3). Концентрация госсипола в этом растворе составляет 0,5 мг на мл.

Стандартные растворы госсипола A и B остаются стабильными в течение 24 часов при условии защиты от света.

4.1 Миксер (тумблер): примерно 35 об/мин.

4.2 Спектрофотометр.

5.1 Тестовый образец

Количество используемого тестового образца зависит от предполагаемого содержания госсипола в образце. Предпочтительно работать с небольшим тестируемым образцом и относительно большой аликвотной частью фильтрата, чтобы получить достаточное количество госсипола для проведения точных фотометрических измерений. Для определения свободного госсипола в семенах хлопчатника, хлопковом шроте и хлопковом жмыхе масса исследуемой пробы не должна превышать 1 г; для комбикормов она может составлять до 5 г. В большинстве случаев подходит аликвотная часть фильтрата объемом 10 мл; он должен содержать от 50 до 100 мкг госсипола. Для определения общего содержания госсипола масса исследуемого образца должна составлять от 0,5 до 5 г, при этом аликвота фильтрата объемом 2 мл будет содержать от 40 до 200 мкг госсипола.

Анализ следует проводить при комнатной температуре около 20 °C.

5.2 Определение свободного госсипола

Поместите испытуемый образец в колбу емкостью 250 мл с притертым горлышком, дно колбы покрыто битым стеклом. Пипеткой добавляют 50 мл растворителя А (3.2), закрывают колбу пробкой и перемешивают в течение часа в миксере. Фильтруют через сухой фильтр и собирают фильтрат в небольшую колбу с притертым горлышком. Во время фильтрации накрывайте воронку часовым стеклом. Внесите пипеткой одинаковые аликвотные части фильтрата, содержащие от 50 до 100 мкг госсипола, в каждую из двух градуированных колб емкостью 25 мл (А и В). При необходимости доводят объем до 10 мл растворителем А (3.2). Затем доводят содержимое колбы (А) до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1). Этот раствор будет использоваться в качестве эталонного раствора для измерения образца раствора.

Внесите пипеткой по 10 мл растворителя А (3.2) в каждую из двух других градуированных колб емкостью 25 мл (C и D). Доведите содержимое колбы (С) до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1). Этот раствор будет использоваться в качестве эталонного раствора для измерения контрольного раствора.

Добавьте по 2 мл анилина (3.4) в каждую колбу (D) и (B). Нагревайте в течение 30 минут на кипящей водяной бане для проявления цвета. Остудить до комнатной температуры, довести до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1), гомогенизировать и оставить на один час.

Определите оптическую плотность холостой тестируемого раствора (D) путем сравнения с эталонным раствором (C) и оптическую плотность раствора образца (B) путем сравнения с эталонным раствором (A) в спектрофотометре при 440 нм с использованием стеклянных кювет диаметром 1 см.

Вычтите оптическую плотность холостой тестируемого раствора из оптической плотности раствора образца (= скорректированная оптическая плотность). По этому значению рассчитайте содержание свободного госсипола, как указано в пункте 6.

5.3 Определение общего содержания госсипола

Поместите испытуемый образец, содержащий от 1 до 5 мг госсипола, в градуированную колбу емкостью 50 мл и добавьте 10 мл растворителя B (3.3). Одновременно готовят холостой тест, помещая 10 мл растворителя Б (3.3) в другую градуированную колбу вместимостью 50 мл. Нагрейте две колбы в течение 30 минут на кипящей водяной бане. Остудить до комнатной температуры и довести содержимое каждой колбы до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1). Гомогенизируйте и оставьте отстояться на 10–15 минут, затем профильтруйте и соберите фильтраты в колбы с притертым горлышком.

Внесите пипеткой по 2 мл фильтрата образца в каждую из двух градуированных колб емкостью 25 мл и по 2 мл холостого фильтрата в каждую из двух других колб емкостью 25 мл. Содержимое одной колбы из каждой серии доводят смесью пропан-2-ол-гексан (3.1) до 25 мл. Эти решения будут использоваться в качестве эталонных.

Добавьте по 2 мл анилина (3.4) в каждую из двух других колб. Нагревайте в течение 30 минут на кипящей водяной бане для проявления цвета. Охладить до комнатной температуры, довести до 25 мл смесью пропан-2-ол-гексан (3.1), гомогенизировать и оставить на один час.

Определяют оптическую плотность свободного госсипола, как указано в 5.2. По этому значению рассчитайте общее содержание госсипола, как указано в пункте 6.

Результаты могут быть рассчитаны либо по удельной оптической плотности (6.1), либо по калибровочной кривой (6.2).

6.1 От удельной оптической плотности

Удельные оптические плотности в описанных условиях будут следующими:

бесплатный госсипол: | E 1 %1 см = 625 |

всего госсипола: | E 1 %1 см = 600 |

Содержание свободного или общего госсипола в образце рассчитывается по следующей формуле:

% госсипола =

Э

· п · а

где:

E = скорректированная оптическая плотность, определенная, как указано в 5.2;

p = тестовый образец в г;

a = аликвотная часть фильтрата в мл.

6.2 По калибровочной кривой

6.2.1 Бесплатный госсипол

Подготовьте 2 серии по пять градуированных колб емкостью 25 мл. В каждую серию колб вносят аликвоты стандартного раствора госсипола А (3.5) по 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 и 10,0 мл. Доводят объемы до 10 мл растворителем А (3.2). Каждую серию дополните градуированной колбой емкостью 25 мл, содержащей только 10 мл растворителя А (3.2) (холостой тест).

Объем колб первой серии (включая колбу для холостой пробы) довести до 25 мл смесью пропан-2-ол-гексан (3.1) (эталонная серия).

Добавьте по 2 мл анилина (3.4) в каждую колбу второй серии (включая колбу для холостого теста). Нагревайте в течение 30 минут на кипящей водяной бане для проявления цвета. Остудить до комнатной температуры, довести до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1), гомогенизировать и оставить на один час (стандартная серия).

Определяют, как указано в 5.2, оптическую плотность растворов стандартной серии путем сравнения с соответствующими растворами эталонной серии. Проследите калибровочную кривую, построив график зависимости оптической плотности от количества госсипола (в мкг).

6.2.2 Общий госсипол

Подготовьте шесть градуированных колб емкостью 50 мл. В первую колбу помещают 10 мл растворителя Б (3.3), а в остальные — 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 и 10,0 мл стандартного раствора госсипола Б (3,6) соответственно. Содержимое каждой колбы доводят растворителем Б (3.3) до 10 мл. Нагревайте 30 минут на кипящей водяной бане. Остудить до комнатной температуры, довести до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1) и гомогенизировать.

Поместите по 2,0 мл этих растворов в каждую из двух серий по шесть градуированных колб емкостью 25 мл. Содержимое колб первой серии довести до 25 мл смесью пропан-2-ол-гексан (3.1) (эталонная серия).

В каждую колбу второй серии добавьте по 2 мл анилина (3.4). Нагревайте 30 минут на кипящей водяной бане. Остудить до комнатной температуры, довести до объема смесью пропан-2-ол-гексан (3.1), гомогенизировать и оставить на один час (стандартная серия).

Определяют, как указано в 5.2, оптическую плотность растворов стандартной серии путем сравнения с соответствующими растворами эталонной серии. Проследите калибровочную кривую, построив график зависимости оптической плотности от количества госсипола (в мкг).

6.3 Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

- 15 %, в относительном выражении, при содержании госсипола менее 500 ppm;

- 75 ppm по абсолютной величине для содержания не менее 500 ppm и не более 750 ppm;

- 10 % в относительном значении для содержания более 750 ppm.

[1] Определите содержание азота полумикрометодом Кьельдаля (теоретическое содержание: 17,7 % азота).

----------------------------------------------- ---

ПРИЛОЖЕНИЕ II

Данный метод позволяет обнаруживать и идентифицировать антибиотики группы тетрациклина в кормах, содержащих не менее 0,1 ppm антибиотиков, в концентратах и ​​премиксах.

Образец экстрагируют смесью метанола и соляной кислоты. Экстракт и растворы сравнения для сравнения подвергают восходящей бумажной хроматографии. Антибиотики обнаруживают и идентифицируют путем сравнения их значений Rf со значениями Rf стандартных веществ либо по флуоресценции в УФ-свете (высокое содержание антибиотиков), либо путем биоавтографии на агаризованной среде, инокулированной B. cereus.

3.1 Буферный раствор, pH 3,5

Моногидрат лимонной кислоты А.Р. | 10·256 г |

ДиНатрий гидрофосфат Na2HPO4 · 2H2O А.Р. | 7·45 г |

Ацетон А.Р. | 300 мл |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

3.2 Фосфатный буферный раствор, pH 5,5

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 130·86 г |

ДиНатрий гидрофосфат Na2HPO4 · 2H2O А.Р. | 6·947 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Элюент I: | Смесь чистого нитрометана/чистого хлороформа/1,3-дихлорпропан-2-ола: 20/10/1,5 по объему. готовить непосредственно перед использованием. |

Элюент II: | Смесь чистого нитрометана/чистого хлороформа/2-пиколина: 20/10/3 по объему. Готовьте непосредственно перед использованием. |

3,3 3,4 3,5 Смесь чистого метанола/соляной кислоты (д: 1·19): 98/2 по объему.

3.6 Соляная кислота 0·1 н.

3,7 Аммиак, d:0·91.

3.8 Стандартные вещества: хлортетрациклин, окситетрациклин, тетрациклин, активность которых выражается в пересчете на гидрохлорид.

3.9 Микроорганизм: B. cereus ATCC № 11.778

Поддержание родительского штамма, приготовление суспензии спор и инокуляция культуральной среды: следуйте указаниям, приведенным в 3.1 и 3.2 метода определения содержания хлортетрациклина, окситетрациклина и тетрациклина путем диффузии на агар, который описан в Часть 2 настоящего Приложения.

3.10 Культуральная среда [1]

Глюкоза | 1 г |

Триптический пептон | 10 г |

Мясной экстракт | 1·5 г |

Дрожжевой экстракт | 3 г |

Агарь | 20 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Непосредственно перед использованием отрегулируйте pH до 5,8.

3.11 0,1 % (мас./об.) раствор хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия и 5 % (мас./об.) раствор глюкозы.

4.1 Аппарат для восходящей бумажной хроматографии (высота бумаги 25 см). Бумага Schleicher and Schüll (2040b или 2043b) или эквивалент.

4.2 Центрифуга.

4.3 Инкубатор настроен на температуру 30 °C.

4,4 У.В. лампа для обнаружения флуоресценции.

4.5 Стеклянные пластинки размером примерно 20×30 см для биоавтографии.

5.1 Стандартные решения

Используя соляную кислоту (3.6), приготовьте из стандартных веществ (3.8) растворы с концентрацией, соответствующей 500 мкг/мл хлортетрациклина-HCl, окситетрациклина-HCl и тетрациклина-HCl.

5.2 Эталонные растворы для обнаружения с помощью УФ-излучения

Разбавьте растворы (5.1) фосфатным буферным раствором (3.2) для получения растворов с концентрацией, соответствующей 100 мкг на мл хлортетрациклина-HCl, окситетрациклина-HCl и тетрациклина-HCl.

5.3 Эталонные растворы для обнаружения методом биоавтографии

Разбавьте растворы (5.1) фосфатным буферным раствором (3.2) для получения растворов с концентрацией, соответствующей 5 мкг на мл хлортетрациклина-HCl, окситетрациклина-HCl и тетрациклина-HCl.

Когда предполагаемое содержание антибиотика составляет менее 10 частей на миллион, можно использовать либо гомогенизированную пробу, либо самую мелкую фракцию, отделенную просеиванием, поскольку антибиотики должны быть обнаружены в основном в этой фракции.

Суспендируйте образец в смеси (3.5) и центрифугируйте. Соберите надосадочную жидкость и используйте ее непосредственно или, при необходимости, разбавьте смесью (3.5) для получения концентрации антибиотика примерно 100 мкг на мл (6.1) и 5 ​​мкг на мл (6.2).

7.1 Хроматография

Погрузите бумагу в буферный раствор, pH 3,5 (3,1). Удалите лишнюю жидкость, зажав бумагу между листами сухой фильтровальной бумаги. Затем наносят на бумагу объемы 0,01 мл эталонных растворов (5.2 и 5.3) и экстракта (6.1 и 6.2). Чтобы обеспечить хорошее разделение, бумага должна иметь правильное содержание влаги; при необходимости дайте немного подсохнуть.

Проявить методом восходящей хроматографии. Используйте элюент I (3.3) для обнаружения методом биоавтографии и элюент II (3.4) для обнаружения с помощью УФ-света. Когда фронт растворителя поднимется на 15–20 см (приблизительно 1 час 30 минут), прекратите хроматографию и высушите бумагу.

7.2 Обнаружение с помощью УФ-излучения

Если уровень антибиотика превышает 1 мкг на см2, то после обработки хроматограммы парами аммиака (3.7) при облучении УФ-лампой (4.4) будут видны золотисто-желтые флуоресцентные пятна.

7.3 Обнаружение методом биоавтографии

Вылейте культуральную среду (3.10), предварительно инокулированную B. cereus (3.9), в стеклянные пластинки (4.5) и поместите бумагу на культуральную среду. Через 5 минут контакта отсоедините бумагу и поместите ее в другое место культуральной среды, где она будет оставаться в течение периода инкубации. Инкубируйте в течение ночи при 30°С. При наличии антибиотика группы тетрациклинов в мутной питательной среде появятся световые зоны ингибирования.

Для фиксации хроматограммы раствор (3.11) после инкубации напаривают на бумагу.

7.4 Идентификация

Относительные значения Rf антибиотиков группы тетрациклинов приведены ниже. Эти значения могут незначительно отличаться в зависимости от качества бумаги и ее влажности:

Хлортетрациклин (СТЦ) | 0·60 |

Тетрациклин (ТС) | 0·40 |

Окситетрациклин (безрецептурный) | 0·20 |

4-эпи-СТС | 0·15 |

4-эпи-TC | 0·13 |

4-эпи-ОТС | 0·10 |

Антибиотическая активность «эпи» соединений меньше, чем у нормальных соединений.

Данный метод позволяет определять содержание хлортетрациклина (СТЦ), окситетрациклина (ОТЦ) и тетрациклина (ТС) в кормах, концентратах и ​​премиксах, где их содержание превышает 5 ppm. Содержание менее 5 ppm можно оценить с помощью графической интерполяции.

При содержании 50 ppm или менее образец экстрагируется разбавленным формамидом. При содержании более 50 ppm его экстрагируют смесью ацетона, воды и соляной кислоты для определения CTC и смесью метанола и соляной кислоты для определения OTC и TC.

Затем экстракты разбавляют и определяют их антибиотическую активность путем измерения диффузии CTC, OTC или TC на агаризованной среде, засеянной B. cereus. Диффузия проявляется в образовании зон ингибирования в присутствии микроорганизма. Диаметр этих зон прямо пропорционален логарифму концентрации антибиотика.

3.1 Поддержание родительского штамма

Инокулируют B. cereus в пробирку со скошенным агаром, взятым из культуральной среды (4.1), свободной от метиленового синего и борной кислоты. Инкубируйте в течение ночи при температуре около 30°C. Храните культуру в холодильнике и повторно инокулируйте ею скошенный агар каждые 14 дней.

3.2 Приготовление суспензии спор

Соберите бактерии из пробирки с наклонным агаром (3.1), используя 2–3 мл физиологического раствора (4.5). Этой суспензией засевают колбу Ру, содержащую 300 мл культуральной среды (4.1), свободной от метиленового синего и борной кислоты, с концентрацией агара 3–4 %. Инкубируйте в течение 3–5 дней при температуре 28–30 °C, затем собирайте споры в 15 мл этанола (4.6), проверив споруляцию под микроскопом, и гомогенизируйте. Эту суспензию можно хранить в холодильнике 5 и более месяцев.

Путем предварительных испытаний на чашках с основной средой для определения (4.1) определяют количество инокулята, которое при различных концентрациях используемого антибиотика даст максимально большие зоны ингибирования, которые еще остаются прозрачными. Это количество обычно составляет от 0,2 до 0,3 мл на 1000 мл. Культуральную среду инокулируют при температуре от 50 до 60 °C.

4.1 Основная среда для определения [2]

Глюкоза | 1 г |

Триптический пептон | 10 г |

Мясной экстракт | 1·5 г |

Дрожжевой экстракт | 3 г |

Агар по качеству | от 10 до 20 г |

"Твин 80" | 1 мл |

Фосфатный буферный раствор, pH 5·5 (4,2) | 10 мл |

5 % (мас./об.) раствор борной кислоты | 15 мл |

0,5 % раствор метиленового синего в этаноле | 4 мл |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Перед использованием отрегулируйте уровень pH до 5,8.

4.2 Фосфатный буферный раствор, pH 5·5

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 130·86 г |

ДиНатрий гидрофосфат Na2HPO4 · 2H2O А.Р. | 6·947 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.3 Фосфатный буферный раствор, pH 5,5, разбавленный до 1/10.

4.4 Фосфатный буферный раствор, pH 8

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 1·407 г |

ДиНатрий гидрофосфат Na2HPO4 · 2H2O А.Р. | 57·539 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.5 Стерильный физиологический раствор.

4,6 20 % (по объему) этанола.

4.7 Соляная кислота 0·1 н.

4.8 70 % (об./об.) формамида: перед использованием приготовьте свежий и доведите pH до 4,5, используя примерно 2 н. серной кислоты.

4.9 Смесь чистого ацетона/воды/соляной кислоты (d: 1·19): 65/33/2 по объему.

4.10 Смесь чистого метанола/соляной кислоты (d: 1·19): 98/2 по объему.

4.11 Стандартные вещества: СТС, ОТС, ТС, активность которых выражается в пересчете на гидрохлорид.

5.1 Хлортетрациклин

Используя соляную кислоту (4.7), приготовьте из стандартного раствора (4.11) исходный раствор с концентрацией, соответствующей 500 мкг на мл хлортетрациклин-HCl. Этот раствор можно хранить в холодильнике неделю.

Из этого исходного раствора приготовьте стандартный рабочий раствор S8 с концентрацией, соответствующей 0,2 мкг на мл хлортетрациклин-HCl. Разбавление проводят с использованием фосфатного буферного раствора pH 5·5, разбавленного до 1/10 (4,3), к которому добавлено 0,01 % амидочерни [3].

Затем приготовьте последовательными разведениями (1 + 1), используя буферный раствор (4.3), следующих концентраций:

S4 | 0·1 | мкг/мл |

S2 | 0·05 | мкг/мл |

S1 | 0·025 | мкг/мл |

5.2 Окситетрациклин

Действуя, как указано в 5.1, приготовьте из исходного раствора с концентрацией, соответствующей 400 мкг на мл окситетрациклина-HCl, стандартный рабочий раствор S8, содержащий 1,6 мкг на мл окситетрациклина-HCl, и следующих концентраций: :

S4 | 0·8 | мкг/мл |

S2 | 0·4 | мкг/мл |

S1 | 0·2 | мкг/мл |

5.3 Тетрациклин

Действуя, как указано в 5.1, приготовьте из исходного раствора с концентрацией, соответствующей 500 мкг на мл тетрациклин-HCl, стандартный рабочий раствор S8, содержащий 1,0 мкг на мл тетрациклин-HCl и следующих концентраций:

S4 | 0,5 | мкг/мл |

S2 | 0·25 | мкг/мл |

S1 | 0·125 | мкг/мл |

6.1 Содержание 50 частей на миллион или меньше

К испытуемому образцу добавляют формамид (4.8) в количествах, указанных в таблице ниже. Встряхивайте в течение 30 минут на качалке. Затем немедленно разбавляют фосфатным буферным раствором (4.3) в соответствии с указаниями, приведенными в таблице ниже, до получения концентрации U8. Концентрация формамида в этом растворе не должна превышать 40 %.

Центрифугируйте или декантируйте до получения прозрачного раствора. Затем готовят концентрации U4, U2 и U1 последовательными разведениями (1 + 1) с использованием фосфатного буферного раствора (4.3).

Антибиотик | СТС | внебиржевой | ТС |

Предполагаемое содержание в ppm | 10 | 50 | 10 | 50 | 10 | 50 |

Тестовый образец в г | 10 | 10 | 24 | 9,6 | 20 | 10 |

мл фосфатного буферного раствора (4.3) | разл. 1:5 [4] | разл. 1:25 [5] | 70 | 200 | 120 | разл. 1:5 [4] |

Концентрация U8 в мкг/мл | 0·2 | 0·2 | 1·6 | 1·6 | 1·0 | 1·0 |

6.2 Содержание более 50 частей на миллион

6.2.1 Хлортетрациклин

К испытуемому образцу массой от 2 до 10 г, в зависимости от предполагаемого содержания антибиотика в образце или гарантии его производителя, добавляют смесь в 20-кратном объеме (4.9). Встряхивайте в течение 30 минут на качалке. Во время экстракции pH должен оставаться ниже 3; при необходимости доведите pH до 3 (используя 10 % уксусную кислоту для минеральных соединений). Возьмите аликвоту экстракта и доведите pH до 5,5 с помощью фосфатного буферного раствора, pH 8 (4,4) в присутствии бромкрезолового зеленого (изменение цвета с желтого на синий). Разбавляют фосфатным буферным раствором с pH 5,5, разбавленным до 1/10 (4,3), до получения концентрации U8 (см. 6.1).

Затем готовят концентрации U4, U2 и U1 последовательными разведениями (1 + 1), используя фосфатный буферный раствор (4.3).

6.2.2 Окситетрациклин и тетрациклин

Действуйте, как указано в 6.2.1, используя смесь (4.10) вместо смеси (4.9).

7.1 Инокуляция культуральной среды

Инокулируют при температуре 50–60 °C основную среду для определения (4.1) суспензией спор (3.2).

7.2 Подготовка лотков

Диффузия на агаре проводится в лотках с использованием 4 концентраций стандартного раствора (С8, С4, С2, С1) и 4 концентраций экстракта (У8, И4, У2, У1). В каждый лоток необходимо поместить 4 концентрации экстракта и стандартного раствора.

Поэтому выбирайте лотки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее 8 отверстий диаметром от 10 до 13 мм. Рассчитайте количество инокулированной питательной среды (7.1), необходимое для обеспечения равномерного покрытия толщиной примерно 2 мм. Испытание предпочтительно проводить на лотках, состоящих из плоских стеклянных пластин, снабженных идеально ровным алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Внесите в отверстия точно отмеренные количества от 0,10 до 0,15 мл раствора антибиотика, в зависимости от диаметра отверстий.

Для каждого образца повторите диффузию не менее 4 раз для каждой концентрации, чтобы каждое определение включало оценку 32 зон ингибирования.

7.3 Инкубация

Инкубируйте лотки примерно 18 часов при температуре от 28 до 30 °C.

Измерьте диаметр зон ингибирования, желательно проекцией. Запишите результаты измерений на полулогарифмической бумаге, откладывая логарифм концентраций от диаметра зон ингибирования. Проследите линии стандартного раствора и экстракта. Если нет помех, две линии будут параллельны.

Логарифм относительной активности рассчитывается по следующей формуле:

· 0·602

У

+ Т

+ С

+ С

- У

- У

- С

- С

2

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % в относительной величине.

Этот метод позволяет определять уровни хлортетрациклина (СТЦ), окситетрациклина (ОТЦ) и тетрациклина (ТС) при концентрациях более 1 г на кг, при условии отсутствия влияния других веществ, помутняющих экстракты. Этот метод быстрее, чем диффузия на агаре.

Для определения ЦОК пробу экстрагируют смесью ацетона, воды и соляной кислоты, а для определения ОТЦ и ТС - смесью метанола и соляной кислоты.

Затем экстракты разбавляют и определяют их антибиотический эффект путем измерения светопропускания культуральной среды, в которую засевали Staphylococcus aureus и к которой был добавлен антибиотик. Светопропускание зависит от концентрации антибиотика.

3.1 Поддержание родительского штамма

Инокулируют S. aureus в пробирку со скошенным агаром, взятым из культуральной среды (4.1), в которую добавлено от 1,5 до 3 % агара (в зависимости от качества). Инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Храните культуру в холодильнике и повторно инокулируйте ею скошенный агар каждые 4 недели. В то же время подготовьте субкультуры для лабораторного использования.

3.2 Приготовление инокулята

За 24 часа до использования повторно инокулируйте наклонный агар субкультурой и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Всю культуру, содержащуюся в пробирке с агаром, суспендируют примерно в 2 мл основной среды (4.1), затем в стерильных условиях переносят суспензию примерно в 100 мл той же основной среды (4.1). Инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C до тех пор, пока рост штамма не войдет в логарифмическую фазу (от 1 часа 30 минут до 2 часов).

4.1 Основная среда для определения [7]

Пептон | 5 г |

Дрожжевой экстракт | 1·5 г |

Мясной экстракт | 1·5 г |

Хлорид натрия | 3·5 г |

Глюкоза | 1·0 г |

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 1·32 г |

ди Гидрофосфат калия K2HPO4 А.Р. | 3·68 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

РН после стерилизации: от 6,8 до 7,0.

4.2 Фосфатный буферный раствор, pH 4,5

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 13·6 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.3 Соляная кислота 0·1 н.

4.4 Смесь чистого ацетона/воды/соляной кислоты (d: 1·19): 65/33/2 по объему.

4.5 Смесь чистого метанола/соляной кислоты (d: 1·19): 98/2 по объему.

4.6 Примерно 10 % (мас./об.) раствор формальдегида.

4.7 Стандартные вещества: СТС, ОТС, ТС, активность которых выражается в пересчете на гидрохлорид.

Используя соляную кислоту (4.3), приготовьте из стандартного вещества (4.7) исходный раствор с концентрацией, соответствующей 400–500 мкг на мл CTC-HCl, OTC-HCl или TC-HCl. Этот раствор можно хранить в холодильнике неделю.

6.1 Хлортетрациклин

Поместите тестируемый образец массой 1–2 г в градуированную колбу емкостью 200 или 250 мл. Добавьте примерно 100 мл смеси (4.4) и встряхивайте на качалке в течение 30 минут. Доведите объем фосфатным буферным раствором, pH 4,5 (4,2). Гомогенизируйте и дайте отстояться.

6.2 Окситетрациклин и тетрациклин

Поместите тестируемый образец массой 1–2 г в градуированную колбу емкостью 200 или 250 мл. Добавьте примерно 100 мл смеси (4,5) и встряхивайте на качалке в течение 30 минут. Доведите объем фосфатным буферным раствором, pH 4,5 (4,2). Гомогенизируйте и дайте отстояться.

7.1 Приготовление стандартной серии и экстракта

Разбавьте стандартный раствор (5) и экстракт (6) фосфатным буферным раствором, pH 4,5 (4,2), чтобы получить серию концентраций. Для каждого определения строится калибровочная кривая для соответствующей концентрации, позволяющая интерполировать по меньшей мере два значения, относящиеся к экстракту. Разведения следует выбирать в соответствии с условиями выращивания штамма, которые могут различаться в разных лабораториях. Обычно процедура следующая:

7.1.1 Хлортетрациклин

Разбавьте стандартный раствор (5) фосфатным буферным раствором (4.2) для получения стандартного рабочего раствора с концентрацией, соответствующей 0,2 мкг на мл CTC-HCl. Затем, используя фосфатный буферный раствор (4.2), готовят в пробирках, как указано ниже, 6 разведений, каждое разведение в двух экземплярах.

мл стандартного рабочего раствора | мл фосфатного буферного раствора (4.2) | Концентрация CTC-HCl (мкг/мл) |

0·7 | 0·3 | 0·14 |

0·6 | 0·4 | 0·12 |

0·55 | 0·45 | 0·11 |

0·45 | 0·55 | 0·09 |

0·4 | 0·6 | 0·08 |

0·3 | 0·7 | 0·06 |

Разбавьте экстракт (6.1) фосфатным буферным раствором (4.2) до получения предполагаемой концентрации CTC-HCl 0,12 мкг на мл. Поместите по 1 мл этого раствора в каждую из 2 пробирок и по 0,75 мл (—0,09 мкг) в каждую из 2 других пробирок. Доведите объем последних двух пробирок до 1 мл фосфатным буферным раствором (4.2).

7.1.2 Окситетрациклин и тетрациклин

Разбавьте стандартный раствор (5) фосфатным буферным раствором (4.2) для получения стандартного рабочего раствора с концентрацией, соответствующей 0,6 мкг на мл OTC-HCl или TC-HCl. Затем, используя фосфатный буферный раствор (4.2), готовят в пробирках, как указано ниже, 7 разведений, каждое разведение в двух экземплярах.

мл стандартного рабочего раствора | мл фосфатного буферного раствора (4.2) | Концентрация OTC-HCl или TC-HCl (мкг/мл) |

0·9 | 0·1 | 0·54 |

0·8 | 0·2 | 0·48 |

0·7 | 0·3 | 0·42 |

0·6 | 0·4 | 0·36 |

0·4 | 0·6 | 0·24 |

0·3 | 0·7 | 0·18 |

0·2 | 0·8 | 0·12 |

Разбавьте экстракт (6.2) фосфатным буферным раствором (4.2) до получения предполагаемой концентрации OTC-HCl или TC-HCl 0,48 мкг на мл. Поместите по 1 мл этого раствора в каждую из 2 пробирок и по 0,5 мл (= 0,24 мкг) в каждую из 2 других пробирок. Доводит объем последних двух пробирок до 1 мл с помощью фосфатного буферного раствора (4.2).

7.2 Инокуляция культуральной среды

Инокулируют базовую среду для определения (4.1) инокулятом (3.2) для получения с помощью фотометра при длине волны 590 нм 85 % светопропускания в ячейке 5 см или 92 % пропускания в ячейке 2 см, аппаратура настроена. при 100 % передаче на незасеянной базовой среде (4.1).

7.3 Раздача

Поместите по 9 мл инокулированной культуральной среды (7.2) в каждую пробирку (7.1.1 или 7.1.2). Пробирки должны заполняться в чистых, но не обязательно стерильных условиях.

7.4 Инкубация

Инкубация должна проводиться на водяной бане, температура которой поддерживается постоянной на уровне 37 °C ± 0,1 °C путем перемешивания. Выбранный инкубационный период (обычно от 2 часов 30 минут до 3 часов) должен быть таким, чтобы можно было проследить кривые передачи с градиентами, подходящими для точного измерения. Затем заблокируйте дальнейший рост, быстро введя в каждую пробирку по 1 мл раствора формальдегида (4.6).

7.5 Измерение роста

Измерьте пропускание фотометром при длине волны 590 нм, установив прибор на 100 % пропускание для самого прозрачного стандартного раствора (соответствующего самому высокому содержанию антибиотика). Поскольку в разных пробирках будет наблюдаться небольшая разница в мутности, следует использовать клетки не менее 2 см, а лучше 5 см.

Нарисуйте калибровочную кривую на миллиметровой бумаге, построив график зависимости фотометрического пропускания от концентрации антибиотика. Интерполируйте на кривой значения передачи экстракта. Рассчитайте содержание антибиотика в образце.

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % в относительной величине.

— путем диффузии на агар —

Данный метод позволяет даже в присутствии тетрациклинов определять содержание олеандомицина в кормах, концентратах и ​​премиксах, где их содержание превышает 0,5 ppm.

Образец экстрагируют разбавленным метанольным раствором три(гидроксиметиламино)метана. После центрифугирования экстракт разбавляют и определяют его антибиотическую активность путем измерения диффузии олеандомицина на агаризованной среде, засеянной B. cereus. Диффузия проявляется в образовании зон ингибирования в присутствии микроорганизма. Диаметр этих зон прямо пропорционален логарифму концентрации антибиотика.

3.1 Поддержание родительского штамма

Инокулируют B. cereus в пробирку со скошенным агаром, взятым из культуральной среды (4.1), в которую было добавлено 100 мкг на 5 мл окситетрациклина. Инкубируйте в течение ночи при температуре около 30 °C. Храните культуру в холодильнике и повторно инокулируйте ею скошенный агар каждые 4 недели.

3.2 Приготовление суспензии спор

Соберите бактерии из пробирки с наклонным агаром (3.1), используя примерно 3 мл физиологического раствора (4.3). Эту суспензию засеивают в колбу Ру, содержащую 300 мл культуральной среды (4.1), концентрация агара которой составляет 3–4 %. Инкубируйте в течение 3–5 дней при температуре 28–30 °С, затем собирайте споры в 15 мл этанола (4.4) после проверки спорообразования под микроскопом и гомогенизируйте. Эту суспензию можно хранить в холодильнике 5 и более месяцев.

Путем предварительных испытаний на чашках с основной средой для определения (4.2) определяют количество инокулята, которое при различных концентрациях используемого олеандомицина даст максимально большие зоны ингибирования, которые еще остаются прозрачными. Это количество обычно составляет от 0,1 до 0,2 мл на 1000 мл. Культуральную среду инокулируют при температуре 60°C.

4.1 Среда для поддержания родительского штамма [9]

Глюкоза | 1 г |

Триптический пептон | 10 г |

Мясной экстракт | 1·5 г |

Дрожжевой экстракт | 3 г |

Агар по качеству | от 10 до 20 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Непосредственно перед использованием отрегулируйте pH до 6,5.

4.2 Основная среда для определения [10]

Среда (4.1) доведена до pH 8·8.

4.3 Стерильный физиологический раствор.

4,4 20 % (по объему) этанола.

4.5 Чистый метанол.

4,6 0,5 % (мас./об.) раствор три(гидроксиметиламино)метана А.Р.

4.7 Решение для экстракции

Чистый метанол | 50 мл |

Дистиллированная вода | 50 мл |

Три(гидроксиметиламино)метан А.Р. | 0,5 г |

4.8 Стандартное вещество: олеандомицин известной активности.

Растворите часть стандартного вещества (4.8) в 5 мл метанола (4.5) и разбавьте раствором (4.6) до получения концентрации олеандомицина 100 мкг на мл.

Из этого исходного раствора приготовьте стандартный рабочий раствор S8, содержащий 0,1 мкг/мл олеандомицина, путем разбавления раствором (4.6). Затем приготовьте последовательными разведениями (1+1), используя раствор (4.6), следующих концентраций:

S4 | 0,05 мкг/мл |

S2 | 0·025 мкг/мл |

S1 | 0·0125 мкг/мл |

Отберите пробу массой от 2 до 10 г, в зависимости от предполагаемого содержания олеандомицина в пробе, добавьте 100 мл раствора (4.7) и встряхивайте в течение 30 минут на качалке.

Центрифугируйте, отберите аликвоту экстракта и разбавьте раствором (4.6) до получения предполагаемой концентрации олеандомицина 0,1 мкг на мл (= U8). Затем приготовьте концентрации U4, U2 и U1 последовательными разведениями (1 + 1), используя раствор (4.6).

7.1 Инокуляция культуральной среды

Инокулируют при 60 °C базовую среду для определения (4.2) суспензией спор (3.2).

7.2 Подготовка лотков

Диффузия на агаре проводится в лотках с использованием 4 концентраций стандартного раствора (С8, С4, С2, С1) и четырех концентраций экстракта (У8, И4, У2, У1). В каждый лоток необходимо поместить 4 концентрации стандартного раствора и экстракта.

Поэтому выбирайте лотки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее 8 отверстий диаметром от 10 до 13 мм. Рассчитайте количество инокулированной питательной среды (7.1), необходимое для обеспечения равномерного покрытия толщиной примерно 2 мм. Испытание предпочтительно проводить на лотках, состоящих из плоских стеклянных пластин, снабженных идеально ровным алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Внесите в отверстия точно отмеренные количества от 0,10 до 0,15 мл раствора антибиотика, в зависимости от диаметра отверстий.

Для каждого образца повторите диффузию не менее 4 раз для каждой концентрации, чтобы каждое определение включало оценку 32 зон ингибирования.

7.3 Инкубация

Инкубируйте лотки примерно 18 часов при температуре от 28 до 30 °C.

Измерьте диаметр зон ингибирования, желательно проекцией. Запишите результаты измерений на полулогарифмической бумаге, откладывая логарифм концентраций от диаметра зон ингибирования. Проследите линии стандартного раствора и экстракта. Если нет помех, две линии будут параллельны.

Логарифм относительной активности рассчитывается по следующей формуле:

· 0·602

У

+ Т

+ С

+ С

- У

- У

- С

- С

2

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % по относительной величине.

— путем диффузии на агар —

Данный метод позволяет определять содержание тилозина в кормах, концентратах и ​​премиксах, где его содержание превышает 2 ppm.

Образец обрабатывают фосфатным буферным раствором с pH 8, предварительно нагретым до 80 °C, а затем экстрагируют метанолом. После центрифугирования экстракт разбавляют и определяют его антибиотическую активность путем измерения диффузии тилозина на агаризованной среде, засеянной Sarcina lutea. Диффузия проявляется в образовании зон ингибирования в присутствии микроорганизма. Диаметр этих зон прямо пропорционален логарифму концентрации антибиотика.

3.1 Поддержание родительского штамма

Инокулируют Sarcina lutea в пробирку с наклонным агаром, взятым из культуральной среды (4.1), доводят pH до 7·0. Инкубируйте в течение ночи при температуре около 35 °C. Храните культуру в холодильнике и каждый месяц повторно инокулируйте ею скошенный агар.

3.2 Приготовление суспензии бактерий

Соберите бактерии из недавно приготовленной пробирки с наклонным агаром (3.1), используя 2–3 мл физиологического раствора (4.4). Эту суспензию засевают в колбу Ру, содержащую 250 мл культуральной среды (4.1), доведенной до pH 7·0. Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 35 °С, затем собирайте бактерии в 25 мл физиологического раствора (4.4). Гомогенизируйте и разбавьте эту суспензию, чтобы получить примерно 75 % светопропускания при длине волны 650 нм.

При хранении в холодильнике суспензию можно использовать в течение одной недели.

Путем предварительных испытаний на чашках с основной средой для определения (4.1) определяют количество инокулята, которое при различных концентрациях используемого тилозина даст максимально большие зоны ингибирования, которые еще остаются прозрачными. Культуральную среду инокулируют при температуре от 48 до 50 °C.

4.1 Основная среда для определения [11]

Глюкоза | 1 г |

Триптический пептон | 10 г |

Мясной экстракт | 1·5 г |

Дрожжевой экстракт | 3 г |

Агар по качеству | от 10 до 20 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Непосредственно перед использованием доведите pH до 7,0 для поддержания исходного штамма и приготовления суспензии бактерий и до pH 8,0 для определения.

4.2 Фосфатный буферный раствор, pH 8

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 0·523 г |

Дикалий гидрофосфат K2HPO4 А.Р. | 16·730 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.3 Фосфатный буферный раствор, pH 7

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 5·5 г |

ди Гидрофосфат калия K2HPO4 А.Р. | 13·6 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.4 Стерильный физиологический раствор.

4.5 Чистый метанол.

4,6 40 % (об./об.) метанола.

4.7 Смесь фосфатного буферного раствора (4.2)/чистого метанола: 60/40 по объему.

4.8 Стандартное вещество: тилозин известной активности.

Стандартное вещество (4.8) высушивают в течение 3 часов при температуре 60 °С в вакуумной печи (5 мм рт. ст.). Взвесьте от 10 до 50 мг в мерную колбу, растворите в 5 мл метанола (4,5) и разбавьте раствор фосфатным буферным раствором, pH 7 (4,3), до получения концентрации тилозина-основания 1000 мкг на мл. /п>

Из этого исходного раствора приготовьте стандартный рабочий раствор S8, содержащий 2 мкг на мл основания тилозина, путем разбавления смесью (4.7).

Затем приготовьте последовательными разведениями (1 + 1), используя смесь (4.7), следующих концентраций:

S4 | 1 мкг/мл |

S2 | 0,5 мкг/мл |

S1 | 0·25 мкг/мл |

Для концентратов возьмите тестовую пробу массой 10 г; для премиксов и кормов - проба массой 20 г. Добавьте 60 мл фосфатного буферного раствора, pH 8 (4,2), предварительно нагретого до 80 °C, и гомогенизируйте в течение 2 минут (бытовой миксер, Ultra-turrax и т. д.).

Оставить на 10 минут, добавить 40 мл метанола (4,5) и гомогенизировать 5 минут. Центрифугируйте экстракт и разбавьте аликвоту смесью (4.7) до получения предполагаемой концентрации тилозина 2 мкг на мл (= U8). Затем готовят концентрации U4, U2 и U1 последовательными разведениями (1+1), используя смесь (4.7).

При содержании менее 10 ppm экстракт выпаривают досуха в ротационном испарителе при 35 °C и растворяют остаток в 40 % метаноле (4.6).

7.1 Инокуляция культуральной среды

Инокулируют при температуре от 48 до 50 °C основную среду для определения (4.1), доводят pH до 8·0 суспензией бактерий (3.2).

7.2 Подготовка лотков

Диффузия на агаре проводится в лотках с использованием 4 концентраций стандартного раствора (С8, С4, С2, С1) и 4 концентраций экстракта (У8, И4, У2, У1). В каждый лоток необходимо поместить 4 концентрации стандартного раствора и экстракта.

Поэтому выбирайте лотки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее 8 отверстий диаметром от 10 до 13 мм. Рассчитайте количество инокулированной питательной среды (7.1), необходимое для обеспечения равномерного покрытия толщиной примерно 2 мм. Испытание предпочтительно проводить на плоских подносах, состоящих из стеклянных пластин, заполненных идеально ровным алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Внесите в отверстия точно отмеренные количества от 0,10 до 0,15 мл раствора антибиотика, в зависимости от диаметра отверстий.

Для каждого образца повторите диффузию не менее 4 раз для каждой концентрации, чтобы каждое определение включало оценку 32 зон ингибирования.

7.3 Инкубация

Инкубируйте лотки в течение ночи при температуре от 35 до 37 °C.

Измерьте диаметр зон ингибирования, желательно проекцией. Запишите результаты измерений на полулогарифмической бумаге, откладывая логарифм концентраций от диаметра зон ингибирования. Проследите линии стандартного раствора и экстракта. При условии отсутствия помех две линии будут параллельны.

Логарифм относительной активности рассчитывается по следующей формуле:

· 0·602

У

+ Т

+ С

+ С

- У

- У

- С

- С

2

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % по относительной величине.

— путем диффузии на агар —

Данный метод позволяет определять содержание вирджиниамицина в кормах, концентратах и ​​премиксах, где его содержание превышает 2 ppm.

Проба экстрагируется метанольным раствором «Твин 80». После центрифугирования или фильтрации экстракт разбавляют и определяют его антибиотическую активность путем измерения диффузии вирджиниамицина на агаризованной среде, засеянной Sarcina lutea. Диффузия проявляется в образовании зон ингибирования в присутствии микроорганизма. Диаметр этих зон прямо пропорционален логарифму концентрации антибиотика.

3.1 Поддержание родительского штамма

Инокулируют S. Lutea в пробирку со скошенным агаром, взятым из культуральной среды (4.1). Инкубируйте в течение ночи при температуре около 35 °C. Храните культуру в холодильнике и повторно инокулируйте ею скошенный агар каждые 14 дней.

3.2 Приготовление суспензии бактерий

Соберите бактерии из недавно приготовленной пробирки с наклонным агаром (3.1), используя 2–3 мл физиологического раствора (4.3). Этой суспензией засевают колбу Ру, содержащую 250 мл культуральной среды (4.1). Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 35 °С, затем собирайте бактерии в 25 мл физиологического раствора (4.3). Гомогенизируйте и разбавьте эту суспензию, чтобы получить примерно 75% светопропускания при 650 нм. При хранении в холодильнике суспензию можно использовать в течение одной недели.

Путем предварительных испытаний на чашках с основной средой для определения (4.1) определяют количество инокулята, которое при различных используемых концентрациях вирджиниамицина даст максимально большие зоны ингибирования, которые еще остаются прозрачными. Культуральную среду инокулируют при температуре от 48 до 50 °C.

4.1 Основная среда для определения [12]

Глюкоза | 1 г |

Триптический пептон | 10 г |

Экстракт шрота | 1·5 г |

Дрожжевой экстракт | 3 г |

Агар по качеству | от 10 до 20 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

Перед использованием отрегулируйте pH до 6,5.

4.2 Фосфатный буферный раствор, pH 6

Калий дигидрофосфат KH2PO4 А.Р. | 8·0 г |

Дикалий гидрофосфат K2HPO4 А.Р. | 2·0 г |

Дистиллированная вода | 1000 мл |

4.3 Стерильный физиологический раствор.

4.4 Чистый метанол.

4.5 Смесь фосфатного буферного раствора (4.2)/чистого метанола: 80/20 по объему.

4,6 0,5 % (мас./об.) метанольный раствор «Твин 80».

4.7 Стандартное вещество: вирджиниамицин известной активности.

Приготовьте метанольный раствор стандартного вещества (4.7), содержащий 800 мкг/мл вирджиниамицина. Из этого исходного раствора готовят стандартный рабочий раствор S8, содержащий 1 мкг/мл вирджиниамицина, путем разбавления смесью (4.5). Затем приготовьте последовательными разведениями (1+1), используя смесь (4.5), следующих концентраций:

S4 | 0,5 мкг/мл |

S2 | 0·25 мкг/мл |

S1 | 0·125 мкг/мл |

6.1 Продукты с содержанием вирджиниамицина 50 ppm или менее

Отбирают пробу массой от 10 до 20 г, добавляют 100 мл раствора (4.6) и встряхивают в течение 30 минут на качалке. Отцентрифугируйте или отфильтруйте, отберите 20 мл прозрачного раствора и выпарите досуха в ротационном испарителе. Растворяют остаток в 20 мл или более смеси (4.5) до получения предполагаемой концентрации вирджиниамицина 1 мкг на мл (= U8). Затем готовят концентрации U4, U2 и U1 последовательными разведениями (1+1), используя смесь (4.5).

6.2 Продукты с содержанием вирджиниамицина более 50 ppm

Отбирают пробу массой от 1 до 10 г, добавляют 100 мл раствора (4.6) и встряхивают в течение 30 минут на качалке. Центрифугируйте или фильтруйте, затем разбавьте смесью (4.5) до получения предполагаемой концентрации вирджиниамицина 1 мкг на мл (= U8). Затем подготовьте концентрации U4, U2 и U1, как указано в 6.1.

7.1 Инокуляция культуральной среды

В основную среду для определения (4.1) при температуре от 48 до 50 °C инокулируют суспензию бактерий (3.2).

7.2 Подготовка лотков

Диффузия на агаре проводится в лотках с использованием 4 концентраций стандартного раствора (С8, С4, С2, С1) и 4 концентраций экстракта (У8, И4, У2, У1). В каждый лоток необходимо поместить 4 концентрации стандартного раствора и экстракта.

Поэтому выбирайте лотки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее 8 отверстий диаметром от 10 до 13 мм. Рассчитайте количество инокулированной питательной среды (7.1), необходимое для обеспечения равномерного покрытия толщиной примерно 2 мм. Испытание предпочтительно проводить на плоских подносах, состоящих из стеклянных пластин, снабженных идеально ровным алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Внесите в отверстия точно отмеренные количества от 0,10 до 0,15 мл раствора антибиотика, в зависимости от диаметра отверстий.

Для каждого образца повторите диффузию не менее 4 раз для каждой концентрации, чтобы каждое определение включало оценку 32 зон ингибирования.

7.3 Инкубация

Инкубируйте лотки примерно 18 часов при температуре от 28 до 30 °C.

Измерьте диаметр зон ингибирования, желательно проекцией. Запишите результаты измерений на полулогарифмической бумаге, откладывая логарифм концентраций от диаметра зон ингибирования. Проследите линии стандартного раствора и экстракта. Если нет помех, две линии будут параллельны.

Логарифм относительной активности рассчитывается по следующей формуле:

· 0·602

У

+ Т

+ С

+ С

- У

- У

- С

- С

2

Реальная активность = предполагаемая активность × относительная активность.

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 10 % по относительной величине.

[1] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

[2] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую такие же результаты.

[3] Амидочерный используется для выделения зон ингибирования стандартных растворов (синие кольца).

[4] Возьмите 20 мл экстракта и доведите до 100 мл в градуированной колбе с буферным раствором.

[5] Возьмите 4 мл экстракта и доведите до 100 мл в градуированной колбе с буферным раствором.

[6] Этот штамм, выделенный LUFA в Киле, растет быстрее, чем S. aureus ATCC 6538 P.

[7] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

[8] Штамм, выделенный LUFA в Киле.

[9] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

[10] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

[11] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты

[12] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

----------------------------------------------- ---